Vorbereitung Mikrofluidiksysteme Für Neuron Cell Culture 1) Reinigen Corning No.1 24 mm X 40 mm Glasplättchen <ul><li> Mit Ultraschall die Glasträger in einem Wasserbad Sonicator für 30 Minuten </li><li> Spülen Sie das Glas-Objektträger mit 70% EtOH </li><li> Waschen Sie die Objektträger dreimal mit dH 2 O </li><li> Dry Folien in einer Gewebekultur Haube für mehrere Stunden, am besten über Nacht </li></ul> Hinweis: Wir haben spezielle Metall-Schalen, die wir mit den Schlitten zu laden. Die Folien sind einzeln und getrennt platziert in die Schlitze in das Metallgestell. Wir können dann diese Metall-Be-Trays in einer Glasschale, dass wir mit Wasser, in das Wasser Ultraschallbad zu füllen, und beschallen für 30 Minuten. Nachfolgende Waschungen sind in diesem Gericht durchgeführt. 2) Vorbereitung der PDMS-Geräte <ul><li> Schneiden Sie die PDMS Form aus dem Silizium-Wafer, Löcher stanzen in der PDSM gegossen und Quartal ist </li><li> Reinigen Sie die PDMS-Geräten, indem Sie zuerst weht Inertgas (Argon oder Stickstoff) über sie. Dann nutzen Sie 3M Scotch Brand Tape 471 zum Abheben alle Reste </li></ul> Hinweis: Es ist wichtig, dass die Geräte nach oben. Anfangs, als wir die PDMS abgeschnitten von der Silizium-Wafer, ist die Seite in Kontakt mit dem Wafer der sauberen Seite: Sie enthält die mikrofluidischen Kanälen. Wir versuchen, so vorsichtig wie wir als nicht beschädigen kann, um das Gerät, und halten Sie die saubere Seite nach oben, bis wir bereit für Plasma-Bindung sind. <ul><li> Autoclave Geräte in Kunststoff-Behältern </li><li> Nach dem Autoklavieren, saubere Nr. 1 Corning Glasträger und Plasma-treat-Geräte mit einem Harrick Marke Plasma-Reiniger, <a href="http://www.harrickplasma.com/" target="_blank">www.harrickplasma.com</a> </li><li> Platzieren Sie die Geräte sauber nach unten auf die Glasplatte. </li></ul> Das Gerät ist nun Plasma gebunden an das Glas gleiten. 3) Beschichtung Die Geräte mit Poly-L-Lysin (PLL) <ul><li> PLL ist es, eine gut auf jeder Seite des Gerätes zugegeben und durch in den nächsten gut fließen </li></ul> =&gt; 150 ul PLL für den großen Brunnen und 30 μ l PLL für die kleineren Brunnen. Es muss nicht exakt sein, solange der Brunnen voll sind. Hinweis: Wenn Sie an einem Gerät schauen, werden Sie 4 Brunnen sehen: jeweils zwei miteinander verbunden sind. Sie wollen die PLL in einem gut so, dass es durch das Gerät in den nächsten gut fließen gebracht. <ul><li> Lassen Sie die PLL durch das Gerät für etwa 10 Minuten fließen und fügen Sie dann weitere PLL um den Brunnen, um sie aufzufüllen </li><li> Platzieren Sie die Geräte mit PLL in einem Brutschrank bei 37 ° C für mindestens 4 Stunden (über Nacht ist vorzuziehen) </li><li> Vacuum das überschüssige PLL nach der Behandlung, aber darauf achten, nicht die gesamte Flüssigkeit saugen aus dem Gerät </li></ul> Hinweis: Sie wollen nicht, um Luftblasen zu den Kanälen oder Kammer einzuführen. Nur Vakuum das überschüssige PLL in die Vertiefungen geben. <ul><li> Add autoklaviert dH 2 O in jede Vertiefung auf beiden Seiten des Gerätes, und lassen Sie die anderen auch durch Kapillarwirkung fließen </li></ul> Abbildung 1 ist ein Diagramm eines mikrofluidischen Gerät. Beachten Sie, wie die blaue (Soma auf dieser Seite) angeschlossen ist und die Red (Axonal auf dieser Seite) verbunden sind. Wenn wir sagen, setzen die PLL, oder Wasser oder Medien, auf der einen sowie auf jeder Seite des Gerätes, was wir meinen, ist zum Beispiel: Platz 150 ul autoklaviertem dH 2 O in einem Blau Na dann statt 150 ul autoklaviert dH 2 0 in einem Red Well. Das Wasser (oder PLL, oder Media, oder Zellen) werden durch das Gerät mit dem anderen entsprechenden gut fließen. <img src="/files/ftp_upload/old/410_2008_8_27_3/410_Figure-01.png" alt="Abbildung 1" width="362" height="216" /> Abbildung 1 Hinweis: Bitte beachten Sie, dass von nun an, wenn ich sage &quot;Platz Medien, Zellen-, Wasser-oder PLL in die TOP Brunnen&quot;, I, um das Diagramm oben, wo der Soma würde auf der linken Seite und die Axone beziehe mich wird das Wachstum rechts. <ul><li> Absaugen des Wassers (wieder darauf achten nicht vollständig entfernen Sie die Flüssigkeit aus dem Gerät), dann fügen Sie eine weitere 150 ul autoklaviert dH 2 O zu einer jeden angeschlossenen gut und lassen Sie ihn durchströmen, um den entsprechenden Schacht. </li><li> Stellen Sie das Gerät mit dH 2 O in einem Brutschrank bei 37 ° C für 1 Stunde, dann wiederholen Sie den Waschvorgang wieder. Waschen Sie die Geräte dreimal mit dH 2 O für jeweils eine Stunde, die die Summe ist. </li></ul> Hinweis: Aufgrund der Möglichkeit, dass Borat von der PLL in die PDMS absorbieren, einige in der Jeon Lab empfehlen Inkubation der Geräte über