The authors have no acknowledgements.

Alle Tierversuche sind in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Leitlinien und genehmigt von der Institutional Animal Care und Use Committee der University of Toledo durchgeführt. 1. Phänotypisierung von Pil1-DsRed Mäuse HINWEIS: Nachkommen werden von der Zucht heterozygot Pil1-DsRed Mäuse mit Wildtyp (WT) C57BL6 Mäuse erzeugt. Drei bis vier Wochen alte Welpen werden als bereit für die Phänotypisierung. Submandibular Blutung der Mäuse folgt einem festgelegten Protokoll mit geringfügigen Änderungen 23. <ol><li> Isolation von weißen Blutkörperchen aus dem Vollblut von Maus Pups <ol><li> In 20 ul Heparin zu je 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Erwerben Sie einen Welpen aus dem Käfig. Notieren Sie sich die Erkennungsmarke des Welpen. Es ist nicht erforderlich, Welpen, bevor sie aus der submandibular Vene Blutentnahme zu betäuben. </li><li> Halten Sie Welpe durch Hals Genick und stechen Sie die submandibular Vene in the Backentasche mit einem 5 mm Lanzette verwenden. Tragen Sie eine ausreichende Kraft, um eine kleine Einstich zu schaffen, so dass Tropfen Blut aus dem Einstich ausstrahlen. Verwenden Sie für jeden Welpen eine neue Nadel. </li><li> Sammeln Sie 3 bis 5 Tropfen Blut pro Welpe in einem Heparin-haltigen Mikrozentrifugenröhrchen. Reinigen Sie die Einstichstelle und Druck auf die Hämostase erleichtern. </li><li> Setzen Sie Welpen in neuen Käfig und beobachten für 30 Minuten vor dem Käfig in die Tieranlage zurück. </li><li> Sammeln von Blut aus erwachsenen Mäusen eines bekannten Phänotyp als positive und negative Kontrollen. </li><li> Hinzufügen 500 ul rote Blutkörperchen lysierende Puffer zu jedem Röhrchen, Wirbelrohre, und Inkubieren während 5 - 10 min auf Eis. </li><li> Langsam 400-500 ul fötales Rinderserum (FBS) unterhalb der Zellsuspensionen in jedes Röhrchen. Eine klare Schnittstelle zwischen der oberen Schicht Zellsuspension und der unteren Schicht von FBS zu beachten. </li><li> Cap Rohre und Zentrifuge Proben bei 1500 × g für 5 min. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.1.7 - 1.1.9 auf Pelzther entfernen roten Blutkörperchen. Wiederholen Sie nicht, wenn die Lyse das erste Mal, ausreichend ist. Das Pellet sollte schwierig sein, nach dem Zentrifugieren zu erkennen. </li></ol></li><li> Lipopolysaccharide (LPS) Stimulation und Kultur <ol><li> Die Zellen in 200 ul kompletten Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium. </li><li> Übertragen die Zellsuspension auf eine Durchflusszytometrie Röhre. </li><li> Machen LPS Arbeitslösung von 10 ul LPS-Stammlösung Mischen (1 mg / ml) mit 990 ul komplettem RPMI-1640-Medium. </li><li> Geben Sie 20 &amp; mgr; l von 10 &amp; mgr; g / ml LPS-Arbeitslösung zu 200 &amp; mgr; l Zellsuspension. </li><li> Kappenröhrchen lose und inkubieren Proben für 4 Stunden bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li></ol></li><li> Durchflusscytometrieanalyse <ol><li> Öffnen Sie das Datenerfassungsprogramm für die Durchflusszytometrie. Richten Sie Erwerb Vorlage vor Erwerb zu probieren. </li><li> Klicken Sie auf den Dot-Plot-Werkzeug in der Werkzeugpalette. Zeichnen Sie ein forward Streuung (FSC) vs Seitenstreuung (SSC) Plot. Stellen Sie die FSC und SSC Spannungsparameter in eine lineare Skala. </li><li> Wählen Sie die niedrigsten Schwellen von FSC und SSC durch das Zytometer erlaubt. Bewerben Schwellen 200 und 50 für FSC und SSC sind. </li><li> Innerhalb des FSC vs SSC Plot, ein Gate G1 ziehen, die Monozyten, Granulozyten und dendritischen Zellen und schließt Schmutz, rote Blutkörperchen und Lymphozyten enthält. </li><li> Klicken Sie auf das Histogramm-Werkzeug in der Werkzeugpalette. Zeichnen Sie ein FL2 (rote Fluoreszenz-Kanal) Histogramm. Verwenden Sie einen negativen Kontrollprobe die Basislinie von FL2 Signale und eine positive Kontrollprobe zu setzen ein Tor zu zeichnen, um alle DsRed positive Ereignisse aufzunehmen. </li><li> Auf der Fluidik Bedienfeld des cytometer, stellen Sie die Flüssigkeit Modus auf &quot;RUN&quot; und der Fließgeschwindigkeit auf &quot;HALLO&quot; (ca. 60 &amp; mgr; l / min). Erwerben 10.000 Ereignisse pro Probe. </li><li> Bestimmen Pup Phänotyp durch den Prozentsatz der DsRed-positiven Zellen aus der G1-Gate zu messen. </li></ol></li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. Die Induktion von Hautentzündung in Pil1-DsRed Mäuse <ol><li> Anästhesieren Maus durch intraperitoneale (ip) Injektion eines Anästhetikums Cocktail, enthaltend 100 mg / kg Ketamin, 10 mg / kg Xylazin und 1 mg / kg Acepromazin. Adäquat narkotisierten Mäusen zeigen keine Hinterpfote Rückzug bis Fuß Prise. </li><li> Tragen Sie Haarentfernungs-Creme auf die dorsale Oberfläche beider Ohren der Maus. Warten Sie 30 Sekunden bis 1 Minute. Wischen Sie Ohr Oberfläche mit Wasser benetzten Baumwolle und an der Luft trocknen. </li><li> Messen Sie die Ohrdicke Mikrometer verwendet und ersetzen Maus in einem separaten Käfig. Beachten Sie, bis aus der Narkose (~ 15 - 30 min). Zu lösen, indem die Haarentfernung Produkt induzierte Hautentzündung, lassen Sie die Maus für 3 Tage ruhen, bevor weitere Experimente durchgeführt. </li><li> Bereiten 1,25% (w / v) OX von in 1 ml Aceton 16,7 mg OX Lösen und Mischen 750 ul OX / Aceton-Lösung mit 250 ul Olivenöl. Bereiten Trägerlösung 750 ul Aceton mit 250 durch Mischen &amp;# 181; l Olivenöl. </li><li> Re-betäuben Maus durch ip-Injektion von Anästhetikum Cocktail (2.1). Messen Sie die Ohrdicke wie zuvor. </li><li> Bewerben 12,5 ul von 1,25% OX auf jeder Seite des rechten Ohres. Bewerben 12,5 ul Aceton / Olivenöl Fahrzeug Lösung auf jeder Seite des linken Ohr. </li><li> Halten Sie die Maus von Käfiggenossen trennen, bis sie vollständig Beleidigung seine Ohren von anderen Mäusen zu verhindern gewonnen, dann ersetzen Sie die Maus in ihren ursprünglichen Käfig und zurück zur Tierhaltung Möglichkeiten. HINWEIS: Haarentfernung in kleinere Hautentzündung nach durch Änderung der Ohrdicke führen kann. Diese kleine Entzündung wird 3 Tage später gelöst durch normale Ohrdicke bestätigt. Nach der topischen Anwendung für 24 Stunden, OX-behandelten Ohren zeigen signifikant (p &lt;0,01) im Vergleich Fahrzeuglösung allein behandelten Ohren Schwellung. </li></ol> 3. Die Markierung von Neutrophilen in Pil1-DsRed Mäuse