Questo lavoro è stato in parte finanziato dal DK089016 e L30 RR030244 (MAC), CA153036 (AS), e P30-DK52574 (al Core Digestive Diseases Washington University Research). AIT è stato un Howard Hughes Medical Institute Research Fellow Medical Training.

1. Colite associata a cancro induzione <ol><li> Mettere da parte le gabbie di sesso e di pari età 6-8 topi settimana fa da utilizzare per i gruppi sperimentali e di controllo. I topi possono essere etichettati singolarmente con le marcature coda o clip orecchio. </li><li> Al giorno 0, i pesi di base registrare e iniettare ciascun topo per via intraperitoneale (IP) con 10 mg / kg di soluzione AOM lavoro (1 mg / ml in soluzione salina isotonica, diluito da 10 mg / ml di soluzione concentrata in dH2O mantenuta a -20 gradi C) . In base all&#39;esperienza, questa dose può essere regolata tra 7-14 mg / kg e / o ripetuto all&#39;inizio dell&#39;esperimento. </li></ol> Attenzione: AOM è un agente genotossico volatili e devono essere maneggiati con cura in base alla scheda di sicurezza di accompagnamento. Le diluizioni devono essere preparate in una cappa chimica, mantenuto su ghiaccio, ed eliminato secondo protocolli specifici dell&#39;ente. <ol start="3"><li> Fare un 2,5% (2,5 g/100 ml) soluzione DSS in acqua distillata e passa attraverso un acetato di cellulosa f 0,22 micronilter sotto vuoto. Questa dose può essere regolata tra 1-3,5% a seconda del ceppo di topi e l&#39;ambiente. Una volta preparata, la soluzione DSS può essere conservato in frigorifero per un massimo di 1 settimana. </li><li> Il giorno 7, DSS soluzione di approvvigionamento di topi come l&#39;acqua potabile. Circa 250 ml / gabbia sarà necessario ogni volta che viene fornito DSS nuovo per un massimo di 5 topi / gabbia, ma questi sono solo stime e possono variare a seconda del tipo di bottiglie di acqua utilizzati nel stabulario. </li><li> Per fornire un approvvigionamento continuo di DSS per sette giorni, la soluzione DSS devono essere sostituiti in bottiglie pulite tre volte (ogni 2-3 giorni) durante questo periodo. Alcuni ricercatori misurare la quantità di DSS consumati prima di sostituire con nuova soluzione come misura di esposizione. </li><li> Il giorno 14, passare gabbie torna all&#39;acqua potabile standard per due settimane. </li><li> Ripetere i punti (1,4) - (1,6) nei giorni 28 e 49 per fornire un secondo e terzo ciclo di DSS. Un DSS &quot;ciclo&quot; consiste di una settimana di DSS in acqua potabileseguito da 2 settimane di regolare (autoclave) di acqua. </li></ol> 2. Colite valutazione clinica e la progressione del tumore <ol><li> I topi dovrebbero essere pesati / osservate 2-3 volte a settimana. Perdita di peso percentuale rispetto al basale è utilizzato come parametro di misurazione della gravità colite. Valutazioni periodiche di sanguinamento rettale, diarrea, o prolasso può essere fatta a seconda degli obiettivi sperimentali e conformemente ai sistemi di valutazione diversi. 9, 10 </li><li> Una perdita di peso fino al 10% con 2-3 giorni di diarrea e sanguinamento rettale si può aspettare la settimana successiva un ciclo completo di DSS (osservazione quotidiana può essere utile in questo immediato post-DSS periodo). </li></ol> È possibile che alcuni topi non può recuperare; topi perdere superiore al 20% del loro peso sono meno probabilità di sopravvivere e possono richiedere eutanasia precoce. Una iniezione singolo IP di 0,5-1,0 ml di soluzione salina nei topi queste può essere una misura utile di sostegno di colmarlo frazio<html> del volume d persi a causa di diarrea. 3. Murine Endoscopia (opzionale) <ol><li> Endoscopia seguendo il ciclo secondo o terzo DSS può essere effettuata per confermare la crescita tumorale in vivo prima del sacrificio. Come il AOM / modello DSS è abbastanza affidabile nella produzione di tumori, questo passaggio non è generalmente necessario. Solo pochi topi dovrebbe valutati con questo metodo, in quanto ha il potenziale di distruggere i tumori del mouse 11. </li><li> Anestetizzare il mouse con sedazione per via inalatoria o iniettabili. </li><li> Dopo mouse è anestetizzato, fissare il mouse per una tavola piatta con nastro alla coda e al torace. </li><li> Far avanzare l&#39;endoscopio murino nel retto del mouse delicatamente con soluzione fisiologica per gonfiare e irrigare per migliorare vista intraluminale e rimuovere i contenuti fecali. (Si noti che l&#39;endoscopia può essere effettuata anche mediante insufflazione di aria come alternativa alla soluzione salina e questa tecnica può offrire una migliore visualizzazione del tumore. 12) </li></ol>e &quot;&gt; 4. del mouse sacrificio e raccolta Colon <ol><li> Il giorno 70, ogni AOM / DSS topo trattato dovrebbe ospitare tumori del colon più ed essere pronti per la valutazione. Questa data può essere ritardato di settimane o mesi, se i tumori più grandi si desiderano. (Da notare che i topi con prolasso rettale grave può essere necessario eutanasia presto per evitare disagi eccessivi per gli animali come per i comitati istituzionali la cura degli animali.) </li><li> Prima di necroscopia, individualmente eutanasia topi con isoflurano e dislocazione cervicale (o altro metodo istituzionalmente approvato). Peso finale e altre misurazioni possono essere effettuate in questo momento. </li><li> Posare il mouse con il suo lato ventrale esposto su un tagliere. Coprire l&#39;addome con etanolo 70% per evitare peli contamini il contenuto addominale durante l&#39;estrazione del colon. </li><li> Usare pinze per