Nacht mit autoklaviertem dH 2 O nach ein paar initial schnelle spült. Dadurch wird sichergestellt, dass alle freien Borat wird Lauge aus dem PDMS vor dem Laden der Zellen. Wenn dies nicht geschieht, kann es zu einer Freisetzung von Borat in den Medien über die Zeit, die Zytotoxizität führen könnte. <ul><li> Add Neural Basal Media (NBM) mit den notwendigen Faktoren (Glutamax, B27, PenStrep) an die Spitze Brunnen </li></ul> Hinweis: Die Geräte können über Nacht inkubiert und verchromt mit Zellen am nächsten Tag, oder inkubiert ein Minimum von 3 Stunden mit NMB + Faktoren vor dem Ausplattieren der Zellen. Vorbereiten des Neurons zum Laden in die Geräte Wir verwenden 18 Tage alten Fötus Rattencortex, dass wir entweder von einer Firma namens Brain-Bits oder das ist hier auf dem Campus für uns vorbereitet zu kaufen. Wir bevorzugen es, sich das Gewebe frisch. <ol><li> Erhalten 1 fetalen Hirnrinde (2 Stück Gewebe) in Hibernate E gespeichert </li><li> Take 3 lange Glaspipetten und Feuer sie jeweils in immer kleinere Größen mit einem Alkohol-Lampe </li><li> entfernen Gewebe von Hibernate E mit einer Glaspipette und in 2 ml NMB + Factors in einem sterilen 15 ml Tube. </li><li> Trituration: Mit einer Glühbirne und Glaspipette der Kortex auf und ging hinunter zu 5 bis 10 mal. Dann wird die nächst kleinere Pipette verwendet werden, um Pipette auf und ab des Gewebes. Schließlich ist die kleinste Pipette verwendet werden, um Pipette auf und ab des Gewebes. Wir möchten sicherstellen, dass keine sichtbaren Brocken. Hinweis: Vor kurzem begann die Jeon Lab verglichen Zellen aus dem Gewebe in Hibernate E, um Zellen, die aus Gewebe zunächst mit 0,125% Trypsin in 50% behandelt wurden hergestellt gespeicherten Ca + + frei und Mg + + frei Dissektion Puffer. Der Konsens ist, dass Gewebe hergestellt unter Verwendung von Trypsin Ertrag mehr lebensfähige Zellen als Gewebe zunächst in Hibernate E. platziert Wenn Sie nicht gehen, um das Gewebe sofort verwenden, dann müssen Sie das Gewebe in Hibernate E. speichern Wenn Sie vorhaben, das Gewebe sofort einsatzbereit sind und würde höhere Rentabilität mögen, dann behandeln das Gewebe mit Trypsin vor der mechanischen Zerkleinerung wie folgt: 1) verdünnt 1 ml 0,25% Trypsin (Gibco, Invitrogen) mit 1 ml Ca + + freie Mg + + frei Dissektion Puffer (final Trypsin = 0,125%) in eine 15 ml Tube (keep eiskalt), 2) Platz Gewebe in Puffer und Inkubation sofort bei 37 ° C für 8 Minuten, 3) 10 ml DMEM/10% FBS bis zum Anschlag Trypsin-Reaktion und weiter-Protokoll unten. </li><li> Centrifuge Zellen bei 1100 rpm für 1 Minute </li><li> Aspirated Medien vorsichtig von der Zellpellet </li><li> 1 ml der NMB + Faktoren auf die Pellet-und resuspendiert sie durch Auf-und Abpipettieren </li><li> Pass den resuspendierten Zellen durch die Schwerkraft fließen durch einen Filter, um alle Klumpen zu entfernen (BD Falcon Zellsieb 40 um Nylon) </li><li> Graf und Platte-Zellen: <ul><li> In ein Mikrozentrifugenröhrchen, fügen Sie 60 ul NMB + Faktoren, 20 ul Zellsuspension und 20 ul Trypanblau dann mischen </li><li> Etwa 10 ul dieser Lösung auf eine Zählkammer und zählen die Live-Zellen (nicht blau) </li><li> Adjust Konzentration von 2,5 bis 4,5 x10 6 Zellen / ml Hinweis: Wir in der Regel erhalten eine Konzentration von etwa 2,5 bis 4,5 x 106 Zellen / ml. je nach Umfang werden die Zellen in (in der Regel 1 ml NBM + B27/Glutamax/PenStrep percortex) resuspendiert. Wenn das Gewebe mit Trypsin hergestellt wurde, wird die Ausbeute wahrscheinlich erhöht werden. </li></ul></li></ol> Plating Die Geräte <ol><li> Wägezellen (primären Neuronen) in einem Brunnen des Gerätes </li><li> Plate 5 ul pro kleines Gerät und 20 ul pro big Gerät Hinweis: Sie können 10 ul der Zellen auf der Oberseite des Geräts und 10 ul auf der Unterseite des Geräts (die Hälfte Gesamtvolumen) zu laden, oder direkt alle 20 ul der Zellen in der oberen Somal gut (5 ul in der oberen Somal gut für die kleinen Geräte). </li><li> Inkubieren für 10 Minuten bei 37 ° C Inkubator so Zellen beginnen zu befestigen </li><li> Add etwa 150/30 ul NMB + Faktoren in jede Vertiefung je nach Gerätegröße Hinweis: Volumes kann je nach der Dicke des PDMS. Alles, was zählt ist, dass die Brunnen voll sind. </li></ol> Zusätzliche On Mit die Geräte ohne Plasma Bonding Ohne Plasmabehandlung, sagt Christina Tu, ein Techniker, der es erfolgreich jede Woche ohne Plasma, laden Sie einfach die Zellen sofort. Denken Sie daran, die Medien aus beiden Brunnen auf dem Soma-Seite (Axon Seite keine Rolle, ob Sie die Medien in Urlaub) zu entfernen. Es ist die Strömung, die die Zellen zum Hauptkanal eingeben können. Wenn Sie Medien in den Vertiefungen haben, werden Sie nicht bekommen Strömung.

