Wir danken M. Winkelbauer-Hurt, E. Ibrahim, S. Valencia, K. Dufu, H. Cheng für hilfreiche Diskussionen. HeLa-Zellen wurden vom National Zellkultur Center (Minneapolis, MN) erhalten. Wir danken auch Eisai Co., Ltd für die Bereitstellung von E7107 und das Nikon Imaging Center an der Harvard Medical School für die Hilfe bei der Lichtmikroskopie. Diese Arbeit wurde durch ein NIH GM043375 zu RR und EGF und NRSA Gemeinschaft unterstützt werden, um JLH.

1. Wachsenden HeLa Zellen für Nuclear Extraction <ol><li> Tafel HeLa-Zellen auf drei 150 mm-Platten mit DMEM-Medium, ergänzt mit 10% FBS und 1% Penicillin / Streptomycin. Wachsen in einem 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2, bis die Zellen 90% konfluent sind. </li></ol> Tip-Split-Zellen 1.10 von einer konfluenten Platte und Ernte 3 Tage nach der Trennung. Tipp-Eine zusätzliche Platte kann bei gezüchtet werden nicht genügend Zellen mit drei Platten (zum Beispiel, wenn die Zellen weniger als 90% konfluent sind). 2. Bereiten Sie und Chill Nuclear Extract Solutions <ol><li> Bereiten Sie frische Lösungen, wie in Tabelle 2 dargestellt. </li><li> Aliquot von 10 ml hypotonischen Puffer in ein 15 ml Falcon-Röhrchen. Aliquot von 1 ml Puffer mit hohem Salzgehalt und 1 ml Puffer mit niedrigem Salzgehalt in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Kühlen Sie die Puffer auf Eis. Fügen Sie die entsprechenden Volumina von PMSF und DTT auf jeden Puffer unmittelbar vor der Verwendung (siehe <strong&gt; Tabelle 1). </li></ol> 3. Ernte HeLa-Zellen für Nuclear Extraction <ol><li> Saugen Sie Medien aus den Zellen und waschen Sie die Zellen einmal mit 13 ml Raumtemperatur 1X PBS pro Platte. </li><li> Saugen Sie das PBS-Waschung. </li></ol> Tip-Saugen so viel von der PBS wie möglich, indem zunächst aspirierenden, dann steht die Platte auf seiner Seite, einige Sekunden warten, und Absaugen der Ruhe. <ol start="3"><li> Wenn eine Zelle Heber, kratzen Zellen bis zum unteren Rand der Platten, und anschließend die Zellen in ein Eppendorf-Röhrchen. Vermeiden Sie Blasen. Die 3 Platten abgekratzt Zellen sollten in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen passen. </li></ol> Tipp-Es ist einfacher, das Volumen der Zellen abzuschätzen, ob ein Eppendorf-Röhrchen verwendet wird. Für Scale-up, Falcon-Röhrchen verwenden. <ol start="4"><li> Zentrifugieren bei 4 ° C in einer Mikrozentrifuge für 5 min bei 100 xg die Zellen zu pelletieren. </li></ol> 4. Swell HeLa-Zellen in hypotonischen Puffer </p&gt; <ol><li> Vorsichtig absaugen PBS vom Zellpellet und schätzen Sie die gepackten Zellvolumens (PCV), indem Sie die Gradation auf dem Schlauch. Drei konfluenten Platten von HeLa-Zellen liefern etwa 500 ul von PCV. </li><li> Hinzufügen weiterer 2X die PCV von hypotonischen Puffer zu dem Zellpellet. Vorsichtig schütteln, um die Zellen zu resuspendieren. Verwenden Sie einen P1000 Pipetman zu Erythrozyten vorsichtig resuspendieren durch Auf-und Abpipettieren, wenn nötig. </li><li> Zentrifugieren bei 4 ° C in einer Mikrozentrifuge für 5 min bei 100 xg die Zellen zu pelletieren. * Die Zellen werden begonnen, zu diesem Zeitpunkt quellen haben, und das Zellvolumen sollte nun etwa 750 ul-1000 pl ist. </li><li> Vorsichtig absaugen hypotonischen Puffer und fügen Sie neue hypotonischen Puffer auf ein Endvolumen von 1,5 ml. Die Zellen. </li><li> Inkubieren der resuspendierten gequollenen Zellen auf Eis für 10 min. </li></ol> 5. Lyse Zellen unter Verwendung eines Dounce Homogenisator <ol><li> Verwenden Sie hypotonischen Puffer, um die Dounce spülen und dann entspannen sie auf Eis. Wischen Sie den Stößel mit einem trockenen heikle Aufgabe wiper (zB Kimwipe). Entfernen Sie die restlichen Puffer von der Dounce mit einem 1000 ul erweiterten Mikropipettenspitze. </li><li> Übertragen geschwollenen Zellen in die Dounce. Bewegen Sie den engen Pistill der Dounce auf und ab 5 Mal, um die Zellen zu lysieren, wobei darauf zu Blasen zu vermeiden. </li><li> Assay zur Zelllyse unter Verwendung