afferrare la linea mediana dell&#39;addome e fare una piccola incisione per esporre il peritoneo. </li><li> Estendere questa incisione su ciascun lato del ventre lungo la Margi costalen. </li><li> Utilizzare le forbici per tagliare attraverso il bacino in modo che il colon può essere raccolto alla giunzione ano-rettale. Questo è importante perché infortunio colite DSS è più grande al retto distale e corrispondentemente, questa è la regione di maggiore sviluppo tumorale. </li><li> Altri tessuti come i linfonodi mesenterici possono essere raccolti in questo momento. </li></ol> 5. Preparazione del colon per l&#39;analisi macroscopica <ol><li> Usando un ago 18G gavage attaccato ad una siringa da 5 ml, lavare il colon con gelida tampone fosfato salino (PBS) tale che esce fluido nella direzione fisiologica. Se il tessuto del colon verrà utilizzato per RNA o proteina-based analisi, può essere mantenuto freddo impiegando pre-raffreddate vassoi lavoro. </li><li> Aprire i due punti arrossato longitudinalmente lungo il suo mesentere e vernice sul vassoio freddo. I tumori sono più facilmente visualizzato quando il colon è posto su una superficie scura. In alternativa, 1% Alcian blue colorante può essere applicata per evidenziare tumors. Valutare il numero e le dimensioni del tumore, con un righello o un calibro digitale. </li><li> Piccole sezioni di tumore e tessuto normale adiacente possono essere asportati a questo punto per analisi future da RNA, proteine, o immunoistochimiche (IHC) metodi, lasciando una parte del colon rimanente per la valutazione istologica. </li></ol> Fotografia digitale dei campioni del colon lordi immediatamente successivi punto 5.2 può essere utile per l&#39;analisi precisa del carico tumorale, soprattutto se porzioni significative dei due punti vengono asportate per altre forme di analisi come descritto in precedenza. Massa tumorale (%) può essere calcolato come area tumorale / area totale del colon utilizzando software libero come ImageJ. 6. Preparazione del colon per la valutazione istologica <ol><li> Applicare formalina al 10% per i due punti rimanenti sul vassoio freddo tramite siringa o un dito. Consentendo di fissare il tessuto per almeno 30 secondi in questo modo facilita il trasferimento al bacino fissaggio. Assicurarsi che residua formalina è wiped off prima di dipingere i due punti nuova aperta sul vassoio stesso. </li><li> Trasferire i due punti di un bacino pieno di formalina al 10% e di definire con precisione sui bordi. </li><li> Dopo 3 ore di fissazione, di trasferire i due punti al 70% di etanolo. Due punti possono essere conservati in etanolo 70% indefinitamente. </li><li> Tre sezioni longitudinali colon (prossimale, intermedio, distale / retto) può essere stabilizzata in 2% agar e sottoposti paraffina. Assicurare che il colon prossimale e distale colon / retto sono orientati in modo uniforme per ciascun topo. </li><li> Displasia, danno cripta, e l&#39;infiammazione possono essere descritti e valutati da un individuo esperto secondo protocolli pubblicati in precedenza. 10, 13-15 I topi possono essere sacrificati prima del giorno 70 se lo sperimentatore è interessato a rilevare i primi eventi displasici. </li></ol> 7. Risultati rappresentativi L&#39;AOM / DSS modello descritto nel presente documento consente al ricercatore di generino tumori del colon nei topi.La crescita del tumore in questo modello è direttamente influenzato dal processo infiammatorio associato. Gravità colite deve essere monitorato clinicamente seguendo perdita di peso e la presenza di diarrea / hematochezia (Figura 2). Questi segni di attività della malattia tendono a iniziare 5 giorni del ciclo DSS e per quattro o più giorni dopo DSS viene rimosso. Raramente, i topi con un notevole carico di tumore rettale in grado di sviluppare prolasso rettale. Dopo il secondo o terzo ciclo di diarrea DSS può diventare persistente. Tipicamente tumori sono presenti e identificabili mediante colonscopia murino prima del terzo ciclo di DSS (Figura 3). Altro tempo e un terzo ciclo di risultati DSS in tumori di dimensioni maggiori al momento della raccolta (figura 4). Uso di applicazione topica Alcian colorazione blu può essere utilizzato per evidenziare tumori (Figura 5). Fotografie dei tumori del colon aiuterà a generare misurazioni tumorali che possono essere utilizzati per confrontare quantitativamente la produzione e la dimensione del tumoretra gruppi sperimentali (Figura 6). Fissi e paraffina campioni colon incorporati possono poi essere valutati per istologia o con l&#39;uso di colorazione immunoistochimica (Figure 7 e 8). <img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Schema di OMA e amministrazione DSS. AOM (10 mg / kg) viene iniettato il giorno 0. All&#39;inizio della seconda settimana (giorno 7), soluzione DSS 2,5% viene somministrato a topi nell&#39;acqua potabile. Sette giorni di DSS è seguita da due settimane di acqua autoclavato. Un ulteriore due cicli di DSS vengono somministrati prima del sacrificio. <img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Peso del mouse rispetto al basale durante OMA e amministrazione DSS. Si noti che nella settimana successiva ogni ciclo DSS, topi los<html> e 5-10% del loro peso corporeo. La perdita di peso in questo esperimento è un marker surrogato per gravità colite. <img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Veduta di tumori nel colon distale via murino endoscopia al giorno 50 di OMA / DSS trattamento. Nota masse multiple polipoidi ostruiscono il lume del colon distale (b, c) rispetto al colon normale (a). <img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Longitudinalmente aperto due punti del mouse illustra aspetto macroscopico di tumori. Nota l&#39;onere maggiore del tumore nel colon distale / retto (immagine in alto a sinistra), e la caratteristica consistenza ondulato del colon prossimale (immagine in alto a destra) con poca crescita tumorale. Un vicino di vista del colon distale mostra numerosi tumori di varie dimensioni (sotto). ove_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Tumori Figura 5. Evidenziati mediante l&#39;applicazione di Alcian blu macchia. Si noti come il colorante evidenzia la consistenza normale del colon, nonché i confini di ogni singolo tumore. Tale colorazione può essere utile per la misurazione precisa delle aree tumorali di righello o di misura digitale. <img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Distribuzione rappresentativa del numero medio dei tumori per topo trattati con AOM / DSS. Notare la maggior parte dei tumori sono localizzati nel colon distale e sono &lt;2 mm. <img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig7.jpg" alt="Figura 8" /> Figura 7. Incluse in paraffina sezioni longitudinali del colon in cassetta (sopra) und su vetrino dopo colorazione H &amp; E (sotto). Notare che Alcian blue residua macchia non interferisce con H &amp; E colorazione. Un tumore di grandi dimensioni è cerchiato sul l&#39;immagine della diapositiva (cerchiato). Le denominazioni &quot;distale&quot;, &quot;medio&quot; e &quot;&quot; risultato prossimale da sezionare tutto il colon in terzi tra il cieco e l&#39;ano. <img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig8.jpg" alt="Figura 8" /> Figura 8. Istologia rappresentante di un tumore derivante da OMA / DSS amministrazione nel colon distale. H &amp; E, BrdU, e vetrini colorati β-catenina a 50X (pannello in alto) e 400X (pannello in basso) rispettivamente dimostrare cambiamenti displastiche simili a adenocarcinomi umani del colon.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il trattamento dei topi con OMA e DSS rapidamente ed efficacemente i modelli umani colite associata a cancro. Ipotesi riguardanti i fattori ereditari contribuiscono alla colite tumori associati possono essere facilmente studiato con topi geneticamente. 13, 16 In alternativa, l&#39;effetto di bersagli farmacologici in colite associata a cancro può essere studiata utilizzando topi wild-type. Anche se questo modello è molto apprezzato da coloro che sono interessati allo studio dell...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> C57BL/6J Mice </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 000664 </td><td></td></tr><tr><td> Azoxymethane (AOM) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A5486-100MG </td><td> Soluzione stock: diluire a 10 mg / ml in acqua distillata per essere conservato a -20 ° C dello 0,5 - aliquote da 1 ml. Soluzione di lavoro: diluire magazzino a 1 mg / ml in isotonica (0,9%) soluzione salina </td></tr><tr><td> Destrano sodio solfato (DSS) </td><td> TdB Consulenza </td><td> DB001 </td><td> MW 40 kDa (36-50 kDa preparati provenienti da altre fonti sono accettabili; Lo stesso lotto deve essere utilizzato per un singolo esperimento) 6 </td></tr><tr><td> Coloviewsistema miniendoscopic </td><td> Karl Storz </td><td> Multiplo </td><td> Vedi Becker et al. Per una spiegazione dettagliata delle attrezzature e la configurazione 11. </td></tr><tr><td> TPP Rapid FilterMax flacone da 500 ml-Filter, 0,22 micron PES </td><td> Midwest scientifico </td><td> TP99500 </td><td> Ogni filtro standard coltura dei tessuti è accettabile </td></tr><tr><td> Alcool etilico 200 Proof ASC / USP </td><td> Farmaco-AAPER (o altro) </td><td> 11ACS200 </td><td> Diluire al 70% in acqua distillata </td></tr><tr><td> Isoflurano, USP </td><td> Butler Animal Health di alimentazione </td><td> 4029405 </td><td> Topo Mettere in vaso di vetro con una garza o un piccolo panno imbevuto di anestetico </td></tr><tr><td> 18G ago dritto Gavage </td><td> Braintree scientifico </td><td> N-008 </td><td></td></tr><tr><td> Soluzione tampone fosfato (PBS) </td><td> SigmaAldrich </td><td> P5493 </td><td> Diluire a 1X (0,01 M) in acqua distillata </td></tr><tr><td> Vassoio freddo (tavola Tissue Tek II a freddo) </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9491941 </td><td> Conservare a -20 ° C </td></tr><tr><td> ImageJ Software </td><td> NIH (download gratuito) </td><td></td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </td></tr><tr><td> Formaldeide (37%) </td><td> Fisher Scientific </td><td> F79-500 </td><td> Diluire al 10% in PBS </td></tr><tr><td> BD Bacto Agar </td><td> Fisher Scientific </td><td> DF0140-01-0 </td><td> Utilizzare piastra per creare soluzione al 2% in acqua distillata </td></tr><tr><td> Miltex Eye Dressing Pinze </td><td> MedPlus Inc. </td><td> 18-780 </td><td></td></tr><tr><td> Miltex Eye Forbici </td><td> MedPlus Inc. </td><td> 18-1430 </td> &lt;td&gt; punti curvi evitare danni al colon in fase di apertura. </td></tr><tr><td> Alcian Blu 8GX (polvere) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A5268 </td><td> Aggiungere 1 g di polvere per 100 ml di acido acetico al 3% (3 ml di acido acetico glaciale + 97 ml di acqua distillata) </td></tr><tr><td> 1 ml siringa da tubercolina con annesso 26 G x 3/8 ago smusso intradermica </td><td> BD </td><td> 305946 </td><td> Per l&#39;iniezione di OMA </td></tr></tbody></table>