<ol>
	<li>Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research.">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nat Protoc. 1 (4), 2128-2136 (2006).</li><li>Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury,+regeneration+and+transport.">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nat Methods. 2 (8), 599-605 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Hier haben wir gezeigt, wie man das Neuron Mikrofluidikvorrichtung, ohne dass ein Plasma Cleaner zu verwenden. Wir bezeichnen dies als Nicht-Plasma-Bindung.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>PDMS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sylgard 184 with curing agent Please consult Dow Corning to find a vendor near you</td>
</tr>
<tr>
<td>Cornig No. 1 Cover Glass</td>
<td>Cover Glass</td>
<td>Corning</td>
<td>Corning No. X2935 244</td>
<td>Available through Fisher Scientific, Fish Catalog number 12-531D</td>
</tr>
<tr>
<td>B27</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504-044</td>
<td>B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.</td>
</tr>
<tr>
<td>Glutamax</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>35050-061</td>
<td>Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents.</td>
</tr>
<tr>
<td>60 mm Petri Dish</td>
<td>Tool</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-757-13A</td>
<td>60 mm polystyrene sterile petri dishes are used to house the device bound to glass.</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-L-Lysine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-1274</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Falcon 50 ml Tube</td>
<td>Tool</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>Falcon No. 352098</td>
<td>Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-49A</td>
</tr>
<tr>
<td>BD Falcon 15 ml tube</td>
<td>Tool</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>Falcon No. 352097</td>
<td>Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>
			<div>
					</div>