eines 5 ul Aliquot von Zellen aus dem Dounce. Setzen Sie den aliquoten in ein Eppendorf-Röhrchen und ein gleiches Volumen von Trypanblau. Den Teig auf einem Objektträger und untersuchen Sie die Zellen mit einem Lichtmikroskop. Die Kerne der lysierten Zellen erscheinen blau. Etwa 90% Lyse ist ideal. </li></ol> Tipp-Die Anzahl der die Zellen dounced werden sollen, werden in Abhängigkeit von der Dichtheit des Dounce. Bei der Durchführung dieses Protokoll zum ersten Mal, bestimmen die Anzahl der Male, die von der Durchführung von Schritt 5,3 nach jedem Schlag mit dem Dounce Dounce. Nicht über-Dounce, wird übermäßige Douncing zerstören die Kerne. <ol start="4"><li> Übertragen der lysierten Zellen zu einem vorher chilled Eppendorf-Röhrchen und Spin in einem 4 ° C Mikrozentrifuge 5 min bei 1500 × g. Das Pellet enthält die Kerne. Vorsichtig den Überstand in ein neues Röhrchen ohne Unterbrechung der Kerne. Der Überstand enthält das Zytoplasma. </li></ol> Tipp-Das Zytoplasma kann als solches verwendet werden oder weiter zu einem S100 verarbeitet mit dem gleichen High-Speed-Spin für Bulk-Extrakte (siehe 1 zur Herstellung eines aktiven S100 von Schüttgut auszugsweise) verwendet. 6. Salz-Extrahieren Sie die Kerne <ol><li> Schätzen Sie die Packed Kernvolumen (PNV), indem Sie die Gradation auf dem Schlauch. Ein PCV von 500 ul der Regel ergibt sich eine PNV von 400 ul. </li><li> In ½ X PNV der Puffer mit niedrigem Salzgehalt zu den Kernen durch Einsetzen eines Mikropipettenspitze dem Boden des Röhrchens und langsam Spritzen die Puffer in die Kerne unter vorsichtigem Mischen. Nicht Pipette auf und ab. Sanft Flick die Rohre, um sicherzustellen, dass das Pellet vollständig im Puffer mit niedrigem Salzgehalt, bevor Sie fortfahren resuspendiert. </li> &lt;li&gt; Add ½ X PNV von Puffer mit hohem Salzgehalt und schnell mischen 1 Mal durch Invertieren des Röhrchens. Nicht schütteln. Drehen bei 4 ° C für 30 min. </li></ol> Tip-Seien Sie sanft mit den Kernen, wenn sie in Puffer mit hoher Salzkonzentration zu vermeiden, sind sie Lyse. <ol start="4"><li> Drehen bei 4 ° C in einer Mikrozentrifuge für 15 min bei 18.000 × g. Der Überstand ist der hohe Salz Kernextrakt (HS-NE). Drei Platten von Zellen liefern typischerweise 500-600 ul der HS-NE. </li></ol> 7. Konzentrieren Sie sich und Dialysieren des Kernextrakt <ol><li> Übertragen Sie 500 ul des HS-NE in gekühlte Mini-centricons (Amicon) und Spin für 50 min bei 4 ° C in einer Mikrozentrifuge bei 14000 x g. Kehren Sie die Mini-Centricon (Amicon) und legen Sie sie in einem neuen Eppendorf-Röhrchen. Spin für 2 min bei 4 ° C 1000 × g, um den HS-NE erholen. Das HS-NE wird auf ca. 115 ul konzentriert werden. </li><li> Mit einem P200 Pipetman, übertragen 45 ul Aliquots der HS-NE in Mini-Dialyse-Slide-a-lysatoren, und legen Sie sie in 500 ml gekühltes Dialysepuffer. Die Unterseite der Slide-A-Lyzer mit dem Boden des Schwimmers ausgerichtet ist. Rühren für 1-2 Stunden bei 4 ° C Die NE erscheint nach der Dialyse bewölkt. </li></ol> Tipp-nicht zentrifugieren, um die trübe Niederschlag, der nach der Dialyse beobachtet wird, zu entfernen, da dies Zentrifugation reduziert die Aktivität des Extrakts. <ol start="3"><li> Die NE kann sofort verwendet werden oder aliquotiert. Aliquots sollten in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 ° C. Der NE können gespeichert werden und durchlaufen mindestens zwei Gefrier-Auftau-Zyklen ohne Aktivität. </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse Vor kurzem wurden effizient in vitro Systeme zur Kopplung RNAP II die Transkription zu Spleißen 5.2 entwickelt. Diese Systeme eingesetzt HeLa-Zellen in der Masse geworden und sind daher nicht geeignet, um schnell Testen der Wirkungen von spezifischen zellulären Behandlungen mit mehreren Proben. Basierend auf diese Notwendigkeit einnd der allgemeine Nutzen eines kleinen Auszug Protokoll (siehe Diskussion), haben wir eine robuste kleine Kernextrakt Methode. Repräsentative Daten einen Vergleich der RNAP II Transkription / Spleißreaktion im kleinen Maßstab Kernextrakt mit dem Bulk-nuklearen Extrakt wird in Abbildung 2 dargestellt. Ein CMV-DNA-Konstrukts, welches den CMV-Promotor enthält und kodiert für ein Standard-Spleißen Substrat (Ftz 3, 2A) für die Analyse verwendet. Wenn dieses Konstrukt in der Masse (Spuren 1-3) oder im kleinen Maßstab (Bahnen 4-6)-Extrakt inkubiert wurde, wurden ähnliche Niveaus der entstehenden prä-mRNA durch die 5 Minuten-Zeitpunkt (2, Spuren 1 und 4 synthetisiert ). Nach Zugabe von α-Amanitin, um weitere Transkription zu blockieren, die Spleißzwischenprodukte und gespleißte Produkte im Laufe der Zeit mit ähnlichen Kinetiken in beiden Arten von Extrakten (2, Spuren 2, 3, 5, 6) akkumuliert. Diese repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass die Effizienz des Putsches<html> LED RNAP II Transkription / Spleißen System ähnelt in den Bulk-und kleinräumige Kernextrakten. Um die Nützlichkeit der kleinen Extrakt Methode zu veranschaulichen, wurden Extrakte aus HeLa-Zellen mit dem Spleißen Inhibitor, E7107 oder der negativen Kontrolle Verbindung pladienolide F 6,7 und dann die gekoppelten Transkription RNAP II / Spleißen Assay wurde durchgeführt behandelt hergestellt. Wie in 3, die Transkription durch RNAP II aufgetreten effizient in Extrakten aus sowohl der Pladienolide F E7107 und behandelten Zellen (10 min Zeitpunkten) ausgearbeitet wurde. Im Gegensatz dazu traten Spleißen in der Regel in dem Extrakt aus den Pladienolide F-behandelten Zellen hergestellt, jedoch wurde in den E7107-behandelten Zellen abgeschafft (Abbildung 3, 20-60 min Zeit Punkte). Diese Daten liefern Proof of Concept für die Nutzung der kleinräumigen Kernextrakten zur speziellen Behandlung der Zellen im kleinen Maßstab. jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Schematische Darstellung der Small-scale-Extrakt-Protokoll. Schritt P1. Die Zellen werden als Monolayer gewachsen ist, geerntet von den Platten unter Verwendung einer Zelle Hebevorrichtung und geschwollen durch die Zugabe von hypotonischen Puffer. Schritt P2. Zellen werden lysiert unter Verwendung eines Dounce-Homogenisator und zentrifugiert, um die Kerne Pellet. Schritt P3. Zellkerne werden aus dem Zytoplasma getrennt und Salzgewinnung unterzogen. Schritt P4. Die nukleare Extrakt konzentriert und dialysiert. Schritt P5. Ergebnisse sind, dass zeigen, dass Kernextrakten funktionsfähig sind (siehe Abbildung 2 für näher) erhalten. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/4140/4140fig2.jpg" /> Abbildung 2. Small-scale Kernextrakten sind in einem gekoppelten RNAP II Transkription / Spleißen Assay robust. A. Schematische Darstellung des CMV-DNA-Matrize für Ftz gekoppelten RNAP II Transkription / Spleißen verwendet. Der CMV-Promotor und die Größen der Exons und Introns sind angegeben. B. Vergleich der gekoppelten RNAPII Transkription / Splicing-Assay unter Verwendung von entweder lose Kernextrakt oder kleinräumige Kernextrakt. α-Amanitin zugegeben nach 5 min der Transkription und Spleißen wurde für 30 und 60 min auf. RNA wurde extrahiert und fraktioniert und auf einem 5% igen denaturierenden Polyacrylamidgel detektiert durch Phosphoimager. Die Spleißzwischenprodukte und Produkte angegeben. Die endogene U6 snRNA und tRNA im Extrakt und die 32 während der Inkubation P-markierten angegeben sind. Siehe 3 für ein detailliertes Protokoll über die gekoppelte Transkription RNAP II / Spleißsystem. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4140/4140fig3.jpg" /> Abbildung 3. Small-scale nuklearen Extrakten aus HeLa-Zellen mit dem Inhibitor Splicing Medikament behandelt E7107 vorbereitet sind defekt beim Spleißen. Zellen mit 3 uM Pladienolide behandelt wurden als F oder E71076 beschrieben, und dann verwendet, um kleine Kernextrakten herzustellen. Ein Zeitverlauf wurde unter Verwendung des gleichen Transkription / Spleißen Assay, wie in 2 durchgeführt. Die Spleißzwischenprodukte und Produkte, und U6 snRNA und tRNA sind angegeben.

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Wir haben eine schnelle und reproduzierbare Verfahren zur Herstellung von Kernextrakten von kleinen Mengen von HeLa-Zellen als Monolayer gewachsen eingerichtet. Wir haben gezeigt, dass diese Extrakte robust durch die zeigen, dass die Kinetik und Effizienz der RNAP II Transkription / Spleißen Assays ähnlich in den Klein-und Bulk-Kernextrakten sind. Wir zeigten den Nutzen der Extrakte durch den Nachweis, dass Extrakte aus Zellen mit einem Medikament behandelt Inhibitor Spleißen vorbereitet aktiv sind, für die Transkription aber defekt beim Spleißen. Unsere Methode zur Herstellung kleinen nukleären Extrakten wurde durch Kombinieren und Optimierung von Methoden zur Herstellung zuvor Extrakte aus HeLa-Zellen in Suspension in großem Maßstab gezüchtet 1,8 und ein Verfahren für die kleine Herstellung von Extrakten 9 wurde hergestellt. Wir haben unsere Protokoll, weil die früheren kleinen Extrakte wurden nicht funktionsfähig für einige Assays, wie der gekoppelte Transkription / splicing Assay. Ein wichtiger Unterschied zwischen dem bisherigen kleinräumigen Protokoll 9 und unser ist, dass wir Bedingungen zur Lyse von Zellen mit Hilfe eines Mini-Dounce optimiert, während die vorherige Protokoll lysiert Zellen, indem sie durch eine kleine 9-Gauge-Nadel. Die Nadel-Lyse führt zu Blasen, die erklären, warum die Extrakte inaktiv waren und / oder schwierig, für einige Tests reproduzieren kann. Außerdem haben wir einen Schritt, um unsere Konzentration Protokoll. Dieser Schritt erhöht die Wirksamkeit der Extrakte, die extrem empfindlich auf Konzentration sind, und beschränkt auch die Variabilität zwischen den Extrakten, die naturgemäss zu kleinräumigen Vorbereitungen ist. Schließlich wird unsere Vorbereitung routinemäßig mit nur drei 150 mm Platten von Monolayer-Zellen durchgeführt, ohne nennenswerte Wirkung auf die Aktivität im Vergleich zum Bulk-Extrakten. Somit ist das Verfahren leicht zugänglich für kleinere Präparate, die teure Reagenzien oder begrenzte Zelle Verfügbarkeit erfordern. Zum Beispiel haben wir SMA hergestelltLL-Skala Auszüge aus RNAi-Knockdown-Zellen und von chronischer lymphatischer Leukämie (CLL) Patienten-Zellen, und verwendet diese Extrakte für die funktionale und / oder biochemischen Assays (EGF, JLH, TY und RR, unveröffentlicht). Wir haben festgestellt, dass die Extrakte sind wertvoll für RNAi gefolgt von spezifischen biochemischen Assays, wie immunopreciptations, Western, und Silberfärbung. Nach der Ermittlung der Wirksamkeit von Zuschlag für ein bestimmtes Protein, kann eine detailliertere Untersuchung durchgeführt, indem eine stabile Knockdown-Zellinie, die als zusätzliche Extrakte bei niedrigeren Kosten herzustellen werden kann durchgeführt werden. Massenspektrometrie von Proteinen, die in Immunpräzipitaten aus diesen Zelllinien erhalten Zuschlag stellt auch eine nützliche Anwendung des Verfahrens sein. Zusätzlich zu der gekoppelten Transkription / Spleißen Assay, dass wir als ein Beispiel für unsere Protokollbeschreibung hier verwendet wird, sollte die kleine Extrakte, die allgemein in zahlreichen funktionellen und biochemischen Assays, wie sie für die verschiedenen Runde verwendeteps in der Genexpression (zB Capping, Spleißen, Transkription, Polyadenylierung, microRNA Verarbeitung). Das Protokoll kann auch für Patienten Zelltypen, die entweder in Suspension erhalten werden können (wie die CLL-Zellen) oder in Kultur gezüchtet werden (z. B. Patienten Fibroblasten) angepasst werden. Schließlich sollte die cytoplasmatische Fraktion während des Verfahrens erhalten, die nützlich für sowohl funktionell als auch biochemische Assays, die in das Zytoplasma erfordern.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Vollständiger Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 4 - (2-Hydroxyethyl) piperazin-1-ethansulfonsäure </td><td> Sigma </td><td> H3375-500G </td></tr><tr><td> MgCl 2 · 6 H 2 O </td><td> Magnesiumchlorid Hexahydrat </td><td> Sigma </td><td> M2670-500G </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Kaliumchlorid </td><td> Fischer </td><td> P335-212 </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> Phenylmethansulfonylfluorid </td><td> Sigma </td><td> P7626-100G </td></tr><tr><td> DTT </td><td> Dithiothreitol </td><td> Amerikanischen Bioanalytische </td><td> AB00490-5G </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Ethylendiamintetraacetat, Dinatriumsalz, Dihydrat </td><td> Amerikanischen Bioanalytische </td><td> AB00500-01000 </td></tr><tr><td> Glycerin </td><td></td><td> MP Biomedicals </td><td> 800689 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Dulbecco Minimal Essential Medium </td><td> Invitrogen </td><td> 11995-073 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Fötalem Rinderserum </td><td> Gibco </td><td> 16140 </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td></td><td> Gibco </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Phosphate Buffered Saline </td><td> Cellgro </td><td> 21 bis 040-CV </td></tr><tr><td> Trypanblau Stain 0,4% </td><td></td><td> Gibco </td><td> 15250 </td></tr><tr><td> Zell-Lifter </td><td></td><td> Corning </td><td> 29442-200 </td></tr><tr><td> 150mm Plates </td><td></td><td> VWR </td><td> 353025 </td></tr><tr><td> Erweiterte Mikropipettenspitze </td><td></td><td> Denville </td><td> P1126 </td></tr><tr><td> Dounce Homogenisator, 1ml, mit engen Pistill </td><td></td><td> Wheaton </td><td> 357538 </td></tr><tr><td> Slidealyzers, MWCO 10 kDa </td><td></td><td> ThermoScientific </td><td> 69572 </td></tr><tr><td> Mini-Centricons, MWCO 3kDa </td><td></td><td> Millipore (Amicon) </td><td> UFC500396 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Spezifischen Reagenzien und Ausrüstung. <table border="1"><tbody><tr><td> Lösung </td><td> Finale </td><td> Lager </td><td> Dispense </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hypotone </td><td> 10 mM HEPES, pH 7,9 </td><td> 1M HEPES, pH 7,9 </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td></td> &lt;td&gt; 1,5 mM MgCl 2 </td><td> 1 M MgCl 2 </td><td> 750 ul </td></tr><tr><td></td><td> 10 mM KCl </td><td> 3M KCl </td><td> 1,67 ml </td></tr><tr><td></td><td> 0,2 mM PMSF </td><td> 200 mM PMSF </td><td> 500 ul </td></tr><tr><td></td><td> 0,5 mM DTT </td><td> 2M DTT </td><td> 125 ul </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Bringt bis zu 500 ml mit Wasser </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Wenig Salz </td><td> 20 mM HEPES, pH 7,9 </td><td> 1M HEPES, pH 7,9 </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td></td><td> 1,5 mM MgCl 2 </td><td> 1 M MgCl 2 </td><td> 150 ul </td></tr><tr><td></td><td> 20 mM KCl </td><td> 3M KCl </td><td> 667 ul </td></tr><tr><td> &amp; Nbsp; </td><td> 0,2 mM EDTA </td><td> 0,5 M EDTA </td><td> 40 ul </td></tr><tr><td></td><td> 25% Glycerin </td><td> Glycerin </td><td> 25 ml </td></tr><tr><td></td><td> 0,2 mM PMSF </td><td> 200 mM PMSF </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td></td><td> 0,5 mM DTT </td><td> 2M DTT </td><td> 25 ul </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Bringt bis zu 100 ml mit Wasser </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hohem Salzgehalt </td><td> 20 mM HEPES, pH 7,9 </td><td> 1M HEPES, pH 7,9 </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td></td><td> 1,5 mM MgCl 2 </td><td> 1 M MgCl 2 </td><td> 150 ul </td></tr><tr><td></td><td> 1,4 M KCl </td><td> 3M KCl </td><td> 48 ml </td></tr><tr><td></td><td> 0,2 mM EDTA </td><td> 0,5 M EDTA </td><td> 40 ul </td></tr><tr><td></td><td> 25% Glycerin </td><td> Glycerin </td><td> 25 ml </td></tr><tr><td></td><td> 0,2 mM PMSF </td><td> 200 mM PMSF </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td></td><td> 0,5 mM DTT </td><td> 2M DTT </td><td> 25 ul </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Bringt bis zu 100 ml mit Wasser </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dialyse </td><td> 20 mM HEPES, pH 7,9 </td><td> 1M HEPES, pH 7,9 </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td></td><td> 100 mM KCl </td><td> 3M KCl </td><td> 16,625 ml </td></tr><tr><td></td><td> 0,2 mM EDTA </td><td> 0,5 M EDTA </td><td> 200 pl </td></tr><tr><td></td><td> 20% Glycerin </td><td> Glycerin </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td></td><td> 0,2 mM PMSF </td><td> 200 mM PMSF </td><td> 500 ul </td></tr><tr><td></td><td> 0,5 mM DTT </td><td> 2M DTT </td><td> 125 ul </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Bringt bis zu 500 ml mit Wasser </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Lösungen für die Kern-Präparat.

small-scale nuclear extracts for functional assays of gene-expression machineries

Ein großer Teil der Fortschritte im Verständnis der Genexpression wurde unter Verwendung von in vitro Systemen. Für die meisten Studien werden funktionelle Assays unter Verwendung von Extrakten, die in loser Schüttung von 10 bis 50 oder mehr Liter Zellen in Suspension gewachsen sind bereit, durchgeführt. Jedoch sind diese in größerem Maßstab durchgeführt nicht zugänglich schnell Test in vitro Wirkungen, die aus einer Vielzahl von in vivo zellulären Behandlungen oder Bedingungen. Die Zeitschrift Video Artikel zeigt ein Verfahren zur Herstellung funktioneller kleinen nukleären Extrakten mit HeLa-Zellen als ein Beispiel. Dieses Verfahren wird unter Verwendung von nur drei 150 mm-Platten von Zellen als adhärente Monoschichten gewachsenen durchgeführt. Um die Effizienz der Klein-Extrakten zu veranschaulichen, zeigen wir, dass sie so aktiv wie lose gekoppelte Kernextrakten für RNA Polymerase II Transkription / Spleißen Reaktionen sind. Um das Dienstprogramm des Extraktes Protokoll zu demonstrieren, zeigen wir, dass Spleißen in Extrakten aus HeLa-Zelle vorbereitet wird abgeschaffts behandelt mit dem Spleißen Hemmer Medikament E7107. Die kleinräumige Protokoll sollte allgemein für jeden Prozess oder Zelltyp, der in vitro untersucht werden können, mit Zellextrakten. Dazu gehören Zellen des Patienten, die nur in begrenzten Mengen oder Zellen, die zahlreiche Mittel, wie Arzneimittel, DNA-schädigende Mittel, RNAi oder Transfektion, die die Verwendung von kleinen Zellpopulationen erfordern. Darüber hinaus sind kleine Mengen frisch gezüchtete Zellen bequem und / oder die für einige Anwendungen.

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Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

Ein Protokoll für die Vorbereitung der robuste, kleine HeLa Kernextrakten beschrieben wird. Dieses Protokoll ist wertvoll für Tests, die Verwendung von kleinen Populationen von Zellen, wie Zellen mit Medikamenten oder RNAi behandelt erfordern. Verfahren sollte für eine Vielzahl von Genexpressions und anderen Zelltypen, einschließlich Zellen des Patienten.

Small-scale Kernextrakten für funktionelle Assays von Gen-Expression Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

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Research

JoVE Journal

Biology

25.8K Aufrufe.  Harvard Medical School. Ein Protokoll für die Vorbereitung der robuste, kleine HeLa Kernextrakten beschrieben wird. Dieses Protokoll ist wertvoll für Tests, die Verwendung von kleinen Populationen von Zellen, wie Zellen mit Medikamenten oder RNAi behandelt erfordern. Verfahren sollte für eine Vielzahl von Genexpressions und anderen Zelltypen, einschließlich Zellen des Patienten.

Serie: Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Bakterielle Gene Expression Analysis Using Microarrays

Forschung

Biologie

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

In Vitro Nuclear Assembly mit Fraktionierte Xenopus Egg Auszüge

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells. Members of the orthopox genus include variola, the causative agent of human small pox, monkeypox, and vaccinia (VAC), the prototypic member of the virus family. Within the relatively large (~ 200 kb) vaccinia genome, three classes of genes are encoded: early, intermediate, and late. While all three classes are transcribed by virally-encoded RNA polymerases, each class serves a different function in the life cycle of the virus. Poxviruses utilize multiple strategies for modulation of the host cellular environment during infection. In order to understand regulation of both host and virus gene expression, we have utilized genome-wide approaches to analyze transcript abundance from both virus and host cells. Here, we demonstrate time course infections of HeLa cells with Vaccinia virus and sampling RNA at several time points post-infection. Both host and viral total RNA is isolated and amplified for hybridization to microarrays for analysis of gene expression.

Protocol for Vaccinia infection of HeLa cells and analysis of host and viral gene expression. Part 2 of 3.

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis des Virus Gene Expression: Teil 2

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

Spinal Cord Elektrophysiologie

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Mit dem Gene Pulser MXcell Elektroporation System zur Primary Cells mit hohem Wirkungsgrad zu transfizieren

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Verwendung eines automatisierten Cell Counter zu Genexpressionsstudien Simplify: siRNA Knockdown von IL-4 abhängige Genexpression in Namalwalzellen

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

Ein Allel-spezifische Gene Expression Assay zur Funktionsanalyse Grundlage genetischer Verbände testen

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Paraffin-Embedded-und Gefrierschnitte von Drosophila Adult Muskeln

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

In vitro Rekonstitution der Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...