modeling colitis-associated cancer with azoxymethane (aom) and dextran sulfate sodium (dss)

I soggetti con malattia infiammatoria intestinale (IBD), come il morbo di Crohn (CD) o la colite ulcerosa (UC) sono ad aumentato rischio di sviluppare il cancro del colon-retto (CRC) su individui sani. Questo rischio è proporzionale alla durata e l&#39;estensione della malattia, con una incidenza cumulativa fino al 30% in individui con UC di lunga data con ampio coinvolgimento del colon. 1 displasia del colon in IBD e la colite associata cancro (CAC) si ritiene che si sviluppano come conseguenza di ripetuti cicli di lesione cellulare epiteliale e la riparazione mentre queste cellule sono immersi in un ambiente citochina infiammatoria cronica. 2 Mentre cancri spontanei e colite associata parti la qualità di adenocarcinomi essendo, la sequenza di eventi molecolari sottostanti si crede di essere diverso. 3 Questo distinzione sostiene la necessità di modelli animali specifici di CAC. Modelli murini diversi esistono attualmente per lo studio di CAC. Destrano solfato Sodium (DSS), un agente con effetti tossici diretti sul epitelio del colon, può essere somministrata in acqua potabile a topi in più cicli per creare uno stato infiammatorio cronico. Con durata sufficiente, alcuni di questi topi svilupperanno tumori. 4 sviluppo tumorale è accelerato in questo modello se somministrato in un pro-cancerogene impostazione. Questi includono i topi con mutazioni genetiche nei percorsi tumorigenesi (APC, p53, MSH2), così come topi pre-trattati con agenti genotossici (azoxymethane [AOM], 1,2-dimetilidrazina [DMH]) 5. La combinazione di DSS con OMA come modello per il cancro colite associata ha guadagnato popolarità per la sua riproducibilità, potenza, prezzo basso, e facilità d&#39;uso. Se hanno un meccanismo condiviso, AOM è stato trovato per essere più potente e stabile in soluzione di DMH. Mentre lo sviluppo del tumore in altri modelli generalmente richiede diversi mesi, topi iniettati con AOM e successivamente trattato con DSS sviluppano tumori adeguate in uns soli 7-10 settimane. 6, 7 Infine, AOM e DSS può essere somministrato a topi di qualsiasi background genetico (knock out, transgenica, ecc) senza incroci per un ceppo specifico oncogeno. Qui, dimostriamo un protocollo per l&#39;infiammazione-driven tumorigenesi del colon nei topi utilizzando una singola iniezione di OMA seguito da tre cicli di sette giorni di DSS per un periodo di 10 settimane. Questo modello induce tumori con alterazioni istologiche e molecolari molto simili a quelle che si verificano in CAC umana e fornisce un modello di grande valore per lo studio della oncogenesi e chemioprevenzione in questa malattia. 8

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Modeling Colitis-Associated Cancer with Azoxymethane AOM and Dextran Sulfate Sodium DSS

Dimostriamo un protocollo in cui somministrazione del azoxymethane agente genotossico (AOM) seguito da tre cicli di pro-infiammatoria agente destrano solfato di sodio (DSS) rapidamente e genera costantemente tumori del colon in topi con somiglianze morfologiche e molecolari a quelli osservati negli colite umana cancro-associata.

Modellazione Colite-Associated Cancro con azoxymethane (OMA) e sodio solfato destrano (DSS)

Individuals with inflammatory bowel disease (IBD), such as Crohn's disease (CD) or ulcerative colitis (UC) are at increased risk of developing colorectal ...

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Modeling Colitis-Associated Cancer with Azoxymethane (AOM) and Dextran Sulfate Sodium (DSS)

46.6K Views.  Washington University School of Medicine. Dimostriamo un protocollo in cui somministrazione del azoxymethane agente genotossico (AOM) seguito da tre cicli di pro-infiammatoria agente destrano solfato di sodio (DSS) rapidamente e genera costantemente tumori del colon in topi con somiglianze morfologiche e molecolari a quelli osservati negli colite umana cancro-associata.

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Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are very limited. To meet the need for novel therapeutic approaches, experimental stroke research frequently employs rodent models of focal cerebral ischaemia. Most researchers use permanent or transient occlusion of the middle cerebral artery (MCA) in mice or rats.
Proximal occlusion of the middle cerebral artery (MCA) via the intraluminal suture technique (so called filament or suture model) is probably the most frequently used model in experimental stroke research. The intraluminal MCAO model offers the advantage of inducing reproducible transient or permanent ischaemia of the MCA territory in a relatively non-invasive manner. Intraluminal approaches interrupt the blood flow of the entire territory of this artery. Filament occlusion thus arrests flow proximal to the lenticulo-striate arteries, which supply the basal ganglia. Filament occlusion of the MCA results in reproducible lesions in the cortex and striatum and can be either permanent or transient. In contrast, models inducing distal (to the branching of the lenticulo-striate arteries) MCA occlusion typically spare the striatum and primarily involve the neocortex. In addition these models do require craniectomy. In the model demonstrated in this article, a silicon coated filament is introduced into the common carotid artery and advanced along the internal carotid artery into the Circle of Willis, where it blocks the origin of the middle cerebral artery. In patients, occlusions of the middle cerebral artery are among the most common causes of ischaemic stroke. Since varying ischemic intervals can be chosen freely in this model depending on the time point of reperfusion, ischaemic lesions with varying degrees of severity can be produced. Reperfusion by removal of the occluding filament at least partially models the restoration of blood flow after spontaneous or therapeutic (tPA) lysis of a thromboembolic clot in humans.
In this video we will present the basic technique as well as the major pitfalls and confounders which may limit the predictive value of this model.

Filamentous occlusion of the Middle cerebral artery is a common model for studying ischemic stroke in mice.

Corsa di modellazione in Mouse - Medio occlusione dell&#39;arteria cerebrale con il Modello Filament

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are ...