non-plasma bonding of pdms for inexpensive fabrication of microfluidic devices

In diesem Video zeigen wir, wie man das Neuron Mikrofluidikvorrichtung ohne Plasma Bindung verwenden. In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, reversibel Bindung Geräte mit dem Corning Nr. 1 Deckglas. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, vielleicht, um ein Plasma-Reiniger nicht zur Verfügung steht. In anderen Fällen kann es wünschenswert sein, das Gerät aus dem Glas zu entfernen, nachdem die Züchtung von Neuronen für bestimmte Arten der Mikroskopie oder Immunfärbung, obwohl es nicht notwendig ist, um das Gerät für Immunfärbung, da die Neuronen in das Gerät gefärbt werden können entfernen. Einige Forscher, aber immer noch lieber auf das Gerät zu entfernen. In diesem Fall macht reversible Bindung des Gerätes an das Deckglas, das möglich ist. Es gibt einige Nachteile auf Nicht-Plasma-Bindung der Geräte in die nicht so dicht an einer Dichtung gebildet wird. In einigen Fällen Axone kann unter den Rillen statt durch sie zu wachsen. Auch, weil das Glas und PDMS hydrophob sind, tun Flüssigkeiten nicht ohne weiteres in das Gerät eindringen macht es notwendig sein, um Medien und anderen Reagenzien in das Gerät zu erzwingen. Flüssigkeiten wird das Gerät durch Kapillarwirkung geben, aber es dauert wesentlich länger als im Vergleich zu Geräten, Plasma gebunden gewesen. Die Plasma-Reiniger temporäre hydrophile Ladungen auf der Glas-und Gerät, das den Durchfluss von Flüssigkeiten über das Gerät zu erleichtern nach der Verklebung innerhalb von Sekunden. Für Nicht-Plasma-Geräte gebunden, nimmt Flüssigkeit durch die Geräte mehrere Minuten dauern. Es ist auch wichtig zu beachten, dass die Geräte mit den Nicht-Plasma verwendet werden Verklebung müssen zuerst sterilisiert werden, während Plasma behandelt Geräte müssen sich nicht vor Anwendung sterilisiert werden soll, weil das Plasma Reiniger sie abzutöten ist.

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Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices

In diesem Video zeigen wir, wie der Neuron Mikrofluidikvorrichtung ohne Plasma Bindung verwenden.

Non-Plasma-Bonding von PDMS für preiswerte Herstellung von Mikrofluidik-Geräte

In this video, we demonstrate how to use the neuron microfluidic device without plasma bonding.  In some cases it may be desirable to reversibly bond ...

non-plasma-bonding-pdms-for-inexpensive-fabrication-microfluidic

Research

JoVE Journal

Biology

34.3K Aufrufe.  University of California, Irvine (UCI). In diesem Video zeigen wir, wie der Neuron Mikrofluidikvorrichtung ohne Plasma Bindung verwenden.

