Diese Arbeit wurde zum Teil durch DK089016 und L30 RR030244 (MAC), CA153036 (AS) und P30-DK52574 (der Washington University Digestive Diseases Forschung Core) finanziert. AIT war ein Howard Hughes Medical Institute Medical Research Training Fellow.

Ein. Colitis-assoziierten Cancer Induction <ol><li> Beiseite Käfigen von Geschlecht und Alter abgestimmt 6-8 Wochen alten Mäusen für Versuchs-und Kontrollgruppen verwendet werden. Mäuse können individuell mit Schwanz Markierungen oder Ohr-Clips markiert werden. </li><li> Am Tag 0 Rekord Baseline Gewichten und injizieren Jede Maus intraperitoneal (IP) mit 10 mg / kg des AOM funktionierende Lösung (1 mg / ml in isotonischer Kochsalzlösung, von 10 mg / ml Stammlösung in dH2O verdünnt bei -20 ° C) . Erfahrungsgemäß kann diese Dosis zwischen 7-14 mg / kg und / oder eingestellt werden wiederholt Anfang des Experiments. </li></ol> Achtung: AOM ist ein flüchtiges genotoxische Agenten und sollte sorgfältig nach dem begleitenden MSDS behandelt werden. Verdünnungen sollten in einer chemischen Haube hergestellt werden, auf Eis gehalten, und verworfen folgenden Organ spezifischen Protokolle. <ol start="3"><li> Machen Sie eine 2,5% (2,5 g/100 ml) DSS-Lösung in destilliertem Wasser und durchlaufen eine 0,22 um Celluloseacetat filter durch Vakuum. Diese Dosis kann zwischen 1-3,5% je nach Mausstamm und Umwelt angepasst werden. Einmal hergestellt, DSS-Lösung kann im Kühlschrank aufbewahrt werden bis zu 1 Woche. </li><li> Am Tag 7 Versorgung DSS-Lösung, um Mäuse als Trinkwasser. Etwa 250 ml / Käfig wird jedes Mal neue DSS für maximal 5 Mäuse / Käfig vorgesehen ist, benötigt werden, jedoch sind diese nur Schätzungen und variieren je nach Art der Wasser-Flaschen in Ihrem Tierhaltung verwendet. </li><li> Um eine kontinuierliche Versorgung der DSS für sieben Tage bereitzustellen, sollten DSS-Lösung in saubere Flaschen dreimal (alle 2-3 Tage) während dieser Zeit ausgetauscht werden. Einige Forscher messen die Menge der DSS vor dem Austausch mit neuen Lösung als Maß der Belastung verbraucht. </li><li> Am Tag 14, schalten Käfige zurück zu Standard Trinkwasser für zwei Wochen. </li><li> Wiederholen der Schritte (1.4) - (1.6) an den Tagen 28 und 49, um einen zweiten und dritten Zyklus der DSS. Ein DSS &quot;Zyklus&quot; besteht aus einer Woche DSS im Trinkwassergefolgt von 2 Wochen regelmäßiger (autoklaviert) Wasser. </li></ol> 2. Clinical Assessment Colitis und Tumorprogression <ol><li> Mäuse sollten gewogen / beobachtet werden 2-3 mal pro Woche. Gewichtsverlust in Prozent im Vergleich zum Ausgangswert wird als Surrogat Maßnahme von Colitis Schweregrad eingesetzt. Regelmäßige Bewertungen der rektalen Blutungen, Durchfall oder Prolaps kann man je nach experimentellen Ziele und berichtet werden nach verschiedenen Scoring-Systeme. 9, 10 </li><li> Ein Gewichtsverlust von bis zu 10% mit 2-3 Tagen Durchfall und rektale Blutungen können in der Woche nach einem vollen Zyklus der DSS (tägliche Beobachtung kann während dieser Zeit unmittelbar nach dem DSS Zeitraum nützlich) erwartet werden. </li></ol> Es ist möglich, dass einige Mäuse können nicht wiederhergestellt werden; Mäusen verlieren größer als 20% ihres Gewichtes sind weniger wahrscheinlich, überleben und können frühe Euthanasie erfordern. Eine einzelne IP-Injektion von 0,5 - 1,0 ml Kochsalzlösung in solchen Mäusen kann eine nützliche unterstützende Maßnahme zur Korrektur flui<html> d Volumen verloren aufgrund von Durchfall. 3. Murine Endoskopie (Optional) <ol><li> Endoskopie nach dem zweiten oder dritten Zyklus der DSS kann durchgeführt werden, um das Tumorwachstum in vivo vor der Tötung zu bestätigen. Da die AOM / DSS Modell ist recht zuverlässig in produzierenden Tumoren, ist dieser Schritt in der Regel nicht erforderlich. Nur ein paar Mäuse sollte unter Verwendung dieser Methode, da sie das Potenzial, Mäusetumoren stören muss. 11 </li><li> Anesthetize die Maus mit inhalativen oder injizierbare Sedierung. </li><li> Nach Maus betäubt, sichern Sie die Maus auf einer flachen Platte mit Klebeband am Schwanz und Brust. </li><li> Schieben Sie den Maus-Endoskop in die Maus Mastdarm vorsichtig mit Kochsalzlösung zu füllen und zu bewässern, um intraluminale Sicht zu verbessern und zu entfernen fäkale Inhalt. (Beachte, dass die Endoskopie können auch mit Lufteinblaseinrichtung als Alternative zu Kochsalzlösung und dieser Technik werden kann bieten eine verbesserte Visualisierung des Tumors. 12) </li></ol>e &quot;&gt; 4. Maus Opfer und Colon Harvesting <ol><li> Am Tag 70, sollte jeder AOM / DSS behandelten Maus beherbergen mehrere Kolontumoren und bereit sein, für die Beurteilung. Dieses Datum kann verzögert Wochen bis Monate, wenn größere Tumoren gewünscht werden. (Zu beachten ist, können Mäuse mit schwerer rektale vorgefallene müssen früh eingeschläfert werden, um übermäßige Schmerzen zu Tieren vermeiden, da pro institutionellen animal care Ausschüsse.) </li><li> Vor seziert, individuell einschläfern Mäuse mit Isofluran und Genickbruch (oder andere institutionell anerkannte Methode). Endgewicht und andere Messungen kann zu diesem Zeitpunkt vorgenommen werden. </li><li> Legen Sie die Maus mit ihrer Bauchseite auf ein Schneidebrett ausgesetzt. Bedecken Sie den Bauch mit 70% Ethanol, um Haare verunreinigen die Bauch-Inhalte während der Extraktion des Dickdarms verhindern. </li><li> Verwenden einer Pinzette, um die Mittellinie des Bauches zu erfassen und einen kleinen Einschnitt, um das Bauchfell