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Medicina

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy tissue is the root cause of disease and death. For other cancers (e.g. breast, lung, etc.), it is the process of metastasis, in which tumor cells move from a primary tumor mass, colonize distal sites and ultimately contribute to organ failure, that eventually leads to morbidity and mortality 3. It has been estimated that invasion and metastasis are responsible for 90&#37; of cancer deaths 4. As a result, there has been intense interest in identifying the molecular processes and critical protein mediators of invasion and metastasis for the purposes of improving diagnosis and treatment 5.
A challenge for cancer scientists is to develop invasion assays that sufficiently resemble the in vivo situation to enable accurate disease modeling 6. Two-dimensional cell motility assays are only informative about one aspect of invasion and do not take into account extracellular matrix (ECM) protein remodeling which is also a critical element. Recently, research has refined our understanding of tumor cell invasion and revealed that individual cells may move by elongated or rounded modes 7. In addition, there has been greater appreciation of the contribution of collective invasion, in which cells invade in strands, sheets and clusters, particularly in highly differentiated tumors that maintain epithelial characteristics, to the spread of cancer 8.
We present a refined method 9 for examining the contributions of candidate proteins to collective invasion 10. In particular, by engineering separate pools of cells to express different fluorescent proteins, it is possible to molecularly dissect the activities and proteins required in leading cells versus those required in following cells. The use of RNAi provides the molecular tool to experimentally disassemble the processes involved in individual cell invasion as well as in different positions of collective invasion. In this procedure, mixtures of fluorescently-labeled cells are plated on the bottom of a Transwell insert previously filled with Matrigel ECM protein, then allowed to invade "upwards" through the filter and into the Matrigel. Reconstruction of z-series image stacks, obtained by confocal imaging, into three-dimensional representations allows for visualization of collectively invading strands and analysis of the representation of fluorescently-labeled cells in leading versus following positions.

Models of tumor cell invasion into three-dimensional extracellular matrix better reflect the in vivo situation than two-dimensional motility assays. Using matrix invasion assays combined with confocal imaging of fluorescently-labeled cells, detailed information on invasion modes and the distinct contributions of leading versus following cells can be obtained.

Modellazione e imaging 3-Dimensional Invasion cella Collettiva

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical treatments and improved platinum-based chemotherapies, there has been little improvement in EOC survival rates for more than four decades 1,2. Whilst stage I tumors have 5-year survival rates &gt;85%, survival rates for stage III/IV disease are &lt;40%. Thus, the high rates of mortality for EOC could be significantly decreased if tumors were detected at earlier, more treatable, stages 3-5. At present, the molecular genetic and biological basis of early stage disease development is poorly understood. More specifically, little is known about the role of the microenvironment during tumor initiation; but known risk factors for EOCs (e.g. age and parity) suggest that the microenvironment plays a key role in the early genesis of EOCs. We therefore developed three-dimensional heterotypic models of both the normal ovary and of early stage ovarian cancers. For the normal ovary, we co-cultured normal ovarian surface epithelial (IOSE) and normal stromal fibroblast (INOF)&nbsp;cells, immortalized by retrovrial transduction of the catalytic subunit of human telomerase holoenzyme (hTERT) to extend the lifespan of these cells in culture. To model the earliest stages of ovarian epithelial cell transformation, overexpression of the CMYC oncogene in IOSE cells, again co-cultured with INOF cells. These heterotypic models were used to investigate the effects of aging and senescence on the transformation and invasion of epithelial cells. Here we describe the methodological steps in development of these three-dimensional model; these methodologies aren't specific to the development of normal ovary and ovarian cancer tissues, and could be used to study other tissue types where stromal and epithelial cell interactions are a fundamental aspect of the tissue maintenance and disease development.

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

We describe methodologies for establishing in vitro heterotypic three-dimensional models comprising ovarian fibroblasts and normal ovarian surface or ovarian cancer epithelial cells. We discuss the use of these models to study stromal-epithelial interactions that occur during ovarian cancer development.

Eterotipica tridimensionale<em&gt; In Vitro</emModellazione&gt; di stromale-epiteliali interazioni Durante iniziazione e la progressione del cancro ovarico

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the occurrence of subretinal hemorrhage can affect photoreceptor cell death in the detached retina. Hence, it is advantageous to create reproducible RDs without subretinal hemorrhage for evaluating photoreceptor cell death. We modified a previously reported method to create bullous and persistent RDs in a reproducible location with rare occurrence of subretinal hemorrhage. The critical step of this modified method is the creation of a self-sealing scleral incision, which can prevent leakage of sodium hyaluronate after injection into the subretinal space. To make the self-sealing scleral incision, a scleral tunnel is created, followed by scleral penetration into the choroid with a 30 G needle. Although choroidal hemorrhage may occur during this step, astriction with a surgical spear reduces the rate of choroidal hemorrhage. This method allows a more reproducible and reliable model of photoreceptor death in diseases that involve RD such as rhegmatogenous RD, retinopathy of prematurity, diabetic retinopathy, central serous chorioretinopathy, and age-related macular degeneration (AMD).

Creating experimental retinal detachments with a reproducible and sustained height of detachment, and without subretinal hemorrhage, is important for studying the pathophysiology of photoreceptor cell loss in retinal disease and evaluating potential therapeutic interventions. Here, we report such a method in detail.

Distacco della retina Modello in Roditori da iniezione sottoretinico di ialuronato di sodio

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Modeling Spontaneous Metastatic Renal Cell Carcinoma (mRCC) in Mice Following Nephrectomy

One of the key challenges to improved testing of new experimental therapeutics in renal cell carcinoma (RCC) is the development of models that faithfully recapitulate early- and late-stage metastatic disease progression. Typical tumor implantation models utilize ectopic or orthotopic primary tumor implantation, but few include systemic spontaneous metastatic disease that mimics the clinical setting. This protocol describes the key steps to develop RCC disease progression stages similar to patients. First, it uses a highly metastatic mouse tumor cell line in a syngeneic model to show orthotopic tumor cell implantation. Methods include superficial and internal implantation into the sub-capsular space with cells combined with matrigel to prevent leakage and early spread. Next it describes the procedures for excision of tumor-bearing kidney (nephrectomy), with critical pre- and post- surgical mouse care. Finally, it outlines the steps necessary to monitor and assess micro-and macro-metastatic disease progression, including bioluminescent imaging as well provides a detailed visual necropsy guide to score systemic disease distribution. The goal of this protocol description is to facilitate the widespread use of clinically relevant metastatic RCC models to improve the predictive value of future therapeutic testing.&#160;

Modeling Spontaneous Metastatic Renal Cell Carcinoma mRCC in Mice Following Nephrectomy

Models of spontaneous metastatic renal cell carcinoma (RCC) disease progression can be used for evaluating treatments in a clinically relevant setting. This protocol demonstrates different procedures for orthotopic kidney tumor cell implantation, proper nephrectomy, and finally outlines a necropsy guide for visual and bioluminescent scoring of metastatic burden and localization.

Modellazione di Carcinoma renale metastatico spontanea (MRCC) in topi dopo nefrectomia

One of the key challenges to improved testing of new experimental therapeutics in renal cell carcinoma (RCC) is the development of models that faithfully ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

Lavorare con tessuti umani per Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

Modeling Encephalopathy of Prematurity Using Prenatal Hypoxia-ischemia with Intra-amniotic Lipopolysaccharide in Rats

Encephalopathy of prematurity (EoP) is a term that encompasses the central nervous system (CNS) abnormalities associated with preterm birth. To best advance translational objectives and uncover new therapeutic strategies for brain injury associated with preterm birth, preclinical models of EoP must include similar mechanisms of prenatal global injury observed in humans and involve multiple components of the maternal-placental-fetal system. Ideally, models should produce a similar spectrum of functional deficits in the mature animal and recapitulate multiple aspects of the pathophysiology. To mimic human systemic placental perfusion defects, placental underperfusion and/or chorioamnionitis associated with pathogen-induced inflammation in early preterm birth, we developed a model of prenatal transient systemic hypoxia-ischemia (TSHI) combined with intra-amniotic lipopolysaccharide (LPS). In pregnant Sprague Dawley rats, TSHI via uterine artery occlusion on embryonic day 18 (E18) induces a graded placental underperfusion defect associated with increasing CNS damage in the fetus. When combined with intra-amniotic LPS injections, placental inflammation is increased and CNS damage is compounded with associated white matter, gait and imaging abnormalities. Prenatal TSHI and TSHI+LPS prenatal insults meet several of the criteria of an EoP model including recapitulating the intrauterine insult, causing loss of neurons, oligodendrocytes and axons, loss of subplate, and functional deficits in adult animals that mimic those observed in children born extremely preterm. Moreover, this model allows for the dissection of inflammation induced by divergent injury types.

Encephalopathy of prematurity encompasses the central nervous system abnormalities associated with injury from preterm birth. This report describes a clinically relevant rat model of in utero transient systemic hypoxia-ischemia and intra-amniotic lipopolysaccharide administration (LPS) that mimics chorioamnionitis, and the related impact of infectious stimuli and placental underperfusion on CNS development.

Modellazione Encefalopatia di prematurità Utilizzando prenatale ipossia-ischemia con Lipopolisaccaride intra-amniotico in ratti

Encephalopathy of prematurity (EoP) is a term that encompasses the central nervous system (CNS) abnormalities associated with preterm birth. To best ...

Modeling the Early Steps of Ovarian Cancer Dissemination in an Organotypic Culture of the Human Peritoneal Cavity

The pattern of ovarian cancer metastasis is markedly different from that of most other epithelial tumors, because it rarely spreads hematogenously. Instead, ovarian cancer cells exfoliated from the primary tumor are carried by peritoneal fluid to metastatic sites within the peritoneal cavity. These sites, most notably the abdominal peritoneum and omentum, are organs covered by a mesothelium-lined surface. To investigate the processes of ovarian cancer dissemination, we assembled a complex three-dimensional culture system that reconstructs the lining of the peritoneal cavity in vitro. Primary human fibroblasts and mesothelial cells were isolated from human omentum. The fibroblasts were then mixed with extracellular matrix and covered with a layer of the primary human mesothelial cells to mimic the peritoneal and omental surfaces encountered by metastasizing ovarian cancer cells. The resulting organotypic model is, as shown, used to examine the early steps of ovarian cancer dissemination, including cancer cell adhesion, invasion, and proliferation. This model has been used in a number of studies to investigate the role of the microenvironment (cellular and acellular) in early ovarian cancer dissemination. It has also been successfully adapted to high throughput screening and used to identify and test inhibitors of ovarian cancer metastasis.

Here, we present a protocol to construct a three-dimensional in vitro model of the lining of the peritoneal cavity, composed of primary human mesothelial cells and fibroblasts layered with extracellular matrix, as a tool to investigate ovarian cancer cell adhesion, invasion, and proliferation.

Modellazione Piazza precoci di cancro ovarico Diffusione in una cultura Organotipica della Cavità peritoneale umano

The pattern of ovarian cancer metastasis is markedly different from that of most other epithelial tumors, because it rarely spreads hematogenously. ...

Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and progress in this site. The model presented in the current report utilizes human primary bone marrow stromal cells and osteoblasts as two representative cell types from the marrow niche that influence tumor cell phenotype. The in vitro co-culture conditions described for human leukemic cells with these primary niche components support the generation of a chemoresistant subpopulation of tumor cells that can be efficiently recovered from culture for analysis by diverse techniques. A strict feeding schedule to prevent nutrient fluxes followed by gel type 10 cross-linked dextran (G10) particles recovery of the population of tumor cells that have migrated beneath the adherent bone marrow stromal cells (BMSC) or osteoblasts (OB) generating a "phase dim" (PD) population of tumor cells, provides a consistent source of purified therapy resistant leukemic cells. This clinically relevant population of tumor cells can be evaluated by standard methods to investigate apoptotic, metabolic, and cell cycle regulatory pathways as well as providing a more rigorous target in which to test novel therapeutic strategies prior to pre-clinical investigations targeted at minimal residual disease.

Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro

The current report summarizes a protocol that can be utilized to model the influence of the bone marrow microenvironment niche on leukemic cells with emphasis placed on enrichment of the most chemoresistant subpopulation.

Modellazione chemioterapia leucemia resistente<em&gt; In Vitro</em

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and ...

Modeling and Simulations of Olfactory Drug Delivery with Passive and Active Controls of Nasally Inhaled Pharmaceutical Aerosols

There are many advantages of direct nose-to-brain drug delivery in the treatment of neurological disorders. However, its application is limited by the extremely low delivery efficiency (&#60; 1%) to the olfactory mucosa that directly connects the brain. It is crucial to develop novel techniques to deliver neurological medications more effectively to the olfactory region. The objective of this study is to develop a numerical platform to simulate and improve intranasal olfactory drug delivery. A coupled image-CFD method was presented that synthetized the image-based model development, quality meshing, fluid simulation, and magnetic particle tracking. With this method, performances of three intranasal delivery protocols were numerically assessed and compared. Influences of breathing maneuvers, magnet layout, magnetic field strength, drug release position, and particle size on the olfactory dosage were also numerically studied.
From the simulations, we found that clinically significant olfactory dosage (up to 45%) were feasible using the combination of magnet layout and selective drug release. A 64 -fold higher delivery of dosage was predicted in the case with magnetophoretic guidance compared to the case without it. However, precise guidance of nasally inhaled aerosols to the olfactory region remains challenging due to the unstable nature of magnetophoresis, as well as the high sensitivity of olfactory dosage to patient-, device-, and particle-related factors.

This manuscript reviews the modeling and simulations of different protocols to deliver medications to the olfactory region in image-based nasal airway models. Multiple software modules are used to develop the anatomically accurate nose model, generate computational mesh, simulate nasal airflows, and predict particle deposition at the olfactory region.

Modellazione e simulazioni di olfattiva Drug Delivery con i controlli passivi e attivi della nasale per via inalatoria farmaceutici Aerosol

There are many advantages of direct nose-to-brain drug delivery in the treatment of neurological disorders. However, its application is limited by the ...

Methods Article

Modellazione Colite-Associated Cancro con azoxymethane (OMA) e sodio solfato destrano (DSS)