Serie: Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for culturing neurons. Previously, a silicon wafer was patterned with the design for the neuron microfluidic device using SU-8 and photolithography to create a master mold, or what we simply refer to as a "master". Next, we pour the silicon polymer PDMS on top of the master which is then cured by heating the PDMS to 80&deg;C for 1 hour. The PDMS forms a negative mold of the device. The PDMS is then carefully cut and lifted away from the master. Holes are punched where the reservoirs will be and the excess PDMS trimmed away from the device. Nitrogen is used to blow away any excess debris from the device. At this point the devices are now ready for use and can either bonded to corning No. 1 cover glass with a plasma sterilizer/cleaner or can be reversibly bound to the cover glass by simply placing the device on top of the cover glass. The reversible bonding of the device to glass is covered in a separate video and requires first that the device be sterilized either with 70% ethanol or by autoclaving. Plasma treating sterilizes the devices so no further treatment is necessary. It is, however, important, when plasma-treating the devices, to add liquid to the devices within 10 minutes of the plasma treatment while the surfaces are still hydrophilic. Waiting longer than 10 minutes to add liquid to the device makes it difficult for the liquid to enter the device. The neuron devices are typically plasma-bound to cover glass and 0.5 mg/ml poly-L-lysine (PLL) in pH 8.5 borate buffer is immediately added to the device. After a minimum of 3 hours incubating with PLL, the devices are washed with dH2O water a minimum of 3 times with at least 15 minutes between each wash. Next, the water is removed and fresh media is added to the device. At this point the device is ready for use. It is important to remember at this point to never remove all the media from the device. Always leave media in the main channel.

In this video we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to farbricate a microfluidic device for culturing neurons.

Herstellung eines mikrofluidischen Vorrichtung für die Abschottung der Neuron Soma und Axonen

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

Forschung

Biologie

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

Ein Gradient-Erzeugung Mikrofluidikvorrichtung für Zellbiologie

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

PDMS Device Fabrication and Surface Modification

PDMS Bauelementherstellung und Oberflächenmodifizierung

Fabrication of the Thermoplastic Microfluidic Channels

In our lab, we have successfully isolated nucleic acids directly from microliter and submicroliter volumes of human blood, urine and stool using polymer/nanoparticle composite microscale lysis and solid phase extraction columns. The recovered samples are concentrated, small volume samples that are PCRable, without any additional cleanup. Here, we demonstrate how to fabricate thermoplastic microfluidic chips using hot embossing and heat sealing. Then, we demonstrate how to use in situ light directed surface grafting and polymerization through the sealed chip to form the composite solid phase columns. We demonstrate grafting and polymerization of a carbon nanotube/polymer composite column for bacterial cell lysis. We then show the lysis process followed by solid phase extraction of nucleic acids from the sample on chip using a silica/polymer composite column. The attached protocols contain detailed instructions on how to make both lysis and solid phase extraction columns.

Here we demonstrate how to fabricate thermoplastic microfluidic chips using hot embossing and heat sealing. Then we demonstrate how to use in situ light directed surface grafting and polymerization through the sealed chip to form the composite solid phase columns.

Die Herstellung der thermoplastischen Mikrofluidikkanälen

In our lab, we have successfully isolated nucleic acids directly from microliter and submicroliter volumes of human blood, urine and stool using ...

Microfluidic Applications for Disposable Diagnostics

In this interview, Dr. Klapperich discusses the fabrication of thermoplastic microfluidic devices and their application for development of new diagnostics.

In this interview, Dr. Klapperich discusses the fabrication of thermoplastic microfluidic devices and their application for development of new diagnostics.

Mikrofluidik-Anwendungen für Einweg-Diagnostics

In this interview, Dr. Klapperich discusses the fabrication of thermoplastic microfluidic devices and their application for development of new ...

