Um neuartige Medikamente und Verbindungen zu entwickeln, die auf Tumore im zentralen Nervensystem abzielen, ist die Zugänglichkeit und der Durchgang durch die Blut-Hirn-Schranke sehr wichtig. Obwohl die Zytotoxizität der Verbindungen leicht durch Inkubation der Zellen mit den therapeutischen Molekülen gemessen werden kann, sagt es nicht wirklich etwas über die tatsächliche Lieferung an die Tumorstelle im Gehirn aus. Um dieses Problem anzugehen, haben wir das folgende Protokoll entwickelt, das beschreibt, wie man die Blut-Hirn-Tumorbarriere in vitro auf einer Schale nachbilden kann.
Die Verwendung von verewigten Zellen murinen oder menschlichen Ursprungs macht diesen Test sehr flexibel. Es kann auch leicht skaliert werden, um Dutzende von Verbindungen mit hoher Reproduzierbarkeit zu überprüfen. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode sowohl die Quantifizierung als auch die Visualisierung der Durchgangs- und Targeting-Fähigkeit der Verbindungen, bevor sie mit präklinischen Modellen fortfährt.
Daher ersetzt unsere Methode teilweise die Tiermodelle durch die verwendung der vorgefertigten Zelllinien. Die Einbeziehung von vom Patienten abgeleiteten Hirntumorzellen assays the patient heterogenity, während die Verwendung von verewigten Zellen, um die Blut - Hirn-Schranke zu etablieren, die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse gewährleistet. Insgesamt bietet dieses Blut-Hirn-Schrankenmodell ein wirklich interessantes Werkzeug, um die Drogendiffusion oder die Lieferung von Drogenfahrzeugen zu assayen.
Die visuelle Demonstration der Methode ist von entscheidender Bedeutung, da das Seeding der Zellen auf der gegenüberliegenden Seite des Inserts eine Manipulation erfordert, die in anderen Protokollen, die ähnliche Einstellungen verwenden, nicht oft beschrieben wird. Zum Beispiel, die Haftung von Astrozyten zu erhalten, wenn der Einsatz auf den Kopf gestellt wird, profitiert sehr von der visuellen Darstellung. Waschen Sie unter einer sterilen Zellkulturhaube die kultivierten Astrozyten vorsichtig mit fünf Millilitern steriler PBS.
Verwenden Sie eine Vakuumpumpe, um die PBS vorsichtig zu entsorgen, und fügen Sie zwei Milliliter Zelldissoziationsreagenz für fünf Minuten hinzu, um die Zellen zu lösen. Fügen Sie dann 10 Milliliter steriles vollständiges Astrozytenzellkulturmedium in das Gefäß ein, um die Aktivität des Zelldissoziationsreagenzes zu hemmen. Verwenden Sie eine sterile serologische Pipette, um die abgetrennten Zellen aus dem Gefäß in ein steriles 15-Milliliter-Rohr zu übertragen.
Zentrifuge bei 250 mal g für drei Minuten bei Raumtemperatur. Legen Sie in der Zwischenzeit die Einsätze fest. Verwenden Sie sterile Zangen, um die Einsätze mit der Gehirnseite auf den Deckel einer sterilen Sechs-Brunnen-Platte zu legen.
Wenn die Zentrifugation abgeschlossen ist, entsorgen Sie den Überstand vorsichtig aus der Zellsuspension und setzen Sie das Astrozytenpellet in einem Milliliter ABM-plus wieder auf, indem Sie das Pellet bis zu fünfmal sanft an die Rohrwand pfeifen. Zählen Sie dann die Zellen, und passen Sie die Zellsuspensionsdichte auf 150 000 Zellen in 400 Mikroliter ABM-plus pro Einsatz an. Legen Sie die Zellsuspension in die Mitte der Gehirnseite der Membran des Einsatzes und verteilen Sie sie vorsichtig mit Kapillarkraft mit einer sterilen Pipettenspitze.
Wenn die Gehirnseite der Einsätze noch hoch ist, legen Sie die Sechs-Well-Platte wieder auf die Einsätze. Legen Sie die Platte und Einsätze, mit der Gehirnseite nach oben, in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid, um die Zellhaftung zu ermöglichen. Danach kehren Sie die Sechs-Well-Platte wieder in ihre reguläre Position zurück, mit den Einsätzen nun Blut seite oben.
Fügen Sie Medium hinzu, und setzen Sie die Inkubation wie im Textprotokoll beschrieben fort. Waschen Sie unter einer sterilen Zellkulturhaube die kultivierten Endothelzellen sorgfältig mit fünf Millilitern sterilem PBS. Verwenden Sie eine Vakuumpumpe, um die PBS vorsichtig zu entsorgen, und fügen Sie zwei Milliliter Zelldissoziationsreagenz für fünf Minuten hinzu, um die Zellen zu lösen.
Fügen Sie dann 10 Milliliter steriles vollständiges Endothelzellkulturmedium in das Gefäß ein, um die Aktivität des Zelldissoziationsreagenzzuführens zu hemmen. Verwenden Sie eine sterile serologische Pipette, um die abgetrennten Zellen aus dem Gefäß in ein steriles 15-Milliliter-Rohr zu übertragen. Zentrifuge bei 250 mal g für drei Minuten bei Raumtemperatur.
Danach entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Endothelzellpellet in einem Milliliter EBM-plus wieder auf, indem Sie die Zellsuspension bis zu fünfmal an der Rohrwand abpfeifen. Zählen Sie die Zellen und passen Sie die Zellsuspensionsdichte auf 200.000 Zellen in 2,5 Milliliteren endotheliale Zellkultur ohne Serum und vaskulären endotheliale Wachstumsfaktor A pro Einsatz an. Rufen Sie die Platte mit den Einsätzen ab.
Entsorgen Sie das Medium vorsichtig von der Blutseite und ersetzen Sie es durch die 2,5 Milliliter Endothelzellsuspension. Dann kehren Sie die Platte zum Inkubator zurück und lassen Sie sie über Nacht, damit die Endothelzellen an der Membran haften. Am nächsten Tag bereiten Sie eine Sechs-Brunnen-Platte vor, indem Sie drei Milliliter vorgewärmtes ABM-Minus auf jeden Brunnen übertragen.
Mit sterilen Zangen die Einsätze behandeln, um das endotheliale Komplettemedium vorsichtig von der Blutseite zu entsorgen, und legen Sie den Einsatz in die neue Platte, die ABM-minus enthält. Fügen Sie dann 2,5 Milliliter EBM-minus hinzu. Lassen Sie die Einsätze im Inkubator mit minimalen körperlichen Störungen oder Temperaturschwankungen für fünf Tage.
Ersetzen Sie am Tag der Übertragung das Medium. Zur Immunfluoreszenz-Bildgebung legen Sie bis zu vier runde sterile Borosilikat-Abdeckungen in jeden Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte, die zwei Milliliter Poly-D-Lysin enthält. Bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubieren.
Verwenden Sie in der Zwischenzeit eine sterile serologische Pipette, um die Tumorkugeln vorsichtig aus dem Zellkulturgefäß in ein 15-Milliliter steriles Rohr zu übertragen. Zentrifugieren Sie die Tumorkugeln drei Minuten lang mit 250 mal g. Entsorgen Sie den Überstand, und setzen Sie die Kugeln vorsichtig in einem Milliliter GBM-minus wieder auf.
Zählen Sie die Zellen, und passen Sie die Zelldichte auf etwa 10.000 Kugeln oder 100.000 Zellen pro Milliliter GBM-minus an. Als nächstes entsorgen Sie das Poly-D-Lysin aus den Brunnen und spülen Sie die Brunnen dreimal mit sterilem PBS ab. Säen Sie jeden Brunnen der Platte mit drei Millilitern der Tumorsphäroidsuspension, und übertragen Sie die Einsätze mit dem BBTB-Mimik auf die Tumorzellsuspension.
Inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid, damit die Blut- und Hirntumorseiten des Assays ins Gleichgewicht kommen. Ersetzen Sie am nächsten Tag die Medien in der Blutseite durch EBM-minus, ergänzt durch die Moleküle, Medikamente oder Nanopartikel von Interesse. Sammeln Sie die Proben im Laufe der Zeit für die direkte Quantifizierung wie zuvor beschrieben.
Sammeln Sie zunächst 100 Mikroliter des Mediums sowohl von der Blut- als auch von der Hirnseite der BBTB-Mimik und übertragen Sie sie jeweils auf eine separate flachsbeinige, schwarze 96-Well-Platte für nachfolgende Fluoreszenzmessungen. Als nächstes bereiten Sie eine 50-Mikromolar-Lösung von Natriumfluorescein in EBM-minus vor, um sicherzustellen, dass 2,5 Milliliter pro Brunnen vorbereitet werden. Diese Lösung auf 37 Grad Celsius vorwärmen und die Medien von der Blutseite der Einsätze durch Medien ersetzen, die diese Natriumfluoresceinlösung enthalten.
Starten Sie einen Timer, sobald das Medium ausgetauscht wird. Sammeln Sie vorsichtig 100 Mikroliter Medien von der Blut- und Gehirnseite der Einsätze in fünf Minuten, 30 Minuten, 60 Minuten und 120 Minuten. Übertragen Sie jede Probe in getrennte Brunnen der entsprechenden schwarzen, 96-Well-Platte.
Verwenden Sie einen Plattenleser, um die Fluoreszenz aus den gesammelten Proben zu quantifizieren. Verdünnen Sie zunächst den Lysosomenfluoreszenzfarbstoff auf die entsprechende Arbeitskonzentration in vorgewärmtem Medium. Fügen Sie dies zu den Zellen hinzu und brüten Sie bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 45 Minuten.
Dann spülen Sie die Zellen dreimal mit eiskaltem PBS ab. Entsorgen Sie die PBS, und fügen Sie drei Milliliter eiskaltes 4%Paraformaldehyd in die Brunnen und 2,5 Milliliter in den Einsatz. 10 Minuten auf Eis bebrüten.
Danach entsorgen Sie das Paraformaldehyd und spülen Sie die Zellen dreimal mit PBS ab. Entfernen Sie die PBS, und vereiteln Sie die Zellkerne mit einer DAPI-Lösung in einer Endkonzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter in destilliertem Wasser. Sieben Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Entfernen Sie dann die DAPI, und waschen Sie die Membranen dreimal mit destilliertem Wasser. Schneiden Sie die Membran vorsichtig, entfernen Sie das destillierte Wasser und legen Sie es auf einen Tropfen Montagemedium auf einem Glasmikroskopschlitten. Fügen Sie einen weiteren Tropfen des Montagemediums auf der anderen Seite der Membran hinzu und bedecken Sie es sorgfältig mit einem Borosilikat-Abdeckungsglas.
In dieser Studie wurden Endothelzellen mit Astrozyten kokultiviert, um eine Blut-Hirn-Tumor-Barriere-ähnliche Schnittstelle in einem In-vitro-Setup zu bilden. Die konfokale Bildgebung der murinen BBTB-Mimik zeigt die Expression und zelluläre Lokalisation der engen Knotenproteine Zonula occludens-1 und claudin-5 in bEND3. Kontakte zwischen den Endothelzellen und Astrozyten führen eindeutig zur Verlagerung dieser beiden Proteine in die endotheliale Zell-zu-Zell-Kontakte im Vergleich zu den bEND3-Monokulturen.
Mit Hilfe der Immunfluoreszenzfärbung zur Visualisierung der GFAP-exezierenden Astrozyten an der Hirnseite der Membran ist es möglich, die astrozytären Prozesse und Endfüße zu beobachten und zu untersuchen, die die Endothelzellen durch die Membran kontaktieren. Um die Permeabilitätswerte der in vitro BBTB-Imitiden mit der In-vitro-Blut-Hirn-Schranke zu vergleichen, wird die Echtzeitdiffusion von Natriumfluorescein durch ein Schädelfenster abgebildet, das bei Nacktmäusen implantiert wurde. Mit Hilfe eines Fluoreszenz-Stereomikroskops wird die Natriumfluoresceindiffusion aus den Kapillaren des Blutgefäßes, die sich aus den hauptpialen Blutgefäßen ergeben, vor, während und nach der systemischen Injektion der Sonde aufgezeichnet.
Die Transzytose von Nanopartikeln, die auf von Patienten abgeleitete Glioblastomkugeln abzielen, wird dann verglichen, um zu veranschaulichen, wie diese BBTB-Mimik verwendet werden kann, um den Übergang von Verbindungen von der Blutseite zur Gehirnseite zu visualisieren. Das NP110-assoziierte Fluoreszenzsignal lokalisiert mit den Lysosomen in den Endothelzellen, Astrozyten und Tumorzellen. Darüber hinaus werden NP110s zwischen den Endothelzellen und Astrozyten nachgewiesen, die durch die Membranporen des Inserts gehen.
Der Durchgang von NP110s wird durch Messung der Fluoreszenz von Proben quantifiziert, die sowohl von der Blut- als auch von der Gehirnseite gesammelt wurden, und diese Werte werden mit den ermittelten Nanopartikeln verglichen, die 350 Nanometer betragen. Wie man sieht, sind nur NP110s in der Lage, die BBTB-Mimik zu kreuzen, während NP350 auf der Blutseite blieb, was zu niedrigeren Durchlässigkeitswerten für diese Nanopartikel führte. Behandeln Sie den Einsatz mit Vorsicht, und verteilen Sie vorsichtig die Astrozytenzellsuspension auf der Gehirnseite des Inserts ohne direkten Kontakt der Membran.
Jede Beschädigung der Membran führt zu Leck. Diese Methode kann angepasst werden, um die Frage nach der Hirnabgabe von peripher verabreichten Nutzlasten zu beantworten. Durch die Verwendung verschiedener Inserts mit größeren Membranporen ist es auch möglich, die Zellextravasation zu untersuchen.
Diese Technik kann durch die Verwendung verschiedener Zelltypen geändert werden, um andere zelluläre Barrieren zu imitieren. Es ebnet auch den Weg zu einer verantwortungsvolleren und ethischeren Forschung, mit dem Ziel, die Zahl der Labortiere zu reduzieren, die für die Validierung von Krebsmedikamenten verwendet werden. Bitte beachten Sie, dass Paraformaldehyd eine sehr giftige Chemikalie ist und entsprechend behandelt werden sollte.
Achten Sie auch auf ein scharfes Skalpell, um die Membranen aus den Einsätzen zu extrahieren.