aussetzen. </li><li> Erweitern diese Schnitt auf jeder Seite des Bauches entlang der Küsten margin. </li><li> Mit einer Schere durch das Becken so geschnitten, dass der Darm kann bis zum anorektalen Übergang geerntet werden. Dies ist wichtig, da DSS ulcerosa Schädigung am größten ist an der distalen Rektum und dementsprechend ist dies der Bereich größter Tumorentwicklung. </li><li> Zusätzliche Geweben wie mesenterischen Lymphknoten kann ebenfalls zu diesem Zeitpunkt geerntet werden. </li></ol> 5. Vorbereiten des Colon für makroskopische Analyse <ol><li> Mit einer 18G Magensonde Nadel an einer 5-ml-Spritze, spülen Sie den Doppelpunkt mit eiskaltem Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), so dass Flüssigkeit austritt in der physiologischen Richtung. Wenn Kolongewebe für RNA oder Protein-basierte Analyse verwendet wird, kann sie durch Einsatz gehalten vorgekühlte Arbeit Trays kalt werden. </li><li> Öffnen Sie die gespülten Darm längs sein Mesenterium und Farbe auf den kalten Fach. Tumoren sind einfach visualisiert, wenn der Doppelpunkt auf eine dunkle Oberfläche platziert wird. Alternativ kann 1% Alcian blauen Farbstoff angewendet t hervorzuhebenumors. Bewerten Tumors Anzahl und Größe mit einem Lineal oder digitalen Messschieber. </li><li> Kleine Abschnitte des Tumors und benachbarten normalen Gewebe kann zu diesem Zeitpunkt für eine zukünftige Analyse werden durch RNA-, Protein oder immunhistochemische (IHC) Methoden ausgeschnitten, so dass einige Teil des verbleibenden Dickdarms zur histologischen Beurteilung. </li></ol> Digitale Fotografie der Brutto-Darm-Proben unmittelbar nach dem Schritt 5,2 hilfreich sein kann für eine präzise Analyse der Tumorlast, vor allem, wenn wesentliche Teile der Doppelpunkte für andere Formen der Analyse ausgeschnitten wie oben beschrieben. Tumorlast (%) kann als Tumor-Währungsgebiet / insgesamt Darm-Bereich mit freier Software wie ImageJ berechnet werden. 6. Vorbereiten des Colon für die histologische Beurteilung <ol><li> Übernehmen 10% Formalin, um die restlichen Doppelpunkt auf dem kalten Behälter über eine Spritze oder einen Finger. Wodurch das Gewebe für mindestens 30 sec auf diese Weise erleichtert die Übertragung zu fixieren, um die Fixierung Becken. Stellen Sie sicher, restliche Formalin ist wiped off vor dem Lackieren eine neue eröffnet Doppelpunkt auf dem gleichen Tablett. </li><li> Übertragen Doppelpunkte in ein Becken mit 10% Formalin gefüllt und festzunageln an den Rändern. </li><li> Nach 3 Stunden der Fixierung, zu übertragen Doppelpunkte bis 70% Ethanol. Doppelpunkte kann in 70% Ethanol unbegrenzt beibehalten. </li><li> Drei Längsschnitte Doppelpunkt (proximal, Mitte, distal / Rektum) kann in 2% Agar stabilisiert werden und von Paraffineinbettung. Sicherzustellen, dass die proximalen und distalen Kolons Kolon / Rektum ausgerichtet sind einheitlich für jede Maus. </li><li> Dysplasie, Krypta Schäden und Entzündungen können beschrieben und von einer erfahrenen Person beurteilt werden nach zuvor veröffentlichten Protokollen. 10, 13-15 Mäuse kann vor Tag 70 geopfert werden, wenn der Experimentator in Früherkennung dysplastischen Veranstaltungen interessiert ist. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse Der AOM / DSS-Modell beschrieben erlaubt dem Forscher, um zuverlässig zu generieren Darm-Tumoren in Mäusen.Tumorwachstum in diesem Modell wird direkt durch den zugehörigen Entzündungsprozess beeinflusst. Colitis Schwere sollte klinisch nach Gewichtsverlust und das Vorhandensein von Durchfall / Hämatochezie (Abbildung 2) überwacht werden. Diese Zeichen der Krankheitsaktivität neigen dazu, von Tag 5 des DSS-Zyklus und für vier oder mehr Tage beginnen, nachdem DSS entfernt wird. Selten können Mäuse mit einer signifikanten rektale Tumorlast zu entwickeln Rektumprolaps. Nach dem zweiten oder dritten DSS-Zyklus Durchfall kann sich hartnäckig. Typischerweise Tumoren vorhanden sind und identifizierbar durch murine Koloskopie vor dem dritten Zyklus der DSS (Abbildung 3). Zusätzliche Zeit und einen dritten Verlauf DSS bewirkt größere Tumore zum Zeitpunkt der Ernte (Abbildung 4). Verwenden von topisch applizierten Alcianblau Beize verwendet werden, um Tumore (Abbildung 5) hervorzuheben. Photographien von Dickdarmtumoren in Erzeugen Tumormessungen die verwendet werden können, um quantitativ zu unterstützen vergleiche Tumor Produktion und Größezwischen experimentellen Gruppen (Abbildung 6). Fixierten und in Paraffin eingebetteten Doppelpunkt Proben können dann für die Histologie oder mit der Verwendung von immunhistochemischen (Abbildung 7 und 8) ausgewertet werden. <img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung des AOM und DSS Verwaltung. AOM (10 mg / kg) wird am Tag 0 injiziert. Zu Beginn der zweiten Woche (Tag 7), wurde mit 2,5% DSS-Lösung an Mäuse in ihrem Trinkwasser verabreicht. Sieben Tage von DSS wird von zwei Wochen der autoklavierten Wasser. Zwei weitere Zyklen von DSS sind vor der Tötung verabreicht werden. <img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Mausgewicht im Vergleich zum Ausgangswert bei der AOM-und DSS-Verwaltung. Beachten Sie, dass in der Woche nach jeder DSS-Zyklus, Mäuse los<html> e 5-10% ihres Körpergewichts. Gewichtsverlust in diesem Experiment ist ein Surrogat-Marker für Colitis Schweregrad. <img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Von Tumoren anzeigen in distalen Kolon über murine Endoskopie am Tag 50 von AOM / DSS Behandlung. Man beachte