Fabrication of Amperometric Electrodes

Carbon fiber electrodes are crucial for the detection of catecholamine release from vesicles in single cells for amperometry measurements.  Here, we describe the techniques needed to generate low noise (&lt;0.5 pA) electrodes.  The techniques have been modified from published descriptions by previous researchers (1,2).  Electrodes are made by preparing carbon fibers and threading them individually into each capillary tube by using a vacuum with a filter to aspirate the fiber.  Next, the capillary tube with fiber is pulled by an electrode puller, creating two halves, each with a fine-pointed tip.  The electrodes are dipped in hot, liquid epoxy mixed with hardener to create an epoxy-glass seal.  Lastly, the electrodes are placed in an oven to cure the epoxy.  Careful handling of the electrodes is critical to ensure that they are made consistently and without damage.  This protocol shows how to fabricate and cut amperometric electrodes for recording from single cells.

This protocol describes how to generate carbon fiber electrodes. The electrodes are subsequently used to detect catecholamine release from vesicles with carbon fiber amperometry.

Herstellung von amperometrische Elektroden

Carbon fiber electrodes are crucial for the detection of catecholamine release from vesicles in single cells for amperometry measurements.  Here, we ...

Fabrication of Myogenic Engineered Tissue Constructs

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to the restrictions imposed by a child's small size and their inevitable growth. Consequently, there is a genuine need for innovative therapies designed specifically for pediatric patients with cardiac rhythm disorders. We propose that a conductive biological alternative consisting of a collagen-based matrix containing autologously-derived cells could better adapt to growth, reduce the need for recurrent surgeries, and greatly improve the quality of life for these patients. In the present study, we describe a procedure for incorporating primary skeletal myoblast cell cultures within a hydrogel matrix to fashion a surgically-implantable tissue construct that will serve as an electrical conduit between the upper and lower chambers of the heart. Ultimately, we anticipate using this type of engineered tissue to restore atrioventricular electrical conduction in children with complete heart block. In view of that, we isolate myoblasts from the skeletal muscles of neonatal Lewis rats and plate them onto laminin-coated tissue culture dishes using a modified version of established protocols[2, 3]. After one to two days, cultured cells are collected and mixed with antibiotics, type 1 collagen, Matrigel&trade;, and NaHCO3. The result is a viscous, uniform solution that can be cast into a mold of nearly any shape and size[1, 4, 5]. For our tissue constructs, we employ type 1 collagen isolated from fetal lamb skin using standard procedures[6]. Once the tissue has solidified at 37&deg;C, culture media is carefully added to the plate until the construct is submerged. The engineered tissue is then allowed to further condense through dehydration for 2 more days, at which point it is ready for in vitro assessment or surgical-implantation.

Here, we demonstrate fabrication of collagen-based, tissue constructs containing skeletal myoblasts. These 3-D engineered constructs may be used to replace or repair tissues in vivo. For our purposes, we have designed these as an atrioventricular electrical conduit for the repair of complete heart block[1].

Herstellung von Myogenic Engineered Tissue Konstrukte

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to ...

High Speed Droplet-based Delivery System for Passive Pumping in Microfluidic Devices

A novel microfluidic system has been developed that uses the phenomenon of passive pumping along with a user controlled droplet based fluid delivery system. Passive pumping is the phenomenon by which surface tension induced pressure differences drive fluid movement in closed channels. The automated fluid delivery system consists of a set of voltage controlled valves with micro-nozzles connected to a fluid reservoir and a control system. These voltage controlled valves offer a volumetrically precise way to deliver fluid droplets to the inlet of a microfluidic device in a high frequency manner. Based on the  dimensions demonstrated in the current study example, the system is capable of flowing 4 milliliters per minute (through a 2.2mm by 260um cross-sectional channel). Based on these same channel dimensions, fluid exchange of a point inside the channel can be achieved in as little as eight milliseconds. It is observed that there is interplay between momentum of the system (imparted by a combination of the droplets created by the valves and the fluid velocity in the channel), and the surface tension of the liquid. Where momentum provides velocity to the fluid flow (or vice-versa), equilibration of surface tension at the inlet provides a sudden stop to any flow. This sudden stop allows the user to control the flow characteristics of the channel and opens the door for a variety of biological applications, ranging anywhere from reagent delivery to drug-cell studies. It is also observed that when nozzles are aimed at the inlet at shallow angles, the droplet momentum can cause additional interesting fluid phenomena, such as mixing of multiple droplets in the inlet.