HINWEIS: In - vivo - Markierung von Neutrophilen durch eine niedrige Dosis fluorescence-konjugiert Neutrophilen-spezifischen mAb folgt eine kürzlich entwickelte Protokoll 19. Retro-Orbital - Injektionen werden nach einem festgelegten Protokoll mit einigen Modifikationen 24 durchgeführt. <ol><li> Bereiten anti-Ly6G mAb Arbeitslösung durch 10 ul 0,5 mg Verdünnung / ml Alexa Fluor 647-konjugiertem anti-Ly6G mAb (Klon 1A8) in 90 &amp; mgr; l phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). </li><li> Transfer von 100 &amp; mgr; l anti-Ly6G mAb-Arbeitslösung (50 ug / ml) in eine U-100 Insulin-Spritze mit 28 Gauge-Nadel. </li><li> Anesthetize einen erwachsenen Pil1-DsRed Maus durch ip-Injektion des zuvor Anästhetikum Cocktail beschrieben (2.1). Setzen Sie den narkotisierten Maus Bauch auf einer sauberen Arbeitsplatte nach unten. </li><li> Wenden Sie sanft nach unten Druck auf die Haut dorsalen und ventralen einer Maus Auge teilweise den Augapfel aus der Steckdose herausragen. </li><li> Setzen Sie vorsichtig die Nadel, Fase nach unten, in einem Winkel von ca. 30 ° am inneren Augenwinkel in die Retro-OrbitalSinus. fühlen Druck, Durchdringung und erleichtert Widerstand, sobald die Nadel Einsätze in den Sinus Der Bediener kann: Hinweis. </li><li> Langsam und gleichmäßig injizieren 100 ul anti-Ly6G mAb-Arbeitslösung (5 ug mAb / Maus / Injektion) in der Maus. Entfernen Sie schnell die Nadel. Eine kleine Menge der Blutung schlägt eine erfolgreiche Injektion. </li><li> Sofort 1,25% OX und Fahrzeug-Lösung auf der rechten und linken Mausohren gelten. </li><li> Nach 8 Stunden, zu verwalten 100 ul frisch anti-Ly6G mAb Arbeitslösung vorbereitet (5 ug mAb / Maus / Injektion) über retro-orbitale Injektion in die gleiche Maus. </li><li> Der Blutgefäße, unmittelbar vor der Bildgebung zu visualisieren, zu verwalten 100 ul 30 mg / ml Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) -konjugiertem Dextran (150 kDa) durch retroorbitale Injektionszwecke. </li></ol> 4. Intra Imaging von Neutrophilen-Priming in Pil-1-DsRed Mäuse <ol><li> Anästhesieren Maus mit ip-Injektion von Anästhetikum-Cocktail (2.1).0; Bewerben veterinär Salbe Maus Augen Trockenheit während der Narkose für die Bildgebung zu verhindern. <ol><li> Vorbereitung 1 ml Halbdosis Anästhetikum Cocktail von 500 ul ursprünglichen Anästhetikum Cocktail mit einem gleichen Volumen von PBS verdünnt. </li><li> Übertragen halbe Dosis Betäubungsmittel Cocktail zu 1 ml Spritze mit einem Schmetterling 27-Gauge-Nadel. </li><li> Setzen Sie die Nadel von Schmetterling in Maus Bauch intraperitoneal und befestigen Sie die Schmetterlingsflügel auf den Bauch durch Abkleben. </li></ol></li><li> Legen Sie ein Deckglas in der Mitte der Abbildungsstufe. Kleben der Kanten des Deckglases es in Position zu halten. </li><li> Geben Sie einen Tropfen PBS auf der ventralen Oberfläche des Mausohr sowie auf dem Deckglas. </li><li> Position narkotisierten Maus mit seinem Ohr über das Deckglas. Montieren Sie die Spitze des Ohres, Rückenseite nach unten, gebildet, indem das Ohr zwischen dem Deckglas und einem Glasträger, auch an Ort und Stelle über die Tape gehalten. </li><li> Schalten Sie auf einem Multi-Laser-Fluoreszenz-Konfokalmikroskop und alle damit verbundenen equipment. Schalten Sie die Raumbeleuchtung Umgebungslicht zu minimieren. </li><li> Öffnen Sie die Bildaufnahme-Software. Wählen Sie die Laserkanäle für den Nachweis von Fluoreszenzfarbstoffen im Dye-Listenmenü. </li><li> Stellen Sie den Fokus auf das entzündete Ohr Haut durch Beobachtung der grünen Signale aus den Blutgefäßen und rote Signale von den DsRed + Zellen durch Okular. </li><li> Führen Sie einen schnellen Scan mit Scangeschwindigkeit von 2 &amp; mgr; s / Pixel und einer Auflösung von 512 × 512 Pixeln. Wählen Sie eine Pseudo für jeden Kanal in der Live-View-Menü. Stellen Sie den Fokus Knopf, um das Ende zu setzen und den Ort der Scanvorgang zu starten. </li><li> Führen Sie langsam Scans mit Scangeschwindigkeit von 4 - 8 &amp; mgr; s / Pixel und einer Auflösung von 800 × 800 oder 1024 × 1024 Pixel. Stellen Sie die Hochspannung, Verstärkung und Offset für jeden einzelnen Kanal der Intensität der Signale zu maximieren, während die Sättigung (rote Punkte) zu vermeiden. Es sollte nur wenige rote Pixel in jedem Kanal sein. </li><li> Erstellen dreidimensionaler Bildsätze durch Abtasten the Ohr Haut oberflächlich in das Stratum corneum beginnen und nach unten mit x, y, z Volumen von 317 &amp; mgr; m × 317 &amp; mgr; m × 30 &amp; mgr; m (40X-Objektiv) voran, 635 &amp; mgr; m × 635 &amp; mgr; m × 30 &amp; mgr; m (20fach-Objektiv), oder 1270 &amp; mgr; m × 1270 &amp; mgr; m × 50 &amp; mgr; m (10X-objektiv) bei 2 &amp; mgr; m z-Schritten. HINWEIS: Das Stratum corneum die äußerste Schicht der Epidermis ist und leicht lokalisiert auf seine starke Autofluoreszenz-Signal basieren können. </li><li> Im Zeitraffer-Imaging Experimente, Aufzeichnung dreidimensionale Bilder alle 2 oder 4 min für bis zu 8 Stunden. </li><li> Intermittently, wie Maus aus der Narkose zu erholen beginnt, basierend hinwies, die die Zuckungen Whiskers auf der Beobachtung, verwalten von 5 bis 10 &amp; mgr; l halbe Dosis Narkose Cocktail durch Butterfly-Nadel. HINWEIS: der Anästhesie Dosis vorsichtig - Überdosis verursachen Maus Tod. Alternativ könnte in einem Gefäß Inhalationsanästhesie an der Maus für kurzfristige Anästhesie und angewendet werdenNasenkonus könnte für die Langzeitbilderzeugung verwendet werden. </li><li> Entfernen Sie die narkotisierten Maus von der Bühne bei der Abbildung vollständig ist. Nehmen Sie Band und entfernen Butterfly-Nadel aus dem Bauch der Maus. Bringen Sie die Maus in einen separaten Käfig im Tier Gehäuse Möglichkeiten. HINWEIS: Für kurzfristige Bildgebung (&lt;1 Stunde), Mäuse erholen vollständig aus der Narkose schnell in 1-3 Std. Für die Langzeitbildgebung (~ 8 h), erholen Mäuse langsam, mit einer typischen Erholungszeit von 12 bis 16 Stunden. Somit ist die orale Verabreichung Wasser zumindest mehrmals während der Erholungsphase empfohlen schwerer Dehydrierung zu verhindern. </li><li> Prozess Imaging - Datensätze, einzelne Zellen verfolgen, erzeugen Migrationspfade, und berechnen Sie die Direktionalität und die Geschwindigkeit der Zellmigration unter Verwendung von Bildanalysesoftware 25. </li></ol>