die mehrfache polypoide Massen Behinderung der Lumen des distalen Kolon (b, c) im Vergleich zur normalen Kolon (a). <img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Longitudinally eröffnet Maus Doppelpunkt Veranschaulichung grobe Auftreten von Tumoren. Beachten die höhere Tumorlast im distalen Kolon / Rektum (linken oberen Bild), und die charakteristische rugated Textur des proximalen Kolon (rechts oberen Bild) mit wenig Tumorwachstum. Eine Nahaufnahme des distalen Kolon zeigt zahlreiche Tumoren in verschiedenen Größen (siehe unten). ove_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Tumoren durch Anwendung Alcianblau markiert Fleck. Man beachte, wie der Farbstoff die normale Textur der Darm sowie die Grenzen jedes einzelnen Tumors betont. Solche Färbung kann hilfreich sein, in der genauen Messung von Tumor Gebieten Lineal oder digitale Messung. <img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig6.jpg" alt="Abbildung 6" /> Abbildung 6. Repräsentative Verteilung der durchschnittlichen Anzahl von Tumoren pro Maus mit AOM / DSS behandelt. Man beachte die Mehrzahl der Tumoren im distalen Kolon befinden und &lt;2 mm Größe. <img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig7.jpg" alt="Abbildung 8" /> Abbildung 7. Paraffin eingebetteten Längsschnitte Doppelpunkt in Kassette (oben) eind auf Schlitten nach H &amp; E-Färbung (unten). Beachten Sie, dass Rest-Alcianblau Fleck nicht mit H &amp; E-Färbung stören. Ein großer Tumor auf der Folie Bild (eingekreist) eingekreist. Die Bezeichnungen &quot;distal&quot;, &quot;Mitte&quot; und &quot;proximal&quot; Ergebnis aus Schneiden den gesamten Dickdarm in Terzen zwischen dem Blinddarm und Anus. <img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig8.jpg" alt="Abbildung 8" /> Abbildung 8. Repräsentative Histologie des Tumors durch AOM / DSS Verabreichung im distalen Colon. H &amp; E, BrdU und β-Catenin gefärbten Objektträger bei 50X (oben) und 400X (Bodenplatte) bzw. demonstrieren dysplastische Veränderungen ähnlich dem menschlichen Adenokarzinomen des Dickdarms.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Behandlung von Mäusen mit AOM und DSS rasch und wirksam Modelle menschlichen ulcerosa-assoziierten Krebses. Hypothesen bezüglich erbliche Faktoren, Colitis-assoziierten Krebsarten kann leicht mit gentechnisch veränderten Mäusen studiert werden. 13, 16 Alternativ kann die pharmakologische Wirkung von Targets in ulcerosa-assoziiertem Krebs durch Verwendung Wildtyp-Mäuse können studiert werden. Während dieses Modell wird von Interessenten in der Studie von Kolontumor Entwicklu...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> C57BL/6J Mäuse </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 000664 </td><td></td></tr><tr><td> Azoxymethan (AOM) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A5486-100MG </td><td> Stammlösung: verdünnt auf 10 mg / ml in destilliertem Wasser bei -20 ° C als 0,5 gehalten werden - 1 ml Aliquots. Arbeitslösung: verdünnen Lager zu 1 mg / ml in isotonischer (0,9%) Kochsalzlösung </td></tr><tr><td> Dextransulfat Natrium (DSS) </td><td> TdB Consultancy </td><td> DB001 </td><td> MW 40 kDa (36-50 kDa Zubereitungen aus anderen Quellen sind akzeptabel; Das gleiche viel für einen einzigen Experiment verwendet werden) 6 </td></tr><tr><td> Coloviewminiendoscopic System </td><td> Karl Storz </td><td> Mehrere </td><td> Siehe Becker et al. Für detaillierte Erklärung der Ausrüstung und Einrichtung. 11 </td></tr><tr><td> TPP Schnelle FilterMax 500 ml Flasche-Filter, 0,22 um PES </td><td> Midwest Scientific </td><td> TP99500 </td><td> Jede Standard-Gewebekultur-Filter ist akzeptabel </td></tr><tr><td> Ethylalkohol 200 Proof ASC / USP </td><td> Pharmako-Aaper (oder andere) </td><td> 11ACS200 </td><td> Verdünnen, um 70% in destilliertem Wasser </td></tr><tr><td> Isofluran, USP </td><td> Butler Animal Health Versorgung </td><td> 4029405 </td><td> Bewegen Sie die Maus im Glas mit Gaze oder einem kleinen Tuch in Narkose eingeweicht </td></tr><tr><td> 18G Gerade Gavage Needle </td><td> Braintree Scientific </td><td> N-008 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) </td><td> SigmaAldrich </td><td> P5493 </td><td> Auf 1x verdünnen (0,01 M) in destilliertem Wasser </td></tr><tr><td> Kalte Tray (Tissue Tek II Cold Plate) </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9491941 </td><td> Lagerung bei -20 ° C </td></tr><tr><td> ImageJ Software </td><td> NIH (kostenloser Download) </td><td></td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </td></tr><tr><td> Formaldehyd (37%) </td><td> Fisher Scientific </td><td> F79-500 </td><td> Verdünnt auf 10% in PBS </td></tr><tr><td> BD Bacto Agar </td><td> Fisher Scientific </td><td> DF0140-01-0 </td><td> Verwenden Kochplatte bis 2% ige Lösung in destilliertem Wasser zu schaffen </td></tr><tr><td> Miltex Eye Dressing Forceps </td><td> MedPlus Inc. </td><td> 18-780 </td><td></td></tr><tr><td> Miltex Augenschere </td><td> MedPlus Inc. </td><td> 18-1430 </td> &lt;td&gt; Curved Punkten verhindern Schäden an Dickdarm beim Öffnen. </td></tr><tr><td> Alcianblau 8GX (Pulver) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A5268 </td><td> 1 g Pulver auf 100 ml 3% ige Essigsäure (3 ml Eisessig + 97 ml destilliertem Wasser) </td></tr><tr><td> 1 ml Tuberkulin-Spritze mit angehängten 26 G x 3/8 in intradermalen Nadel Fase </td><td> BD </td><td> 305946 </td><td> Zur Injektion von AOM </td></tr></tbody></table>