A novel microfluidic system has been developed using the phenomenon of passive pumping and a user controlled fluid delivery system. This microfluidic system has the potential to be used in a wide variety of biological applications given its low cost, ease of use, volumetric precision, high speed, repeatability and automation.

High Speed ​​Droplet-based Delivery System für Passive Pumping in Mikrofluidiksysteme

A novel microfluidic system has been developed that uses the phenomenon of passive pumping along with a user controlled droplet based fluid delivery ...

Automated Microfluidic Blood Lysis Protocol for Enrichment of Circulating Nucleated Cells

In this report the protocol for an automated microfluidic blood lysis device is detailed. Circulating nucleated cells (CNCs), including leukocytes and endothelial cells, provide an ideal platform for an updated status on the immune condition of an individual. The microfluidic protocol allows for enrichment of CNCs without selective cell loss and sample preparation variability due to user-mediated steps. Briefly, the protocol includes device fabrication, sample collection, device setup, and running blood through the microfluidic chamber. Within the device whole blood is rapidly mixed with deionized water for approximately 10 seconds in a 50 micron x 150 micron microfluidic channel. In this time span erythrocytes are lysed due to hypotonic conditions. Herringbone structures on the bottom of the channel ensure thorough mixing and exposure of cells to a constant environment. Remaining cells are returned to isotonic conditions at the exit of the device, fixed using 2% paraformaldehyde, centrifuged to separate erythrocyte debris from CNCs, and suspended in flow buffer for staining and analysis by flow cytometry. Results show clean flow cytometry scatter plots with CNC populations saved. Significance of this device and protocol comes in the study and understanding of disease pathogenesis by analysis of CNC populations. Hence, automation, effectiveness, and simplicity of the microfluidic protocol are demonstrated.

An automated microfluidic device was developed for circulating nucleated cell enrichment from peripheral blood via erythrocyte lysis that ensures isolation of high quality sample without cell loss.

Automatisierte Microfluidic Blut Lysis-Protokoll zur Anreicherung von zirkulierenden Zellen mit Zellkern

In this report the protocol for an automated microfluidic blood lysis device is detailed. Circulating nucleated cells (CNCs), including leukocytes and ...

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures 

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical research. The hypoxic chamber offers a simple system to control oxygenation in standard culture vessels, but lacks precise temporal and spatial control over the oxygen concentration at the cell surface, preventing its application in studying a variety of physiological phenomena. Other systems have improved upon the hypoxic chamber, but require specialized knowledge and equipment for their operation, making them intimidating for the average researcher. A microfabricated insert for multiwell plates has been developed to more effectively control the temporal and spatial oxygen concentration to better model physiological phenomena found in vivo. The platform consists of a polydimethylsiloxane insert that nests into a standard multiwell plate and serves as a passive microfluidic gas network with a gas-permeable membrane aimed to modulate oxygen delivery to adherent cells. The device is simple to use and is connected to gas cylinders that provide the pressure to introduce the desired oxygen concentration into the platform. Fabrication involves a combination of standard SU-8 photolithography, replica molding, and defined PDMS spinning on a silicon wafer. The components of the device are bonded after surface treatment using a hand-held plasma system. Validation is accomplished with a planar fluorescent oxygen sensor. Equilibration time is on the order of minutes and a wide variety of oxygen profiles can be attained based on the device design, such as the cyclic profile achieved in this study, and even oxygen gradients to mimic those found in vivo. The device can be sterilized for cell culture using common methods without loss of function. The device's applicability to studying the in vitro wound healing response will be demonstrated.

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures

Fabrication and validation of an add-on platform that offers enhanced control over the spatial and temporal oxygenation in a 6-well plate. The device is adaptable to a number of culture systems and can be used to investigate the effects of oxygen on wound healing.

Herstellung und Betrieb eines Oxygen Insert für adhärente Zellkulturen

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical ...