Wir danken Kristin Johnson für die grafische Arbeit.

Alle Protokolle mit Tieren sind, die von der Institutional Animal Care und Use Committee im Kinderkrankenhaus Boston vorgestellt und genehmigt und werden in Übereinstimmung mit den Empfehlungen der Gesellschaft für Evaluierung und Akkreditierung von Labortierpflege (AAALAC) durchgeführt. Achten Sie darauf, sterile Instrumente und aseptischen techniqure verwenden, während der Durchführung des Verfahrens. 1. Herstellung der Pellets <ol><li> Wiegen Sie 10 mg von Sucralfat und 60 mg hydron mit der sterilen ungebeugt Spachtel. In getrennten Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Setzen Sie eine 1 cm quadratisches Stück von Mesh in eine sterile 10 cm Schüssel. Invertieren, so Netz ruht auf flachen Deckel. Beiseite stellen. </li><li> Fügen Sie 500 ul Ethanol zum hydron und Wirbel für mindestens 10 min. </li><li> Die entsprechende Menge von Wachstumsfaktor-(Standard: 20 ug für bFGF, 50 ug für VEGF) mit dem Sucralfat und kurz vortexen. Shop-Wachstumsfaktor in eine-80 ° C-Tiefkühler bei einer Konzentration von 1 mg / ml. Flüssigkeitsvolumen zugegeben wird, sollte ein Minimum von 20 ul, die Sucralfat vollständig benetzt zu gewährleisten, sollte jedoch 50 ul betragen. Größeres Volumen macht die Verdampfung der Flüssigkeit im nächsten Schritt schwierig. </li><li> Legen Sie die Mischung in die Sucralfat Zentrifugalverdampfer auf niedrig eingestellt, bis die Mischung vollständig trocken ist, normalerweise 30-50 min je nach dem Volumen der Flüssigkeit verwendet. <ol><li> Überprüfen Sie die Mischung für Restfeuchte mit der konischen Ende eines sterilen Spatel. Die Mischung sollte &quot;knackig&quot; zu fühlen. </li></ol></li><li> Verwenden Sie das verjüngte Ende des Spachtel, um in der Röhre brechen die Sucralfat Mischung. </li><li> Werden 10 ul der zu Hydron Sucralfat. <ol><li> Aufgrund der Natur der viskosen hydron, schneiden Sie das Ende von einem 200 ul Pipettenspitze und zeichnen Sie dann und lassen Sie die 10 ul vor dem Pipettieren wieder und Ergänzung Sucralfat. </li></ol></li><li> Verwenden schnell gebogen spuckteula, die hydron und Sucralfat mischen und aus dem Rohr zu entfernen. <ol><li> Sammeln Sie die Mischung entlang der Unterseite der Spitze des gebogenen Spatel und dann durch Drehen des Rohres beim Zeichnen der Spatel entlang der Wand des Rohres. Die Mischung wird rasch trocknen, so muss dieser Schritt effizient durchgeführt werden. </li></ol></li><li> Verbreiten Sie die Mischung auf die vorbereitete Mesh mit einer Pinzette, um sie in Position zu halten. Die Mischung sollte eine gleichmäßige Schicht zu füllen und in die Löcher des Netzes. </li><li> Tauchen Sie den gebogenen Spatel in das Röhrchen mit hydron und verwenden Sie es Mantel beide Seiten des Netzes. </li><li> Das beschichtete Gitter stützte sich auf Seite gegen Rand der Schale und trocknen bei RT für 30-45 min. </li><li> Legen Sie das Netz in -20 ° C Gefrierschrank oder gehen Sie sofort zum nächsten Schritt. Halten Sie Netz-Innenschale. </li><li> Legen Sie die 35-mm-Schale im Inneren der größeren Petrischale, Deckel ab. Verwenden Sie die Zange, um die Fasern des Netzes auseinander über die 35-mm-Schale vorsichtig abziehen. Streu Pellets cein von der größeren Schüssel am Ende gesammelt werden. <ol><li> Überprüfen Pellets für Einheitlichkeit unter Rahmen. Das Verfahren ergibt ca. 250 Pellets somit die Standarddosis pro Pellet für bFGF und VEGF 80 ng und 200 ng auf. </li></ol></li><li> Speicher Pellets in 35 mm-Schale in 20 ° C-Gefrierschrank für 3 Monate. </li></ol> 2. Chirurgische Implantation von Pellets <ol><li> Einrichtung eines OP-Bereich unter Operationsmikroskop. </li><li> Betäuben die Maus mit Avertin (400-500 mg / kg, intraperitoneal) und positionieren Sie die Maus unter dem Mikroskop, so Auge sichtbar ist. Führen toe Prise ausreichende Anästhesie zu gewährleisten. </li><li> Betäuben die Maus Auge, indem 1 Tropfen Proparacain Lösung oben auf Augapfels. Warten Sie 20-30 Sekunden und tupfen mit einem Gaze-Pad. </li><li> Proptose die Maus mit dem Auge abgestumpft # 1 Juweliere Zange sicher zu sein, um die Haut zwischen Pinzette und Augen verlassen. Es ist wichtig, den Druck korrekt angewendet beurteilen.60; Halten Sie die Augen zu fest wird dazu führen, dass rot und gereizt zu werden, während eine zu locker halten können, um während der Operation Auge zu bewegen. </li><li> Verwenden Sie die 30 ° microknife um einen Einschnitt in die Hornhaut zu etwa 1 mm vom Limbus. Der Schnitt sollte 1-2 mm lang sein. Einschnitt sollte tief genug sein, um über die Epithelschicht in midstroma eindringen, aber nicht so tief, um das Auge, bersten. </li><li> Verwenden Sie die von Graef Messer, um eine Tasche senkrecht zur Schnittführung machen. <ol><li> Schieben Sie das Messer unter der Hornhautschicht an der Einschnittstelle und sanft arbeiten Messer in und es entlang der Schnitt, um den Raum zu vergrößern, wodurch die Tasche entsteht. Es hilft, um die Maus zu bewegen und in der Lage sein, um mit der Krümmung des Auges zu arbeiten. Achten Sie darauf, mit der Spitze nach unten zu drücken, um zu vermeiden, Aufbrechen des Auges. </li></ol></li><li> Befeuchten Sie die Zange # 5 Juwelier mit Proparacain und wählen Sie ein Pellet aus Schale. Legen Sie ein Pellet auf dem Auge. </li&gt; <li> Befeuchten Sie die von Graef Messer mit Proparacain und übertragen einige der Flüssigkeit auf Pellet es gummiartig und biegsam zu machen. Überschüssige Feuchtigkeit mit Gaze oder einem Wattestäbchen. </li><li> Legen Sie die Tablette in die Tasche mit dem von Graef Messer, um es im Inneren der Hornhaut unter Schicht schieben. Sobald die gesamte Pellet drinnen ist, führen Sie die flache Seite von Graef Messer über Website, um zu überprüfen, dass das Pellet sicher ist. </li><li> Mantel das Auge mit Dreifach-antibiotische Salbe. </li><li> Drehen Sie die Maus um und wiederholen Chirurgie in der entgegengesetzten Auge. </li></ol> 3. Quantifizierung der Hornhaut-Neovaskularisation. Tiere verlassen auf Schiffe über einen festgelegten Zeitraum zu entwickeln. Der Tag des Schiffes Einstufung hängt von Wachstumsfaktor verwendet. Grade bFGF an Tag 5 und dem schwächeren VEGF am Tag 6 Der Tag der Implantation ist Tag 0. <ol><li> Betäuben die Maus mit Avertin (400-500 mg / kg, intraperitoneal). </li><li> Verwenden Sie das Spaltlampenmikroskop für grading. Ein Augen hat ein Fadenkreuz, Linien innerhalb des Okulars als Messhilfe verwendet werden, um Gefäßlänge und der Abstand um den Umfang des Auges, die die Gefäße gekeimt quantifizieren. <ol><li> Halten Sie die Maus vor der Umfang, die Positionierung der Maus so Auge in Auge mit Pellet direkt vor gesehen. Stabilisieren Sie den Kopf zwischen Daumen und Zeigefinger so Haut auf Gesicht gestrafft und Auge leicht proptosed. </li></ol></li><li> Platzieren der y-Achse des Fadenkreuzes auf dem Limbus Behälter direkt unterhalb Pellets. Messen Sie die Länge der Schiffe Verzweigung nach oben in Richtung Pellets. Notieren Sie sich diese Messung in Zehntel Millimetern und bezeichnen Gefäßlänge (VL) (Abbildung 1A). </li><li> Schalten Sie entweder die Maus oder die Zielmarke, so dass der Abstand rund um das Auge, dass diese Schiffe haben gekeimt klar wird. Am einfachsten ist es des Auges als Zifferblatt mit Abständen von 1 bis 12 designierten denke diese Zahl vollen Stunde (CH) (Abbildung 1B). Es kann eine ganze Zahl oder Bruchteile von 0,25 (Beispiel 2, 2,25, 2,5 oder 2,75) sein. Hinweis: CH ist subjektiv. Zum Beispiel können einige den Abstand um das Auge zu messen, um alle Schiffe aus dem Limbus gekeimt, während andere möglicherweise nicht messen an dem Punkt, wo Schiffslänge ist die Hälfte der maximalen gehören. Wichtig ist, stimmt mit der man beschließt, Klasse zu sein. </li></ol><img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51375/51375fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51375/51375fig1.jpg" /> Abbildung 1. Die Quantifizierung der Hornhautgefäßneubildung. (A) 80 ng bFGF-Pellet in C57BL / 6J Maus zeigt Spaltlampe Fadenkreuz ausgerichtet, um Schiffslänge messen implantiert. VL = 0,9 mm. (B) Gleiche Auge zeigt Spaltlampe Fadenkreuz gedreht, um vollen Stunde messen. CH = 3.25. Berechnet Gefäßfläche = 1,84 mm 2. Diese Bilder wurden digital erhöht, um für die Zugabe von Fadenkreuz schematische ermöglichen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51375/51375fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <ol start="5"><li> Berechnen Sie die Gefäßfläche (VA) mit Hilfe der folgenden Formel, die auf dem Gebiet eines ovalen basiert (Anmerkung, ist es hilfreich, dies bei der Einstufung zu halten.) In Millimetern im Quadrat Express VA. Die Formel ist wie folgt: Schiffslänge x 0,2 x Uhrzeit-π = Fahrzeug-Bereich </li></ol>

<ol>
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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+response+of+FGF-2+for+lymphangiogenesis.">Dose-dependent response of FGF-2 for lymphangiogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (32), 11658-11663 (2004).</li><li>Udagawa, T., Birsner, A. E., Wood, M., D'Amato, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+suppression+of+angiogenesis+following+radiation+exposure+is+independent+of+hematopoietic+reconstitution.">Chronic suppression of angiogenesis following radiation exposure is independent of hematopoietic reconstitution.</a> Cancer Res. 67 (5), 2040-2045 (2007).</li><li>Turner, P. V., Albassam, M. 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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Es gibt mehrere wichtige Schritte bei der Durchführung einer erfolgreichen Hornhauttest. Die erste ist es, einheitliche Pellets geeignet ist, eingepflanzt und anregende Gefäße. Die wichtigsten Teile des Pelletzubereitung sind: 1) unter Verwendung von trägerfreien Wachstumsfaktor; 2) die Sicherstellung einer guten Mischung aus Wachstumsfaktor mit dem Sucralfat und hydron und 3), die sich die endgültige Mischung zügig, aber sorgfältig von der Eppendorf-Röhrchen auf das Netz, wo die Pellets gegossen werden. Es wird...

Der Prozess der Angiogenese, die Bildung neuer Blutgefäße zu bilden, auffindbar sind, ist sehr komplex und wird durch verschiedene endogene Faktoren, die verschiedene Schritte des Schiffes Keimen und Morphogenese Steuerung geregelt. Angiogenese aufgrund einer Verschiebung im Gleichgewicht zwischen pro-und anti-angiogene Faktoren, die das Gleichgewicht hält normalerweise das Gefßsystem in einem Ruhezustand ausgelöst. Angiogenese beim Erwachsenen kommt in bestimmten physiologischen Bedingungen wie bei der weiblichen ovariellen Zyklus oder Reparaturprozessen wie der Wundheilung und Geweberegeneration. Es ist jedoch auch ein Markenzeichen von mehreren Krankheiten, einschließlich Malignitäten, Autoimmunerkrankungen und entzündlichen Erkrankungen. Die Beteiligung von Angiogenese in diesen physiologischen und pathologischen Bedingungen ist es ein wichtiges Thema für Forschung und ein attraktives Ziel für die Therapie. Aufgrund der Komplexität der Angiogenese und der Beteiligung mehrerer ceLLS und Faktoren in dem Verfahren, einschließlich Endothelzellen, Perizyten, zirkulierenden Zellen und Stromazellen in vitro-Modellen beschränkt bleiben und die einzigartige Mikroumgebung in vivo nicht zu wiederholen. Der Haupt in-vitro-Assays der Angiogenese sind weitgehend auf die Beobachtung direkte Auswirkungen auf Endothelzellen und Messen bestimmter Schritte in angiogenen Prozess unter kontrollierten Bedingungen konzentriert. Diese Assays umfassen die Quantifizierung der Endothelzellproliferation 1, Migration 2, Netzwerkbildung 3, 4 und Schlauchbildung Keime aus Sphäroiden. 5 Ex-vivo-Modellen, im Gegensatz zu den in vitro diejenigen, sind komplexer und enthalten mehrere Gewebezelltypen, wobei ein Beispiel die Aorten-Ring-Test 6. Dennoch, wie andere Systeme, kann es nicht den Beitrag von zirkulierenden Zellen und natürliche Stroma von Endothelzellen zu erfassen, wie in vivo existiert. VersucheAngiogenese unter Strömungs untersuchen, um die in vivo-Situation unter Verwendung mikrofluidischer Systeme 7 durchgeführt wird, aber auch diese Assays nachahmen, obwohl viel verbessert, sind noch nicht für alle in vivo vorhandenen Kammern entfallen. Aufgrund der Einschränkungen der in vitro und ex vivo-Angiogenesemodellen in vivo Modellen bleibt das zuverlässigere Auswahl für Angiogenese-Studien. Beispiele für diese Modelle sind die Implantation von transparenten Kammern, &quot;Fenster&quot;, die die Visualisierung von wachsenden Blutgefäße unter dem Mikroskop 8 zu ermöglichen, injizierbare subkutane Implantate wie Matrigel und Gefäßbildung in normalen Geweben wie Mausohr und dem Huhn Chorioallantoismembran (CAM ). Allerdings ist eine der akzeptablen und quantitative in vivo Angiogenese-Modellen die hier beschriebene Hornhautmikrotaschen-Assay Neovaskularisierung, welche das natürlich avaskulären nutztHornhaut als &quot;Bildschirm&quot; zu visualisieren und zu beurteilen, neue angiogene Wachstums 9. Hier beschreiben wir die Hornhaut-Mikrotaschen-Assay in Mäusen entwickelt. Zunächst wurde das Modell verwendet werden, um unspezifische Reize angiogenen in Kaninchen-Hornhaut messen. Dies wurde durch die Einführung von Tumorstücke in das Kammerwasser von der Vorderkammer des Auges des Kaninchens durchgeführt und gemessen Tumor-induzierte Neovaskularisierung 11. Allerdings wurde der Test später entwickelt, um Effekte von spezifischen Wachstumsfaktoren zu untersuchen 10, besser zu spezifizieren und zu standardisieren, die angiogene Wirkung. Um den Wachstumsfaktor in das Auge zu lösen, wurden Pellets mit langsamer Freisetzung, die bekannte Mengen von angiogenen Wachstumsfaktoren anstelle von Geweben verwendet. Die Verfügbarkeit von gereinigten rekombinanten Proteine ​​angiogenen wie bFGF oder VEGF aktiviert ihre Verwendung als spezifische Ziele der Angiogenese modulaters 12. Zunächst wurde der Assayweitgehend in Kaninchen, die einfacher, mit aufgrund ihrer Größe, aber später wurde das Modell in Mäuse setzten Werk verwendet werden; ein kleiner und kostengünstiger Tiermodell. Der Wechsel von Kaninchen, Mäuse vorgesehen einen wichtigen Vorteil in der Lage zu genetisch manipulierten Tieren zu verwenden, wodurch eine neue Ära der Erforschung der genetischen Komponenten beeinflussen die Angiogenese 13 entsteht. Neben der Nutzung von akzeptabler Hornhaut-Test bei der Untersuchung der Angiogenese, andere biologische Prozesse können ebenfalls unter Verwendung von modifizierten Assays untersucht. So wurden beispielsweise Studien von Lymphangiogenese möglich