modeling colitis-associated cancer with azoxymethane (aom) and dextran sulfate sodium (dss)

Individuen mit entzündlichen Darmerkrankungen (IBD), wie Morbus Crohn (CD) oder Colitis ulcerosa (UC) sind mit einem erhöhten Risiko der Entwicklung von Darmkrebs (CRC) über gesunden Individuen. Dieses Risiko ist proportional zur Dauer und Ausmaß der Krankheit, mit einer kumulativen Inzidenz so hoch wie 30% bei Personen mit langjähriger UC mit der weit verbreiteten Kolon Engagement. 1 Colonic Dysplasie in IBD und Colitis assoziiertem Krebs (CAC) wird angenommen, dass als Folge entwickeln von wiederholten Zyklen von Epithelzellen Verletzung und Reparatur während diese Zellen in einer chronisch entzündlichen Zytokinmilieu gebadet werden. 2 Während spontane und Colitis-assoziierten Krebserkrankungen die Qualität des Seins Adenokarzinome Aktien, wird die Reihenfolge der zugrunde liegenden molekularen Ereignisse glaubte, anders zu sein. 3 Diese Unterscheidung argumentiert, die Notwendigkeit spezifischer Tiermodelle CAC. Mehrere Mausmodellen derzeit für das Studium der CAC existieren. Dextransulfat Natriumum (DSS), ein Mittel mit direkten toxischen Wirkungen auf das Darmepithel, können im Trinkwasser an Mäuse in mehreren Zyklen, um eine chronische entzündliche Zustand erzeugen verabreicht werden. Bei ausreichender Dauer, werden einige dieser Mäuse entwickeln Tumoren. 4 Tumor Entwicklung in diesem Modell wird beschleunigt, wenn in einer pro-karzinogene verabreicht wird. Hierzu gehören Mäuse mit genetischen Mutationen in der Tumorgenese von Pathways (APC, p53, Msh2) sowie Mäuse mit genotoxischen Agentien (Azoxymethan [AOM], 1,2-Dimethylhydrazin [DMH]). 5 vorbehandelt Die Kombination von DSS mit AOM als Modell für Colitis assoziiertem Krebs hat Popularität für seine Reproduzierbarkeit, Potenz, niedriger Preis, und Benutzerfreundlichkeit gewonnen. Obwohl sie einen gemeinsamen Mechanismus haben, hat AOM sich als wirksamer und stabil in Lösung als DMH. Während Tumor-Entwicklung in anderen Modellen erfordert in der Regel mehrere Monate, entwickeln Mäuse mit AOM injiziert und anschließend mit DSS behandelt ausreichende Tumoren in einems weniger als 7-10 Wochen. 6, 7 Schließlich AOM und DSS kann bei Mäusen jeder genetischen Hintergrund (knock out, transgene, etc.) ohne Kreuzungen werden zu einer bestimmten tumorigenen Belastung verabreicht werden. Hier zeigen wir, ein Protokoll für die Entzündung angetriebenen Kolon Tumorgenese in Mäusen unter Verwendung einer einzigen Injektion von AOM gefolgt von drei Sieben-Tage-Zyklen von DSS über einen Zeitraum von 10 Wochen. Dieses Modell induziert Tumoren mit histologischen und molekularen Veränderungen stark ähneln denjenigen vorkommenden menschlichen CAC und bietet eine sehr wertvolles Modell für die Untersuchung von Onkogenese und Chemoprävention bei dieser Krankheit. 8

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Modeling Colitis-Associated Cancer with Azoxymethane AOM and Dextran Sulfate Sodium DSS

Wir demonstrieren ein Protokoll, bei dem Verabreichung des genotoxischen Agens Azoxymethan (AOM) durch drei Zyklen des pro-entzündliches Mittel Dextransulfat-Natrium (DSS) rasch und konsequent befolgt erzeugt Dickdarmtumoren in Mäusen mit morphologischen und molekularen Ähnlichkeiten mit den in menschlichen ulcerosa angesehen -assoziierten Krebserkrankungen.

Modeling Colitis-assoziierten Krebs mit Azoxymethan (AOM) und Dextransulfat Natrium (DSS)

Individuals with inflammatory bowel disease (IBD), such as Crohn's disease (CD) or ulcerative colitis (UC) are at increased risk of developing colorectal ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Modeling Colitis-Associated Cancer with Azoxymethane (AOM) and Dextran Sulfate Sodium (DSS)

46.5K Aufrufe.  Washington University School of Medicine. Wir demonstrieren ein Protokoll, bei dem Verabreichung des genotoxischen Agens Azoxymethan (AOM) durch drei Zyklen des pro-entzündliches Mittel Dextransulfat-Natrium (DSS) rasch und konsequent befolgt erzeugt Dickdarmtumoren in Mäusen mit morphologischen und molekularen Ähnlichkeiten mit den in menschlichen ulcerosa angesehen -assoziierten Krebserkrankungen.

Serie: Modeling Colitis-Associated Cancer with Azoxymethane AOM and Dextran Sulfate Sodium DSS

Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are very limited. To meet the need for novel therapeutic approaches, experimental stroke research frequently employs rodent models of focal cerebral ischaemia. Most researchers use permanent or transient occlusion of the middle cerebral artery (MCA) in mice or rats.
Proximal occlusion of the middle cerebral artery (MCA) via the intraluminal suture technique (so called filament or suture model) is probably the most frequently used model in experimental stroke research. The intraluminal MCAO model offers the advantage of inducing reproducible transient or permanent ischaemia of the MCA territory in a relatively non-invasive manner. Intraluminal approaches interrupt the blood flow of the entire territory of this artery. Filament occlusion thus arrests flow proximal to the lenticulo-striate arteries, which supply the basal ganglia. Filament occlusion of the MCA results in reproducible lesions in the cortex and striatum and can be either permanent or transient. In contrast, models inducing distal (to the branching of the lenticulo-striate arteries) MCA occlusion typically spare the striatum and primarily involve the neocortex. In addition these models do require craniectomy. In the model demonstrated in this article, a silicon coated filament is introduced into the common carotid artery and advanced along the internal carotid artery into the Circle of Willis, where it blocks the origin of the middle cerebral artery. In patients, occlusions of the middle cerebral artery are among the most common causes of ischaemic stroke. Since varying ischemic intervals can be chosen freely in this model depending on the time point of reperfusion, ischaemic lesions with varying degrees of severity can be produced. Reperfusion by removal of the occluding filament at least partially models the restoration of blood flow after spontaneous or therapeutic (tPA) lysis of a thromboembolic clot in humans.
In this video we will present the basic technique as well as the major pitfalls and confounders which may limit the predictive value of this model.

Filamentous occlusion of the Middle cerebral artery is a common model for studying ischemic stroke in mice.

Modeling Stroke in Mice - Middle Zerebralarterie mit dem Filament-Modell

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are ...

Forschung

Medizin

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy tissue is the root cause of disease and death. For other cancers (e.g. breast, lung, etc.), it is the process of metastasis, in which tumor cells move from a primary tumor mass, colonize distal sites and ultimately contribute to organ failure, that eventually leads to morbidity and mortality 3. It has been estimated that invasion and metastasis are responsible for 90&#37; of cancer deaths 4. As a result, there has been intense interest in identifying the molecular processes and critical protein mediators of invasion and metastasis for the purposes of improving diagnosis and treatment 5.
A challenge for cancer scientists is to develop invasion assays that sufficiently resemble the in vivo situation to enable accurate disease modeling 6. Two-dimensional cell motility assays are only informative about one aspect of invasion and do not take into account extracellular matrix (ECM) protein remodeling which is also a critical element. Recently, research has refined our understanding of tumor cell invasion and revealed that individual cells may move by elongated or rounded modes 7. In addition, there has been greater appreciation of the contribution of collective invasion, in which cells invade in strands, sheets and clusters, particularly in highly differentiated tumors that maintain epithelial characteristics, to the spread of cancer 8.
We present a refined method 9 for examining the contributions of candidate proteins to collective invasion 10. In particular, by engineering separate pools of cells to express different fluorescent proteins, it is possible to molecularly dissect the activities and proteins required in leading cells versus those required in following cells. The use of RNAi provides the molecular tool to experimentally disassemble the processes involved in individual cell invasion as well as in different positions of collective invasion. In this procedure, mixtures of fluorescently-labeled cells are plated on the bottom of a Transwell insert previously filled with Matrigel ECM protein, then allowed to invade "upwards" through the filter and into the Matrigel. Reconstruction of z-series image stacks, obtained by confocal imaging, into three-dimensional representations allows for visualization of collectively invading strands and analysis of the representation of fluorescently-labeled cells in leading versus following positions.

Models of tumor cell invasion into three-dimensional extracellular matrix better reflect the in vivo situation than two-dimensional motility assays. Using matrix invasion assays combined with confocal imaging of fluorescently-labeled cells, detailed information on invasion modes and the distinct contributions of leading versus following cells can be obtained.

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Zellinvasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical treatments and improved platinum-based chemotherapies, there has been little improvement in EOC survival rates for more than four decades 1,2. Whilst stage I tumors have 5-year survival rates &gt;85%, survival rates for stage III/IV disease are &lt;40%. Thus, the high rates of mortality for EOC could be significantly decreased if tumors were detected at earlier, more treatable, stages 3-5. At present, the molecular genetic and biological basis of early stage disease development is poorly understood. More specifically, little is known about the role of the microenvironment during tumor initiation; but known risk factors for EOCs (e.g. age and parity) suggest that the microenvironment plays a key role in the early genesis of EOCs. We therefore developed three-dimensional heterotypic models of both the normal ovary and of early stage ovarian cancers. For the normal ovary, we co-cultured normal ovarian surface epithelial (IOSE) and normal stromal fibroblast (INOF)&nbsp;cells, immortalized by retrovrial transduction of the catalytic subunit of human telomerase holoenzyme (hTERT) to extend the lifespan of these cells in culture. To model the earliest stages of ovarian epithelial cell transformation, overexpression of the CMYC oncogene in IOSE cells, again co-cultured with INOF cells. These heterotypic models were used to investigate the effects of aging and senescence on the transformation and invasion of epithelial cells. Here we describe the methodological steps in development of these three-dimensional model; these methodologies aren't specific to the development of normal ovary and ovarian cancer tissues, and could be used to study other tissue types where stromal and epithelial cell interactions are a fundamental aspect of the tissue maintenance and disease development.

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

We describe methodologies for establishing in vitro heterotypic three-dimensional models comprising ovarian fibroblasts and normal ovarian surface or ovarian cancer epithelial cells. We discuss the use of these models to study stromal-epithelial interactions that occur during ovarian cancer development.

Heterotypische Dreidimensionale<em&gt; In Vitro</em&gt; Modellierung von Stromal-Epithelial Interaktionen beim Eierstockkrebs Initiation und Progression

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the occurrence of subretinal hemorrhage can affect photoreceptor cell death in the detached retina. Hence, it is advantageous to create reproducible RDs without subretinal hemorrhage for evaluating photoreceptor cell death. We modified a previously reported method to create bullous and persistent RDs in a reproducible location with rare occurrence of subretinal hemorrhage. The critical step of this modified method is the creation of a self-sealing scleral incision, which can prevent leakage of sodium hyaluronate after injection into the subretinal space. To make the self-sealing scleral incision, a scleral tunnel is created, followed by scleral penetration into the choroid with a 30 G needle. Although choroidal hemorrhage may occur during this step, astriction with a surgical spear reduces the rate of choroidal hemorrhage. This method allows a more reproducible and reliable model of photoreceptor death in diseases that involve RD such as rhegmatogenous RD, retinopathy of prematurity, diabetic retinopathy, central serous chorioretinopathy, and age-related macular degeneration (AMD).

Creating experimental retinal detachments with a reproducible and sustained height of detachment, and without subretinal hemorrhage, is important for studying the pathophysiology of photoreceptor cell loss in retinal disease and evaluating potential therapeutic interventions. Here, we report such a method in detail.

Modell Netzhautablösung in Nagetiere durch subretinale Injektion von Natriumhyaluronat

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Modeling Spontaneous Metastatic Renal Cell Carcinoma (mRCC) in Mice Following Nephrectomy

One of the key challenges to improved testing of new experimental therapeutics in renal cell carcinoma (RCC) is the development of models that faithfully recapitulate early- and late-stage metastatic disease progression. Typical tumor implantation models utilize ectopic or orthotopic primary tumor implantation, but few include systemic spontaneous metastatic disease that mimics the clinical setting. This protocol describes the key steps to develop RCC disease progression stages similar to patients. First, it uses a highly metastatic mouse tumor cell line in a syngeneic model to show orthotopic tumor cell implantation. Methods include superficial and internal implantation into the sub-capsular space with cells combined with matrigel to prevent leakage and early spread. Next it describes the procedures for excision of tumor-bearing kidney (nephrectomy), with critical pre- and post- surgical mouse care. Finally, it outlines the steps necessary to monitor and assess micro-and macro-metastatic disease progression, including bioluminescent imaging as well provides a detailed visual necropsy guide to score systemic disease distribution. The goal of this protocol description is to facilitate the widespread use of clinically relevant metastatic RCC models to improve the predictive value of future therapeutic testing.&#160;

Modeling Spontaneous Metastatic Renal Cell Carcinoma mRCC in Mice Following Nephrectomy

Models of spontaneous metastatic renal cell carcinoma (RCC) disease progression can be used for evaluating treatments in a clinically relevant setting. This protocol demonstrates different procedures for orthotopic kidney tumor cell implantation, proper nephrectomy, and finally outlines a necropsy guide for visual and bioluminescent scoring of metastatic burden and localization.

Modellierung Spontane metastasiertem Nierenzellkarzinom (mRCC) in Mäusen nach Nephrektomie

One of the key challenges to improved testing of new experimental therapeutics in renal cell carcinoma (RCC) is the development of models that faithfully ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

Arbeiten mit menschlichen Geweben für Translationale Krebsforschung

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

Modeling Encephalopathy of Prematurity Using Prenatal Hypoxia-ischemia with Intra-amniotic Lipopolysaccharide in Rats

Encephalopathy of prematurity (EoP) is a term that encompasses the central nervous system (CNS) abnormalities associated with preterm birth. To best advance translational objectives and uncover new therapeutic strategies for brain injury associated with preterm birth, preclinical models of EoP must include similar mechanisms of prenatal global injury observed in humans and involve multiple components of the maternal-placental-fetal system. Ideally, models should produce a similar spectrum of functional deficits in the mature animal and recapitulate multiple aspects of the pathophysiology. To mimic human systemic placental perfusion defects, placental underperfusion and/or chorioamnionitis associated with pathogen-induced inflammation in early preterm birth, we developed a model of prenatal transient systemic hypoxia-ischemia (TSHI) combined with intra-amniotic lipopolysaccharide (LPS). In pregnant Sprague Dawley rats, TSHI via uterine artery occlusion on embryonic day 18 (E18) induces a graded placental underperfusion defect associated with increasing CNS damage in the fetus. When combined with intra-amniotic LPS injections, placental inflammation is increased and CNS damage is compounded with associated white matter, gait and imaging abnormalities. Prenatal TSHI and TSHI+LPS prenatal insults meet several of the criteria of an EoP model including recapitulating the intrauterine insult, causing loss of neurons, oligodendrocytes and axons, loss of subplate, and functional deficits in adult animals that mimic those observed in children born extremely preterm. Moreover, this model allows for the dissection of inflammation induced by divergent injury types.

Encephalopathy of prematurity encompasses the central nervous system abnormalities associated with injury from preterm birth. This report describes a clinically relevant rat model of in utero transient systemic hypoxia-ischemia and intra-amniotic lipopolysaccharide administration (LPS) that mimics chorioamnionitis, and the related impact of infectious stimuli and placental underperfusion on CNS development.

Modellierung Enzephalopathie praematurorum Mit Prenatal Hypoxie-Ischämie mit Intra-Frucht Lipopolysaccharide bei Ratten

Encephalopathy of prematurity (EoP) is a term that encompasses the central nervous system (CNS) abnormalities associated with preterm birth. To best ...

Modeling the Early Steps of Ovarian Cancer Dissemination in an Organotypic Culture of the Human Peritoneal Cavity

The pattern of ovarian cancer metastasis is markedly different from that of most other epithelial tumors, because it rarely spreads hematogenously. Instead, ovarian cancer cells exfoliated from the primary tumor are carried by peritoneal fluid to metastatic sites within the peritoneal cavity. These sites, most notably the abdominal peritoneum and omentum, are organs covered by a mesothelium-lined surface. To investigate the processes of ovarian cancer dissemination, we assembled a complex three-dimensional culture system that reconstructs the lining of the peritoneal cavity in vitro. Primary human fibroblasts and mesothelial cells were isolated from human omentum. The fibroblasts were then mixed with extracellular matrix and covered with a layer of the primary human mesothelial cells to mimic the peritoneal and omental surfaces encountered by metastasizing ovarian cancer cells. The resulting organotypic model is, as shown, used to examine the early steps of ovarian cancer dissemination, including cancer cell adhesion, invasion, and proliferation. This model has been used in a number of studies to investigate the role of the microenvironment (cellular and acellular) in early ovarian cancer dissemination. It has also been successfully adapted to high throughput screening and used to identify and test inhibitors of ovarian cancer metastasis.

Here, we present a protocol to construct a three-dimensional in vitro model of the lining of the peritoneal cavity, composed of primary human mesothelial cells and fibroblasts layered with extracellular matrix, as a tool to investigate ovarian cancer cell adhesion, invasion, and proliferation.

Modellierung der frühen Schritte der Eierstockkrebs Verbreitung in einer organotypischen Kultur der Menschen Peritonealhöhle

The pattern of ovarian cancer metastasis is markedly different from that of most other epithelial tumors, because it rarely spreads hematogenously. ...

Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and progress in this site. The model presented in the current report utilizes human primary bone marrow stromal cells and osteoblasts as two representative cell types from the marrow niche that influence tumor cell phenotype. The in vitro co-culture conditions described for human leukemic cells with these primary niche components support the generation of a chemoresistant subpopulation of tumor cells that can be efficiently recovered from culture for analysis by diverse techniques. A strict feeding schedule to prevent nutrient fluxes followed by gel type 10 cross-linked dextran (G10) particles recovery of the population of tumor cells that have migrated beneath the adherent bone marrow stromal cells (BMSC) or osteoblasts (OB) generating a "phase dim" (PD) population of tumor cells, provides a consistent source of purified therapy resistant leukemic cells. This clinically relevant population of tumor cells can be evaluated by standard methods to investigate apoptotic, metabolic, and cell cycle regulatory pathways as well as providing a more rigorous target in which to test novel therapeutic strategies prior to pre-clinical investigations targeted at minimal residual disease.

Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro

The current report summarizes a protocol that can be utilized to model the influence of the bone marrow microenvironment niche on leukemic cells with emphasis placed on enrichment of the most chemoresistant subpopulation.

Modeling Chemotherapie beständig Leukämie<em&gt; In Vitro</em

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and ...

Modeling and Simulations of Olfactory Drug Delivery with Passive and Active Controls of Nasally Inhaled Pharmaceutical Aerosols

There are many advantages of direct nose-to-brain drug delivery in the treatment of neurological disorders. However, its application is limited by the extremely low delivery efficiency (&#60; 1%) to the olfactory mucosa that directly connects the brain. It is crucial to develop novel techniques to deliver neurological medications more effectively to the olfactory region. The objective of this study is to develop a numerical platform to simulate and improve intranasal olfactory drug delivery. A coupled image-CFD method was presented that synthetized the image-based model development, quality meshing, fluid simulation, and magnetic particle tracking. With this method, performances of three intranasal delivery protocols were numerically assessed and compared. Influences of breathing maneuvers, magnet layout, magnetic field strength, drug release position, and particle size on the olfactory dosage were also numerically studied.
From the simulations, we found that clinically significant olfactory dosage (up to 45%) were feasible using the combination of magnet layout and selective drug release. A 64 -fold higher delivery of dosage was predicted in the case with magnetophoretic guidance compared to the case without it. However, precise guidance of nasally inhaled aerosols to the olfactory region remains challenging due to the unstable nature of magnetophoresis, as well as the high sensitivity of olfactory dosage to patient-, device-, and particle-related factors.

This manuscript reviews the modeling and simulations of different protocols to deliver medications to the olfactory region in image-based nasal airway models. Multiple software modules are used to develop the anatomically accurate nose model, generate computational mesh, simulate nasal airflows, and predict particle deposition at the olfactory region.

Modellierung und Simulation der olfaktorischen Drug Delivery mit passiven und aktiven Steuerung von Nasal Inhaled Pharmaceutical Aerosols

There are many advantages of direct nose-to-brain drug delivery in the treatment of neurological disorders. However, its application is limited by the ...