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</ol>

The authors have no financial conflicts of interest.

Das Ziel dieser Studie ist es, eine Technologie zur Überwachung des Prozesses der Neutrophilen-Priming in lebenden Tieren zu entwickeln, die noch nicht von den derzeit verfügbaren Techniken erfüllt. Um dieses Ziel zu erreichen, drei etablierten Methoden durchgeführt werden : 1) Induktion von Hautentzündung in IL-1β Promotor getriebene DsRed Reportermäusen als Maß für die Grundierung, 2) in vivo - Markierung von Neutrophilen mit niedrigen Dosen von Fluoreszenz-konjugiertem anti-Ly6G mAb und 3) intravital konfokalen Mikroskopie. Die Kombination dieser drei Methoden ermöglicht die Visualisierung der frei beweglichen Aktivitäten von grundierten Neutrophilen (DsRed + / Ly6G +) bei entzündlichen Hautveränderungen. Die Wanderungsrichtung und -geschwindigkeit der grundierten Neutrophilen ist ferner über Migrationspfadverfolgung quantifiziert. Durch die Aufnahme einer Reihe von Zeitraffer-Videos, die Echtzeit-Kinetik von grundierten Neutrophilen Entstehung wird durch i bei Entzündungsstelle und den Erwerb von DsRed-Expression überwachtNDIVIDUALSTIPENDIEN Neutrophilen wird auch im extravaskulären Raum beobachtet. Somit wurde der dynamische Prozeß der neutrophilen Priming erfolgreich in lebenden Tier zum ersten Mal visualisiert die Technologie hier vorgestellt werden. Diese Technologie wird in mehreren kritischen Schritte eingesetzt. Erstens sind Hautgewebe die bequemsten Körperteile für intravital Bildgebung. Die topische Anwendung von OX auf der Maus Ohr ermöglicht die direkte Visualisierung von Immunzellen Verhaltensweisen in entzündeter Haut unter der konfokalen Mikroskopie. Zweitens muß die Maus ständig während der Bilderzeugung sediert werden, die wiederholte Injektionen des Anästhetikums erforderlich macht. Über Sedierung kann jedoch dazu führen, Maus sterben während der Bildgebung. Um eine Überdosierung, niedrige Dosen von Anästhetikum (die Hälfte oder ein Drittel der vollen Dosis) zu vermeiden sind für langfristige Bildgebung empfohlen. Drittens Fluoreszenz-konjugierte Neutrophilen-spezifischen mAb müssen intermittierend aufgrund der kurzen Lebensdauer der murine Neutrophilen (Halbwertszeit von 8-10 h 30) injiziert werden. Last, Fokus drift ist ein wichtiges Thema während der Zeitraffer-Bildgebung, die von mehreren Faktoren ab, einschließlich Temperaturschwankungen, Maus Körperbewegung verursacht werden könnten, Ohr im Laufe der Zeit Schwellungen und Schwingungen aus dem Betrieb des Instruments entstehen 31. Verschiedene Verfahren wurden während der Bildgebung, die Festsetzung der Maus Ohr an Ort und Stelle durch Abkleben ein Glasobjektträger über sie auf der Bühne, die Installation einer Klimakammer zu schaffen, Sauerstoff und Wärme in den sediert Driften, wie die Verabreichung einer konstanten Dosis von Sedierung zu verhindern entwickelt Organismus sowie durch manuell erneut Fokussieren des Umfangs bei Bedarf 32,33. Ebenso wichtig ist es, die Grenzen dieses Protokolls zu äußern. Zuerst wird eine langsame Mauswiederherstellung (12 bis 16 h) nach einer Abbildungsperiode 8 h lang ist aufgrund der kontinuierlichen Sedierung beobachtet, was darauf hinweist, dass dieses Protokoll nicht für solche langwierige Experimente geeignet sein können. Ein alternativer Ansatz ist eher mehrere Mäuse in Sequenz über die Abbildungsperiode zu verwenden, als usingen nur einen. Zweitens wird ein allmählicher Leck zirkulierender FITC-Dextran wird während der Bilderzeugung über die Zeit beobachtet, die wahrscheinlich durch eine erhöhte Permeabilität der Hautblutgefäße in der Entzündungszustand 34 hervorgerufen wird. So Darstellung von Blutgefäßen ist deutlich in den späteren Phasen der Bildgebung gegeben reduzierte Fluoreszenz im Umlauf beeinträchtigt. Alternativ kann man fluoreszenz konjugierte Lectine wie isolectin B4 verwenden Blutgefäße zu kennzeichnen , da diese zu den vaskulären endothelialen Zellen 35 anhaften. Neben der Visualisierung des Prozesses der Neutrophilen-Priming in der Haut entzündliche Läsionen, beschrieben die Technologie hier kann auch in vielen anderen experimentellen Bedingungen angewendet werden. In Kombination mit kürzlich entwickelten Abbildungsfenster, werden das Verhalten von grundierten Neutrophilen Intravitalmikroskopie begrenze könnte 36-39 in tiefe Gewebe und Organe , einschließlich Gehirn, Brustdrüse, Lunge und Bauchorgane beurteilt. Außerdem Visualisierung von priming / Aktivierung anderer Zelltypen wie Monozyten und Makrophagen könnte unter Verwendung zusammen mit in - vivo - Markierung durch Fluoreszenz-konjugiertem mAb spezifisch für den Zelltyp von Interesse Pil1-DsRed - Mäusen erreicht. Zusammengenommen nicht nur, dass diese Technologie einen grundlegenden Rahmen für die intravital Bildgebung des Füllvorgang von Neutrophilen in lebenden Tieren, aber es stellt auch neue Ansätze für das Verhalten und die Funktion von anderen Immunzellen in verschiedenen entzündlichen Zuständen studieren in verschiedenen Geweben entfalten.

Neutrophile sind die am häufigsten vorkommenden und kurzlebig Leukozyten im Umlauf. Sie sind schnell zu den Standorten der Infektion oder Verletzung rekrutiert, wo sie als professionelle Phagozyten durch Freisetzung von reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffzwischenprodukte zusammen mit Granulat enthält , um antimikrobielle Peptide und Proteasen 1 dienen. Während ihrer Rekrutierung, sind Neutrophile &quot;grundiert&quot; durch verschiedene Mittel , einschließlich mikrobielle Produkte, Lockstoffe, und inflammatorischen Zytokinen, was zu einer deutlich verbesserten Phagozyten Funktionalität bei der Ankunft an einem Ort der Entzündung 2. Die Mechanismen von Neutrophilen Priming extensiv wurden in vitro untersucht 3,4; jedoch dynamische Überwachung des Prozesses in vivo ist bisher nicht möglich gewesen. Vor kurzem hat intravital Bildgebung eine wichtige Technik zur Visualisierung und Quantifizierung der zellulären Dynamik von biologischen Prozessen in lebenden Organismen werden. Intravital Bildgebung kann über herkömmliche Einphotonenanregung Mikroskopie (zB konfokale) oder Multiphotonen - Mikroskopie Ansätze 5 durchgeführt werden. Im Laufe der Zeit wurden in dieser Technik erzielt deutliche Verbesserungen erhöhte Bildauflösung ermöglicht, eine verbesserte Bildtiefe, verringerte Gewebelichtschäden und eine verbesserte Bildstabilisierung 6,7. Aufgrund seiner einzigartigen Fähigkeit , dynamische Visualisierung von Zellmigration und Interaktion im Laufe der Zeit zu ermöglichen, hat Intravitalmikroskopie wurde 8 verschiedenen Bereichen der Studie in der Immunologie ausgiebig angewendet. Intravital Imaging ermöglicht Immunologen besser zu verstehen und in lebenden Tiermodellen Immunreaktionen sowohl auf zellulärer und molekularer Ebene zu kontextualisieren. Jüngste Fortschritte in der transgenen sowie Knock-in-Reporter Mäusen haben nützliche Tools zur Verfügung gestellt, die dynamischen Verhalten von Neutrophilen in lebenden Tieren, die für die Überwachung. Lysozym M Promotor getriebene Enhanced Green Fluorescent Protein Knock-inMäuse wurden Motilität von Neutrophilen, Monozyten zu charakterisieren und Makrophagen während verschiedener Entzündungsprozessen einschließlich Extravasation, bakterielle Infektion und sterile Entzündung 9-15 breit verwendet. Ferner wurden bei der Untersuchung der Aktivitäten der Neutrophilen extrazellulären regulierten Mitogen - Kinase und Proteinkinase A im entzündeten Darm 16 eingesetzten transgenen Mäusen eine zytoplasmatische Fluoreszenz - Resonanz - Energie - Transfer - Biosensor zum Ausdruck. Ein Mausmodell mit hoher Spezifität für die Fluoreszenz die Expression in Neutrophilen ist die Catchup Knock-in - Maus, die wie auch das fluoreszierende Protein tdTomato Cre - Rekombinase produziert, die sich zur Expression von lymphocyte antigen 6G (Ly6G) 17 gekoppelt ist. Visualisierung von Ly6G-defizienten Neutrophile über diesem Modell hat gezeigt , dass diese Zellen normale Funktionalität in einer Vielzahl von sterilen oder infektiösen in vivo Entzündungs ​​Kontexten ausüben. Transgene Mäuse, die DsRed fluoreszierende p ausdrückenrotein Gen unter der Kontrolle des Maus-interleuikin-1β (IL-1β) -Promotor (Pil1-DsRed) verwendet wurden, um die motile Verhalten von IL-1β produzierenden Zellen sichtbar zu machen - angenommen Neutrophile, inflammatorische Monozyten einschließen und aktivierte Makrophagen - Schwellen in entzündeter Haut 18. In vivo als Alternative dienen zur Verfolgung der zellulären und molekularen Verhalten von Neutrophilen in entzündeten Geweben Markierung kann. Nach intravenöser Injektion von niedrigen Dosen von fluoreszenzmarkierten anti-Gr-1 monoklonalen Antikörpers (mAb), die Rekrutierung Kaskade von Gr-1 + Neutrophilen in Maushautläsionen infiziert mit Staphylococcus aureus 19. In - vivo - Verabreichung von Konjugaten wurde enthaltend visualisiert Streptavidin- konjugiertes 705 nm quantum dots und biotinyliertes anti-Ly6G mAb spezifisch etikettieren zirkulierende Neutrophile 20. Darüber hinaus Endozytose solcher Konjugate in neutrophil Vesikel ermöglicht Verfolgung von Transporthochgeschwindigkeits Vesikel in Neutrophilen in das Interstitium migrieren. In vivo Markierung mit Fluoreszenz-konjugierte Antikörper gegen P-Selektin - Glykoprotein - Ligand-1 (PSGL-1), L-Selectin (CD62L), Integrin &amp; agr; M (CD11b ) und Chemokin (CXC - Motiv) Rezeptor 2 (CXCR2) in einem TNF-induzierten Entzündungsmodell wurde während der frühen Entzündung 21 die Regulationsmechanismen im Spiel erläutert. Polarisiert Neutrophilen herausragen PSGL-1 angereicherte Uropoden mit CD62L sich auf aktivierten Blutplättchen zu interagieren, was bei der Umverteilung von CD11b und CXCR2, Rezeptoren, die die Migration von Neutrophilen treiben und initiieren die Entzündung. IL-1β ist eines der Gene , die Signatur 22 in grundierten Neutrophilen erhöht ist. In Pil1-DsRed Reporter - Mäuse, DsRed Fluoreszenzsignale (dh., Die Aktivierung von IL-1β - Promotor) positiv mit IL-1β - mRNA - Expression und IL-1β Protein - Produktion korrelieren. &lt;sup&gt; 18 Zur Überwachung wurde der Prozess der Neutrophilen - Grundierung, ein Intravitalmikroskopie - Verfahren mit Oxazolon (OX) beteiligt Induktion von Hautentzündung entwickelt im Pil1-DsRed Mausmodell folgende in vivo - Markierung von Neutrophilen mit Fluoreszenz-konjugierten anti-Ly6G mAb. Über dieses Modell ist es möglich, das Verhalten und die Funktion der neutrophilen Granulozyten grundiert in Tiermodellen von verschiedenen Krankheiten und Störungen zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>Heparin sodium</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>NDC 63323-540-31</td><td></td></tr><tr><td>ACK lysing buffer</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharides</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4391</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine hydrochloride</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>LLOYD Laboratory</td><td>NADA #139-236</td><td></td></tr><tr><td>Acepromazine</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>ANADA 200-361</td><td></td></tr><tr><td>Hair-removal cream</td><td>Church &amp;amp; Dwight</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A16P4</td><td></td></tr><tr><td>Oxazolone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0753</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody</td><td>BioLegend</td><td>127610</td><td></td></tr><tr><td>U-100 insulin syringe with 28 G needle</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>FITC-CM-Dextran, 150 kDa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74817</td><td></td></tr><tr><td>Butterfly infusion set (27 G needle)</td><td>BD</td><td>387312</td><td></td></tr><tr><td>FACSCalibur cytometer</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellQuest Pro software</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph Software</td><td>Universal Imaging</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

intravital imaging of neutrophil priming using il-1&#946; promoter-driven dsred reporter mice

Neutrophile sind die am häufigsten vorkommenden Leukozyten im menschlichen Blutkreislauf und sind an Entzündungsstellen schnell rekrutiert. Priming ist ein kritisches Ereignis, das die phagozytischen Funktionalität von Neutrophilen erhöht. Obwohl umfangreiche Studien die Existenz und die Bedeutung der neutrophilen Priming während der Infektion und Verletzungen enthüllt haben, bedeutet , diesen Prozess der Visualisierung in vivo nicht erreichbar gewesen. Das Protokoll bereitgestellt wird, ermöglicht die Überwachung des dynamischen Prozesses der Neutrophilen in lebenden Tieren Priming durch drei Methoden kombinieren: 1) Signal DsRed reporter - verwendet als ein Maß für Priming 2) in vivo - Markierung von Neutrophilen - erreicht durch Injektion von Fluoreszenz-konjugiertem anti-lymphocyte antigen 6G (Ly6G) monoklonaler Antikörper (mAb) und 3) intravital konfokale Bildgebung. Oxazolon-induzierte Mausohr Hautentzündung, geeignete Sedierung von Tieren, wiederholte Injektionen von anti-Ly6G mAb und zurück: Mehrere wichtige Schritte sind in diesem Protokoll beteiligtention der Fokusdrift während der Bildgebung. Obwohl einige Einschränkungen beobachtet, wie die Grenze der kontinuierlichen Bilderzeugungszeit (~ 8 h) in eine Maus und das Austreten von Fluorescein-Isothiocyanat-Dextran aus den Blutgefäßen in der Entzündungszustand liefert dieses Protokoll ein Grundrahmen für die intravital Abbilden grundierten Neutrophilen Verhalten und Funktion, die zur Prüfung von anderen Immunzellen in der Maus Entzündungsmodellen leicht erweitert werden kann.

Screening von Pil1-DsRed-Mäusen basiert auf der phänotypischen DsRed Fluoreszenzsignal durch ihre peripheren Blutleukozyten mittels Durchflusszytometrie durchgeführt produziert. LPS - Stimulation bekannt ist IL-1β - Produktion in myeloischen Zellen , einschließlich Neutrophile, Monozyten und dendritischen Zellen 26-28 induzieren. Somit werden isolierte Leukozyten 4 h mit LPS inkubiert vor der Zytometrie Analyse fließen. Myeloischen Zellen für die Zirkulation auf Basis von Zellgröße (FSC) und interne Komplexität (SSC) (Abbildung 1A) 29 und DsRed Signal gemessen wird , in dieser gated Bevölkerung Als nächstes wird Gating gesetzt. Zirkulieren myeloischen Zellen von WT - Mäusen exprimieren minimal DsRed, während die gleichen Zellen von Pil1-DsRed Mäuse exprimieren unterscheidbare DsRed Signale (1B). Die Pil1-DsRed Mäusen durch dieses Verfahren identifiziert werden Phänotypisierung für nachfolgende Experimente verwendet. Es sollte beachtet werden, dass die vollständige Phänotypisierung Vorgang dauert nur wenigeStunden - viel kürzer als die traditionelle Genotypisierungsmethoden einschließlich Gewebeernte, enzymatische Verdauung, DNA-Isolierung, PCR und Elektrophorese. IL-1β Promotoraktivierung wurde kürzlich als ein Marker der neutrophilen Grundieren 22 identifiziert. Somit kann der dynamische Prozess der Neutrophilen Priming visualisiert und in lebenden Tieren bewertet werden unter Verwendung Pil1-DsRed-Mäusen. Zu Entzündungen der Haut, die Haut Sensibilisator OX topisch angewendet wird auf das rechte Ohr von Pil1-DsRed Mäuse und Vehikel allein angewendet wird auf dem linken Ohr des gleichen Tier induzieren. An Neutrophile in lebenden Tieren, ein kürzlich entwickeltes Protokoll Label wird durch Verabreichung einer kleinen Menge von fluoreszenzmarkierten anti-Ly6G mAb unmittelbar vor und 8 Stunden nach der OX-Anwendung durchgeführt. Um die Blutgefäße, FITC-Dextran finden unmittelbar vor der Bildgebung injiziert. Bei 24 Stunden nach der OX-Anwendung eingroße Anzahl von DsRed + / Ly6G + Zellen werden im Extravasalraum (2A) gefunden und Neutrophile repräsentieren grundiert. Eine kleine Anzahl von DsRed / Ly6G + Zellen werden auch gefunden, was höchstwahrscheinlich Ruhe Neutrophile darstellen. Darüber hinaus ist eine kleine Population von DsRed + / Ly6G - Zellen beobachtet werden, die Entzündungs ​​Monozyten und aktivierten Makrophagen umfassen. In einer 40 Minuten Zeitraffer-Video, Ly6G + Emerging Neutrophilen innerhalb einer entzündlichen Hautläsionen zeigen typische amöbenartigen kriechenden Bewegung (Supplemental Film 1). Zellmigrationspfade verfolgt motile Verhalten des DsRed vergleichen + / + und Ly6G DsRed - / + Ly6G neutrophil Populationen (2B). Die Strecke Plot - Analysen zeigen , dass beide Neutrophilen Populationen &quot;random&quot; Migration angezeigt werden, wenn der extrazellulären Raum (Abbildung 2C) eingegeben wurde. Interessant,DsRed + / Ly6G + Neutrophilen zeigen eine deutlich höhere Geschwindigkeit im Vergleich zu ihren DsRed - / Ly6G + Kollegen (2D). Dies legt nahe, einen Zusammenhang zwischen der Neutrophilen-Grundierung und beschleunigte Motilität bei entzündlichen Läsionen. Um den Zeitpunkt der Neutrophilen - Priming überwachen, eine Serie von Zeitraffer-Videos wurden zu verschiedenen Zeiten nach der OX - Behandlung erfasst Die (Supplemental Filme 2-4). DsRed - / Ly6G + Zellen, die ruhenden Neutrophilen, im Extravasalraum nachweisbar werden so früh wie 8 bis 12 Stunden nach der OX - Anwendung und ihre Zahl relativ niedrig bleiben danach (Abbildung 2E, Supplemental Filme 3, 4). Im Gegenteil, die Anzahl der DsRed + / Ly6G + -Zellen steigen die grundierte Neutrophilen, progressiv zu späteren Zeitpunkten, beginnend bei 14 bis 16 Stunden nach der OX - Anwendung. Einige DsRed <sup&gt; - / Ly6G + Zellen allmählich DsRed Signale nach der Einstellung Extravasalraum während dieser Zeit (2F, Supplemental Film 5) erwerben. Bei 16 bis 20 h, eine Mehrheit der extravaskulärem Ly6G + Neutrophilen werden als &quot;grundiert&quot; betrachtet auf der Grundlage ihrer DsRed Ausdruck. Diese Beobachtungen zeigen, die Größe, das Tempo und die Lage der neutrophilen Priming bei entzündlichen Läsionen in lebenden Tieren auftreten. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54070/54070fig1.jpg" /> Abb . 1: Phänotypisierung von Pil1-DsRed Mäuse (A) Durchflusszytometrie analysiert eine Population von zirkulierenden myeloischen Zellen nachweisen (G1) auf Basis von FSC und SSC - Parameter. (B) Histogramme im FL2 - Kanal zeigen den Anteil der DsRed + Zellen innerhalb G1 Gate der Zellen von Pil-DsRed Mäuse (rot) oder von WT - Mäusen (blau). Die Daten sind repräsentativ für bei least drei unabhängigen Experimenten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54070/54070fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54070/54070fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54070/54070fig2.jpg" /> Abbildung 2:. Visualisierung von Motile Aktivitäten von DsRed + / Ly6G + Neutrophile bei chronisch entzündlichen Hautveränderungen (A) Statische konfokalen Mikroskopie - Aufnahmen aufgezeichnet 24 Stunden nach der OX - Behandlung zeigen drei Leukozyten - Populationen in den extravaskulären Raum, das heißt DsRed + / Ly6G + Zellen. (Sternchen), DsRed - / Ly6G + Zellen (Dreiecke) und DsRed + / Ly6G - Zellen (Pfeile). Bar = 20 &amp; mgr; m. DsRed + / Ly6G + Zellen (rot) und DsRed - / Ly6G + Zellen (blau) für migrato verglichenry Wege (B), Track Plots (C) und die Geschwindigkeit (D) von einer 40 min Zeitraffer-Film durch konfokale Mikroskopie aufgenommen 24 Stunden nach der OX - Anwendung starten (Supplemental Film 1). (D) Die Balken zeigen Geschwindigkeitswerte bedeuten. *** P &lt;0,001. (E) Die Zahl der DsRed + / Ly6G + Zellen und DsRed - / Ly6G + Zellen werden aus einer Reihe von Zeitraffer-Filme zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der OX - Anwendung (Supplemental Filme 2 bis 4) aufgezeichnet gezählt. Die gezeigten Daten sind die Zellzahlen / mm 2 (Mittelwert ± SD) berechnet aus drei aufeinanderfolgenden Bildern. (F) Statische Bilder sind aus einem Zeitraffer-Film 11 bis 14,5 Stunden nach der OX - Malerei (Supplemental Film 5) aufgezeichnet erstellt. Der Pfeil zeigt eine Ly6G + Zelle , die DsRed - Expression im Extravasalraum während des Beobachtungszeitraums erfasst.Bar = 50 &amp; mgr; m. Bilder reproduziert werden aus Referenz 22 mit freundlicher Genehmigung (Urheberrecht 2015. Die American Association of Immunologen, Inc.). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54070/54070fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54070/54070fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> . Supplemental Film 1: Motile Verhalten von DsRed + Neutrophile bei chronisch entzündlichen Hautveränderungen (bei ​​24 Stunden nach der OX Malerei) konfokale Mikroskopie - Bilder zeigen die Motilität von DsRed + / Ly6G + Zellen (pink) und DsRed - / Ly6G + Zellen (blau) in Extravasalraum. Die Blutgefäße sind in grüner Farbe gesehen. Bar = 20 &amp; mgr; m. Das Video von der Referenz 22 mit freundlicher Genehmigung (Urheberrecht 2015. Die American Association of Immunologen, Inc.) wiedergegeben wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54070/54070video1.mov" target="_blank">Bitte cl</a>ick hier, um dieses Video anzusehen. . Supplemental Movie 2: Motile Verhalten von DsRed + Neutrophile bei chronisch entzündlichen Hautveränderungen (bei ​​4 Stunden nach der OX Malerei) konfokale Mikroskopie - Bilder zeigen DsRed + / Ly6G + Zellen (pink) und DsRed - / Ly6G + Zellen (blau) im Extravasalraum . Die Blutgefäße sind in grüner Farbe gesehen. Autofluorescence vorhanden ist und mit Haarfollikeln verbunden. Bar = 100 &amp; mgr; m. Das Video von der Referenz 22 mit freundlicher Genehmigung (Urheberrecht 2015. Die American Association of Immunologen, Inc.) wiedergegeben wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54070/54070video2.mov" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54070/54070video2.mov" target="_blank">dieses Video anzusehen.</a> Supplemental Movie 3: Motile Verhalten von DsRed + Neutrophile in Inf. lammatory Hautveränderungen (bei ​​8 Stunden nach der OX Malerei) konfokale Mikroskopie - Bilder zeigen DsRed + / Ly6G + Zellen (pink) und DsRed - / Ly6G + Zellen (blau) im Extravasalraum. Die Blutgefäße sind in grüner Farbe gesehen. Autofluorescence vorhanden ist und mit Haarfollikeln verbunden. Bar = 100 &amp; mgr; m. Das Video von der Referenz 22 mit freundlicher Genehmigung (Urheberrecht 2015. Die American Association of Immunologen, Inc.) wiedergegeben wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54070/54070video3.mov" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54070/54070video3.mov" target="_blank">dieses Video anzusehen.</a> Supplemental Film 4: Motile Verhalten von DsRed + Neutrophile bei chronisch entzündlichen Hautveränderungen (bei ​​11 bis 19 Stunden nach der OX Malerei) konfokale Mikroskopie - Bilder zeigen DsRed + / Ly6G + Zellen (pink) und DsRed - / Ly6G + Zellen (blau) in der. extravascular Raum. Die Blutgefäße sind in grüner Farbe gesehen. Autofluorescence vorhanden ist und mit Haarfollikeln verbunden. Bar = 100 &amp; mgr; m. Das Video von der Referenz 22 mit freundlicher Genehmigung (Urheberrecht 2015. Die American Association of Immunologen, Inc.) wiedergegeben wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54070/54070video4.mov" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54070/54070video4.mov" target="_blank">dieses Video anzusehen.</a> Supplemental Film 5: Erwerb von DsRed Signale von Ly6G + Neutrophile aus dem Zeitraffer-Film in zusätzlichen Video 4, diese höhere Vergrößerung Video des Prozesses zeigt gezeigt , in dem ein Ly6G + Zelle (mit einem Pfeil angedeutet) erwirbt DsRed - Expression in Extravasalraum. Raum während der Beobachtungsperiode (11-14,5 h nach OX Malerei). Bar = 50 &amp; mgr; m. Das Video wird von Referenz 22 mit freundlicher Genehmigung (Urheberrecht 2015. Die American Association of Im reproduziertmunologists, Inc.). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54070/54070video5.mov" target="_blank">Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzusehen.</a>

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Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

Intravital Imaging von Neutrophilen Priming Mit IL-1β Promoter-driven DsRed Reporter Mäuse

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...

intravital-imaging-neutrophil-priming-using-il-1-promoter-driven

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Serie: Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1β Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Nicht-invasive Bildgebung von Leukozyten Homing und Migration In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the postcapillary venules of inflamed tissue, leukocytes initially tether and roll on the luminal surface of venular wall. Rolling leukocytes arrest on endothelium and undergo firm adhesion in response to chemokine or other chemoattractants on the venular surface. Many adherent leukocytes relocate from the initial site of adhesion to the junctional extravasation site in endothelium, a process termed intraluminal crawling3. Following crawling, leukocytes move across endothelium (transmigration) and migrate in extravascular tissue toward the source of chemoattractant (chemotaxis)4. Intravital microscopy is a powerful tool for visualizing leukocyte-endothelial cell interactions in vivo and revealing cellular and molecular mechanisms of leukocyte recruitment2,5. In this report, we provide a comprehensive description of using brightfield intravital microscopy to visualize and determine the detailed processes of neutrophil recruitment in mouse cremaster muscle in response to the gradient of a neutrophil chemoattractant. To induce neutrophil recruitment, a small piece of agarose gel (~1-mm3 size) containing neutrophil chemoattractant MIP-2 (CXCL2, a CXC chemokine) or WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, a synthetic analog of bacterial peptide) is placed on the muscle tissue adjacent to the observed postcapillary venule. With time-lapsed video photography and computer software ImageJ, neutrophil intraluminal crawling on endothelium, neutrophil transendothelial migration and the migration and chemotaxis in tissue are visualized and tracked. This protocol allows reliable and quantitative analysis of many neutrophil recruitment parameters such as intraluminal crawling velocity, transmigration time, detachment time, migration velocity, chemotaxis velocity and chemotaxis index in tissue. We demonstrate that using this protocol, these neutrophil recruitment parameters can be stably determined and the single cell locomotion conveniently tracked in vivo.

We describe a protocol of brightfield intravital microscopy for measuring dynamic neutrophil-endothelial cell interactions during neutrophil recruitment in response to the source of a neutrophil chemoattractant in vivo. Neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in mouse cremaster muscle tissue are visualized with time-lapsed video photography and tracked with ImageJ.

Tracking-Neutrophil Intraluminale Crawling, transendotheliale Migration und Chemotaxis in Tissue durch Intravital Video-Mikroskopie

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Hochaufgelöste Intravitalmikroskopie Striped-Beleuchtung von Keimzentren

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Abbilden Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen von Intravitalmikroskopie an narkotisierten Ratten in Echtzeit

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

Imaging CD4 T-Zell-Interstitial Migration in den entzündeten Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new transgenic reporter mouse model. We chose to visualize interleukin (IL) 22 gene expression because this cytokine has important activities in the intestine, where it contributes to repair tissues damaged by inflammation. Reporter systems offer considerable advantages over other methods of identifying products in vivo. In the case of IL-22, other studies had first isolated cells from tissues and then re-stimulated the cells in vitro. IL-22, which is normally secreted, was trapped inside cells using a drug, and intracellular staining was used to visualize it. This method identifies cells capable of producing IL-22, but it does not determine whether they were doing so in vivo. The reporter design includes inserting a gene for a fluorescent protein (tdTomato) into the IL-22 gene in such a way that the fluorescent protein cannot be secreted and therefore remains trapped inside the producing cells in vivo. Fluorescent producers can then be visualized in tissue sections or by ex vivo analysis through flow cytometry. The actual construction process for the reporter included recombineering a bacterial artificial chromosome that contained the IL-22 gene. This engineered chromosome was then introduced into the mouse genome. Homeostatic IL-22 reporter expression was observed in different mouse tissues, including the spleen, thymus, lymph nodes, Peyer&#39;s patch, and intestine, by flow cytometry analysis. Colitis was induced by T-cell (CD4+CD45RBhigh) transfer, and reporter expression was visualized. Positive T cells were first present in the mesenteric lymph nodes, and then they accumulated inside the lamina propria of the distal small intestine and colon tissues. The strategy using BACs gave good-fidelity reporter expression compared to IL-22 expression, and it is simpler than knock-in procedures.

We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.

Visualisierung von IL-22-exprimierenden Lymphozyten unter Verwendung Reporter Mäuse

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the pro-inflammatory capabilities of various factors is challenging and requires terminal procedures, such as bronchoalveolar lavage and the removal of lungs for in situ analysis, precluding longitudinal visualization in the same mouse. Here, lung inflammation is induced through the intratracheal instillation of Pseudomonas aeruginosa culture supernatant (SN) in transiently transgenized mice expressing the luciferase reporter gene under the control of a heterologous IL-8 bovine promoter. Luciferase expression in the lung is monitored by in vivo bioluminescent image (BLI) analysis over a 2.5- to 48-h timeframe following the instillation. The procedure can be repeated multiple times within 2 - 3 months, thus permitting the evaluation of the inflammatory response in the same mice without the need to terminate the animals. This approach permits the monitoring of pro- and anti-inflammatory factors acting in the lung in real time and appears suitable for functional and pharmacological studies.

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

The method described here allows for the visualization of IL-8 promoter-dependent inflammation activation in the lungs of mice through non-invasive bioluminescence imaging (BLI). The same animal can be subjected to BLI multiple times for up to two months from the time of delivery of the luciferase reporter construct.

Ein IL-8 transientes transgenisiertes Mausmodell für die<em&gt; In vivo</em&gt; Langzeitüberwachung von entzündlichen Reaktionen

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice

Neutrophils are a major member of the innate immune system and play pivotal roles in host defense against pathogens and pathologic inflammatory reactions. Neutrophils can be recruited to inflammation sites via the guidance of cytokines and chemokines. Overwhelming infiltration of neutrophils can lead to indiscriminate tissue damage, such as in rheumatoid arthritis (RA). Neutrophils isolated from peritoneal exudate respond to a defined chemoattractant, N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), in vitro in Transwell or Zigmond chamber assays. The air pouch experiment can be used to evaluate the chemotaxis of neutrophils towards lipopolysaccharide (LPS) in vivo. The adjuvant-induced arthritis (AA) mouse model is frequently used in RA research, and immunohistochemical staining of joint sections with anti-myeloperoxidase (MPO) or anti-neutrophil elastase (NE) antibodies is a well-established method to measure neutrophil infiltration. These methods can be used to discover promising therapies targeting neutrophil migration.

Here, we present three methods to assess neutrophil migration and infiltration both in vivo and in vitro. These methods can be used to discover promising therapeutics targeting neutrophil migration.

Erkennung von Migration und Infiltration von Neutrophilen bei Mäusen

Neutrophils are a major member of the innate immune system and play pivotal roles in host defense against pathogens and pathologic inflammatory reactions. ...

Biologie

Imaging Neutrophil Migration in the Mouse Skin to Investigate Subcellular Membrane Remodeling Under Physiological Conditions

The study of immune cell recruitment and function in tissues has been a very active field over the last two decades. Neutrophils are among the first immune cells to reach the site of inflammation and to participate in the innate immune response during infection or tissue damage. So far, neutrophil migration has been successfully visualized using various in vitro experimental systems based on uniform stimulation, or confined migration under agarose, or micro-fluidic channels. However, these models do not recapitulate the complex microenvironment that neutrophils encounter in vivo. The development of multiphoton microscopy (MPM)-based techniques, such as intravital subcellular microscopy (ISMic), offer a unique tool to visualize and investigate neutrophil dynamics at subcellular resolutions under physiological conditions. In particular, the ear of a live anesthetized mouse provides an experimental advantage to follow neutrophil interstitial migration in real-time due to its ease of accessibility and lack of surgical exposure. ISMic provides the optical resolution, speed, and depth of acquisition necessary to track both cellular and, more importantly, subcellular processes in 3D over time (4D). Moreover, multi-modal imaging of the interstitial microenvironment (i.e., blood vessels, resident cells, extracellular matrix) can be readily accomplished using a combination of transgenic mice expressing select fluorescent markers, exogenous labeling via fluorescent probes, tissue intrinsic fluorescence, and second/third harmonic generated signals. This protocol describes 1) the preparation of neutrophils for adoptive transfer into the mouse ear, 2) different settings for optimal sub-cellular imaging, 3) strategies to minimize motion artifacts while maintaining a physiological response, 4) examples of membrane remodeling observed in neutrophils using ISMic, and 5) a workflow for the quantitative analysis of membrane remodeling in migrating neutrophils in vivo.

Neutrophil migration relies on the rapid and continuous remodeling of the plasma membrane in response to chemoattractant and its interactions with the extracellular microenvironment. Described herein is a procedure based on Intravital Subcellular Microscopy to investigate the dynamic of membrane remodeling in neutrophils injected in the ear of anesthetized mice.

Bildgebung der Migration von Neutrophilen in der Maushaut zur Untersuchung des subzellulären Membranumbaus unter physiologischen Bedingungen

The study of immune cell recruitment and function in tissues has been a very active field over the last two decades. Neutrophils are among the first ...

Monitoring Neutrophil Recruitment Dynamics and Bacterial Burden at the Infection Site in a Murine Model

Source: Anderson, L. S., et al. <a href="https://app.jove.com/v/59015">A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates in vivo imaging to study the neutrophil recruitment dynamics at an infection site in an immunocompromised, transgenic mouse with GFP-expressing neutrophils. It involves injecting luminescent bacteria to cause an infection. This leads to neutrophil recruitment to the infection site, whose tracking is done by imaging.

Intravital Imaging von Neutrophilen Priming Mit IL-1β Promoter-driven DsRed Reporter Mäuse

Zusammenfassung

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