durch die Implantation von niedrig dosiertem bFGF-Pellets, die die Visualisierung von Lymphgefäßen durch spezifische molekulare Marker 14 erlaubt werden. Darüber hinaus hat dieser Test ein Mittel, um die Wirkung der Strahlung auf die Angiogenese zu bewerten 15 vorgesehen. In Summe ist die Hornhaut-Mikro Angiogenese-Assay eine quantitative, reproducible, flexible Beurteilung der Angiogenese in vivo. Ein großer Vorteil dieses Tests besteht darin, dass die Messung der Hintergrundgefäße unnötig, weil die Behälter wachsen auf einem natürlich avaskulären Gewebe. Wir beschreiben hier das Protokoll dieses Tests in Details und verschiedenen Szenarien, die auftreten können, zu diskutieren. Der Test besteht aus 3 diskrete Segmente. Hier werden wir die Herstellung von Wachstumsfaktor-inclusive-Pellets, die spätere chirurgische Implantation und schließlich die Methode verwendet, um die daraus resultierenden neovaskulären Wachstum zu quantifizieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="612">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Section 1: Pellet preparation</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sucralfate</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#S0652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hydron (aka Poly(2-Hema))</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#P3932-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:111px;">Pharmco Products Inc</td>
			<td style="width:119px;">#111000200CSGL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Growth factors:</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Must be carrier-free (no bovine serum albumin(BSA))</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;Fibroblast growth factor (FGF)</td>
			<td style="width:111px;">PeproTech</td>
			<td style="width:119px;">#AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vascular endothelial growth factor (VEGF)</td>
			<td style="width:111px;">R &#38; D Systems</td>
			<td style="width:119px;">#293-VE-050/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 mm dish</td>
			<td style="width:111px;">Becton-Dickson</td>
			<td style="width:119px;">#353001</td>
			<td>Used for storage of pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 cm petri dish</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">#25384-342</td>
			<td>Used as work surface for preparing pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mesh</td>
			<td style="width:111px;">Sefar America</td>
			<td style="width:119px;">#03--300/51</td>
			<td>300 um nitex nylon, cut into cm square pieces and sterilzed in autoclave</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spatulas</td>
			<td style="width:111px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#21-401-10</td>
			<td>Use tapered end of one to break up pellet mixture. Bend tapered end of other to help remove mixture from microcentrifuge tube.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:111px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#05-408-146</td>
			<td>One for hydron, one for sucralfate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Jewelers forceps, #5</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#2315E</td>
			<td>Need 2 for pulling mesh apart</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifugal evaporator</td>
			<td style="width:111px;">ThermoSavant</td>
			<td style="width:119px;">DNA110 SpeedVac</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Section 2: Surgical implantation of pellets</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Operating microscope</td>
			<td style="width:111px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2.5% Avertin</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>General anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Proparacaine hydrochloride ophthalmic solution 0.5%</td>
			<td style="width:111px;">Falcon</td>
			<td>NDC# 6131401601</td>
			<td>Eye anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Triple Antibiotic Ophthalmic Ointment</td>
			<td style="width:111px;">Bausch &#38; Lomb</td>
			<td style="width:119px;">NDC# 2420878055</td>
			<td>Contains neomycin, polymixin and bacitracin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ophthalmic microknife, 5 mm</td>
			<td style="width:111px;">Surgistar</td>
			<td style="width:119px;">#924501</td>
			<td>30 degree angle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">von Graef knife</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#3401E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Jewelers forceps, #1</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#2301E</td>
			<td>Must be blunted with sharpening stone for proptosing eye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Jewelers forceps, #5</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#2305E</td>
			<td>For picking up pellets and placing on eye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Small curved scissors</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#5636E</td>
			<td>For trimming whiskers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gauze</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For blotting eye after proparacaine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Section 3: Grading of Corneal Neovascularization</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2.5% Avertin</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>General anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Slit lamp</td>
			<td style="width:111px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">FS-2</td>
			<td>Needs an ocular with a reticule to assist in measuring</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the corneal micropocket assay: a model of angiogenesis in the mouse eye

Das Maushornhaut-Mikrotaschen-Assay ist ein robustes und quantitative in vivo-Test zur Bewertung der Angiogenese. Durch die Verwendung von standardisierten Slow-Release-Pellets, die bestimmte Wachstumsfaktoren, die Blutgefäßwachstum in der gesamten Hornhaut natürlich avaskuläre auslösen können Angiogenese gemessen und quantifiziert werden. In diesem Assay wird im Laufe von mehreren Tagen die angiogene Antwort erzeugt, abhängig von der Art und Dosis des Wachstumsfaktor verwendet wird. Die Induktion einer Neovaskularisation wird üblicherweise entweder durch basische Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) oder vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) ausgelöst. Durch die Kombination dieser Wachstumsfaktoren mit Sucralfat und Hydron (Poly-HEMA (Poly (2-hydroxyethylmethacrylat))) und Gießen der Mischung zu Pellets, können sie operativ in der Maus Auge implantiert werden. Diese einheitlichen Pellets langsam lösen Sie die Wachstumsfaktoren über fünf oder sechs Tage (bFGF oder VEGF beziehungsweise) ermöglicht ausreichend angiogene Antwort für Gefäßfläche q erforderlichuantification mit der Spaltlampe. Dieser Test kann für verschiedene Anwendungen, einschließlich der Bewertung von angiogenen Modulators Medikamente oder Behandlungen sowie Vergleich zwischen unterschiedlichen genetischen Hintergründen zu beeinflussen Angiogenese verwendet werden. Ein erfahrener Ermittler nach dem Üben dieses Assays können ein Pellet in weniger als 5 min pro Auge zu implantieren.

Typische Ergebnisse für bFGF und VEGF-Pellets in den normalen niedrigen angiogenen C57BL / 6J Mäuse werden in 2A und B gezeigt. 2E zeigt die normale Verteilung der Gefäßfläche (VA) in der C57BL / 6J Belastung mit variierenden Dosen von diesen Wachstums Faktoren. 80 ng bFGF Pellets normalerweise in einer VA von etwa 2,0 mm 2 führen, wenn Werte in einem Bereich von 1,8 bis 2,4 mm 2 sind akzeptabel. 200 ng VEGF-Pellets führen typischerweise ein...

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The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

Das Protokoll beschreibt die Hornhaut-Mikrotaschen-Assay in Mäusen entwickelt.

Die Hornhaut-Mikrotest: Ein Modell der Angiogenese bei der Maus Augen

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.6K Aufrufe.  Boston Children's Hospital.  Das Protokoll beschreibt die Hornhaut-Mikrotaschen-Assay in Mäusen entwickelt. 

Serie: The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

Isolation und Expansion der erwachsenen Maus Neural Stem Cells mit dem Neurosphäre Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Forschung

Neurowissenschaften

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

Gründung Embryonale Maus Neural Stem Cell Culture Mit dem Neurosphäre Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Präparation einer Maus Eye für einen ganzen Berg von retinalen Pigmentepithel

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible vision loss. Examples of such diseases in human include traumatic optic neuropathy and optic nerve degeneration in glaucoma. It is characterized by typical changes in the optic nerve head, progressive optic nerve degeneration, and loss of retinal ganglion cells, if uncontrolled, leading to vision loss and blindness.
The optic nerve crush (ONC) injury mouse model is an important experimental disease model for traumatic optic neuropathy, glaucoma, etc. In this model, the crush injury to the optic nerve leads to gradual retinal ganglion cells apoptosis. This disease model can be used to study the general processes and mechanisms of neuronal death and survival, which is essential for the development of therapeutic measures. In addition, pharmacological and molecular approaches can be used in this model to identify and test potential therapeutic reagents to treat different types of optic neuropathy.
Here, we provide a step by step demonstration of (I) Baseline retrograde labeling of retinal ganglion cells (RGCs) at day 1, (II) Optic nerve crush injury at day 4, (III) Harvest the retinae and analyze RGC survival at day 11, and (IV) Representative result.

This protocol shows how to retrogradely label retinal ganglion cells, and how to subsequently make an optic nerve crush injury in order to analyze retinal ganglion cell survival and apoptosis. It is an experimental disease model for different types of optic neuropathy, including glaucoma.

Ein Optic Nerve Crush Injury Mausmodell zur retinalen Ganglienzellen Survival Study

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks of Alzheimer's disease. The central component of neuritic plaques is a small filamentous protein called amyloid &beta; protein (A&beta;)1, which is derived from sequential proteolytic cleavage of the beta-amyloid precursor protein (APP) by &beta;-secretase and &gamma;-secretase. The amyloid hypothesis entails that A&gamma;-containing plaques as the underlying toxic mechanism in AD pathology2. The postmortem analysis of the presence of neuritic plaque confirms the diagnosis of AD. To further our understanding of A&gamma; neurobiology in AD pathogenesis, various mouse strains expressing AD-related mutations in the human APP genes were generated. Depending on the severity of the disease, these mice will develop neuritic plaques at different ages. These mice serve as invaluable tools for studying the pathogenesis and drug development that could affect the APP processing pathway and neuritic plaque formation. In this protocol, we employ an immunohistochemical method for specific detection of neuritic plaques in AD model mice. We will specifically discuss the preparation from extracting the half brain, paraformaldehyde fixation, cryosectioning, and two methods to detect neurotic plaques in AD transgenic mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thiofalvin S staining method.

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer&#039;s Disease Mouse Model

One of the pathological characteristics of AD is the formation of Amyloid &#x03B2; protein positive neuritic plaques. In this protocol we describe two methods to detect neuritic plaques in transgenic AD model mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thioflavin S staining method.

Nachweis von neuritischen Plaques bei Alzheimer-Maus-Modell

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

Ganze Berge Immunfluoreszenzfärbung der Neonatal Maus Retina zu untersuchen Angiogenese<em&gt; In vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

Isolierung und Kultivierung von Endothelzellen aus dem embryonalen Vorderhirn

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response is a vision-based, reflexive behavior that has been observed in all vertebrates tested. Tadpole eyes are small so the tail flip response was used as alternative measure, which requires a trained technician to record the subtle response. We developed an alternative behavior assay based on the fact that tadpoles prefer to swim on the white side of a tank when placed in a tank with both black and white sides. The assay presented here is an inexpensive, simple alternative that creates a response that is easily measured. The setup consists of a tripod, webcam and nested testing tanks, readily available in most Xenopus laboratories. This article includes a movie showing the behavior of tadpoles, before and after severing the optic nerve. In order to test the function of one eye, we also include representative results of a tadpole in which each eye underwent retinal axotomy on consecutive days. Future studies could develop an automated version of this assay for testing the vision of many tadpoles at once.

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Xenopus laevis tadpoles prefer swimming on the white side of a black/white tank. This behavior is guided by their vision. Based on this behavior, we present a simple assay to test the visual function of tadpoles.

Eine einfache Verhaltenstest zur Prüfung von Visual Function in<em&gt; Xenopus laevis</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and lifespan. In addition, telomerase protects the mitochondria from oxidative stress and confers resistance to apoptosis, suggesting its possible importance for the surviving of non-mitotic, highly active cells such as neurons. We previously demonstrated the ability of novel telomerase activators to increase telomerase activity and expression in the various mouse brain regions and to protect motor neurons cells from oxidative stress. These results strengthen the notion that telomerase is involved in the protection of neurons from various lesions. To underline the role of telomerase in the brain, we here compare the activity of telomerase in male and female mouse brain and its dependence on age. TRAP assay is a standard method for detecting telomerase activity in various tissues or cell lines. Here we demonstrate the analysis of telomerase activity in three regions of the mouse brain by non-denaturing protein extraction using CHAPS lysis buffer followed by modification of the standard TRAP assay.
In this 2-step assay, endogenous telomerase elongates a specific telomerase substrate (TS primer) by adding TTAGGG 6 bp repeats (telomerase reaction). The telomerase reaction products are amplified by PCR reaction creating a DNA ladder of 6 bp increments. The analysis of the DNA ladder is made by 4.5% high resolution agarose gel electrophoresis followed by staining with highly sensitive nucleic acid stain.
Compared to the traditional TRAP assay that utilize 32P labeled radioactive dCTP&#39;s for DNA detection and polyacrylamide gel electrophoresis for resolving the DNA ladder, this protocol offers a non-toxic time saving TRAP assay for evaluating telomerase activity in the mouse brain, demonstrating the ability to detect differences in telomerase activity in the various female and male mouse brain region.

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerase is expressed in the neonatal brain and also in distinct regions of the adult brain. We present a non-toxic time saving TRAP assay for the analysis of telomerase activity in various regions of the mouse brain and detection of differences in telomerase activity between male and female mouse brains.

Telomerase-Aktivität in den verschiedenen Regionen der Maus Gehirn: Nicht-radioaktive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP)-Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor determining patient outcome and is therefore frequently taken as a study endpoint. However, in small animal studies on SAH, quantification of cerebral vasospasm is a major challenge. Here, an ex vivo method is presented that allows quantification of volumes of entire vessel segments, which can be used as an objective measure to quantify cerebral vasospasm. In a first step, endovascular casting of the cerebral vasculature is performed using a radiopaque casting agent. Then, cross-sectional imaging data are acquired by micro computed tomography. The final step involves 3-dimensional reconstruction of the virtual vascular tree, followed by an algorithm to calculate center lines and volumes of the selected vessel segments. The method resulted in a highly accurate virtual reconstruction of the cerebrovascular tree shown by a diameter-based comparison of anatomical samples with their virtual reconstructions. Compared with vessel diameters alone, the vessel volumes highlight the differences between vasospastic and non-vasospastic vessels shown in a series of SAH and sham-operated mice.

The goal of this article is to present a method that allows a 3-dimensional reconstruction of the cerebrovascular tree in mice after micro computed tomography and determination of volumes of entire vessel segments that can be used to quantify cerebral vasospasm in murine models of subarachnoid hemorrhage.

Eine Volumetrische Methode zur Quantifizierung der zerebralen Vasospasmus in einem Mausmodell der Subarachnoidalblutung

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...