Dissektion einzelner Skelettmuskelfasern für immunfluoreszierende und morphometrische Analysen von neuromuskulären Übergängen im ganzen Mount. Dieses Video zeigt ein Protokoll, um EDL- und Soleusmuskeln mit einem wiederholbaren Ansatz effektiv und sicher zu sezieren. In diesem Video wird auch gezeigt, wie man neuromuskuläre Übergänge mit ganzer Montierung erhält, mit dem Ziel, synaptische Komponenten mit 3D-Integrität zu erkennen, um eine genaue morphometrische Analyse zu ermöglichen.
Um die Muskeln zu sezieren, werden diese chirurgischen Instrumente benötigt. Um den Eingriff zu starten, legen Sie das Tier mit dem Bauch nach oben. Machen Sie einen ersten Schnitt mit einer chirurgischen Klinge zwischen den Zehen in Richtung der Hintergliedmaßen.
Ziehen Sie die Haut ab und ziehen Sie nach oben, bis das rechte Knie freigelegt ist. Um die EDL zu finden, folgen Sie den Fußsehnen bis zum Ringband. Dieses Band umkreist zwei Sehnen.
Schneiden Sie das Band mit der Uniband-Schere zwischen den beiden Sehnen ab. Identifizieren Sie die EDL-Sehne, indem Sie beide anheben und sehen, welche die Zehen nach oben bewegt. Schneiden Sie die Sehne mit einer Schere ab.
Während Sie die Sehne mit einer biologischen Pinzette halten, beginnen Sie, den EDL-Muskel langsam von den anderen Hintergliedmuskeln zu trennen. Die Trennung des Muskels, ohne Schaden zu verursachen, kann durch verschiedene Schnitte am Rest der seitlichen Muskeln erfolgen, um einen Weg zwischen ihnen zu öffnen, während der Muskel aus dem Spaltenabschnitt der EDL-Sehne gehalten und angehoben wird. Um den Muskel vollständig zu isolieren, schneiden Sie die Sehne, die am Rattenknie befestigt ist, mit einer Uniband-Schere ab.
Tauchen Sie den sezierten Muskel in die Fixierlösung und lassen Sie ihn 24 Stunden bei vier Grad Celsius ein. Im Allgemeinen ist es nützlich, einen länglichen Muskel zu haben. Verwenden Sie dazu Pappe und Klammern, um den Muskel zur Fixierung zu befestigen.
Um den Soleusmuskel zu isolieren, drehen Sie das Tier um. Schneiden Sie durch die Haut die Kalkanealsehne mit einer chirurgischen Klinge. Mit Hilfe der biologischen Pinzette und der Uniband-Schere trennen Sie den Musculus gastrocnemius von den Knochen und erzeugen einen muskulösen Deckel.
Der Soleus befindet sich auf der Innenseite des muskulösen Lids. Es kann identifiziert werden, weil es rot und flach ist. Mit einer biologischen Pinzette erreichen und heben Sie die Soleussehne an, die über dem Gastrocnemius liegt.
Schneiden Sie die Sehne mit einer Uniband-Schere ab. Heben Sie den gesamten Muskel an, während Sie einige der schwachen Befestigungspunkte schneiden. Um den Soleusmuskel vollständig zu befreien, schneiden Sie schließlich das Soleus-Vesikel ab, das die Kalkanealsehne bildet.
Wiederholen Sie den Fixierungsschritt wie mit dem EDL-Muskel. Um diese Methode zu verwenden, ist es wichtig, die Klammern an den Sehnen und nicht am Muskel zu befestige. Sobald die 24-Stunden-Fixierungszeit abgelaufen ist, spülen Sie die Muskeln in DPBS-Lösung, bevor Sie mit der Isolierung der Muskelfasern beginnen.
Um die Fasern zu isolieren, halten Sie vorsichtig eine der Sehnen mit einer biologischen Pinzette. Dann mit dem anderen Paar biologischer Pinzetten beginnen, die Sehne langsam zu kneifen, um die Muskelfasern zu trennen. Um die Fasern zu isolieren, ziehen Sie langsam nach oben in Richtung der gegenüberliegenden Muskelsehne.
Es ist notwendig, diese Aktion mehrmals zu wiederholen, bis mehrere, kleine, isolierte Bündel erhalten werden. Nach dem Trennen in kleine isolierte Bündel legen Sie sie vorsichtig in einen vorbehandelten silanisierten Objektträger. Es ist notwendig, alle Fasern geordnet zu halten, damit sie sich nicht überlappen.
An diesem Punkt können die Fasern 24 Stunden an der Luft getrocknet werden. Beginnen Sie nach 24 Stunden mit der Immunfärbung. Um eine wasserdichte Barriere zu schaffen, verwenden Sie einen PAP-Stift, um die isolierten Muskelfasern im vorbehandelten Objektträger einzukreisen.
Dies ist ein Beispiel für ein hochauflösendes konfokales Bild, das nach dem hier beschriebenen Protokoll erhalten werden kann. Oben links ist das postsynaptische Element und oben rechts das präsynaptische Element dargestellt, während die unteren Bilder die synaptischen Komponenten schematisiert zeigen, um die Parameter zu veranschaulichen, die für die morphometrische Analyse verwendet werden. Die zweite Folie zeigt die Verschmelzung der prä- und postsynaptischen Signale mit dem Kernfleck der API.
Unterschiede zwischen den neuromuskulären Verbindungen von transgenen Tieren und nicht-transgenen Tieren sind deutlich sichtbar. Die morphometrische Analyse neuromuskulärer Verbindungen zeigt Hinweise auf das postsynaptische Signal bei transgenen Tieren und scheint kompakter zu sein, hauptsächlich aufgrund der reduzierten neuromuskulären Verbindungsfläche. Wie hier gezeigt, ist der neuromuskuläre Verbindungs-präsynaptischen Bereich des transgenen Tieres reduziert.
Am kleinsten nachgewiesen wurde derjenige, der mit einem antiphosphorylierten Neurofilamentsignal gefunden wurde, wie zum Beispiel in Bild B gezeigt. Das letzte Bild zeigt die Ergebnisse in Bezug auf den Status von neuromuskulären Verbindungen im ganzen Mount. Anhand des Coverage-Index wurde festgestellt, dass die transgenen neuromuskulären Verbindungen teilweise denervated waren.
Es könnte auch festgestellt werden, dass die Abdeckung und der Nexus des phosphorylierten Neurofilaments niedriger ist als beim Nachweis eines nicht phosphorylierten Neurofilaments. Das vorgeschlagene Protokoll ermöglicht es, hochwertige neuromuskuläre Verbindungspräparate aus langsamen und schnellen Muskelfasern zu erhalten. Prä- und postsynaptische neuromuskuläre Verbindungskomponenten wurden durch spezifische Sonden oder Antikörper identifiziert und dann in konfokaler oder hochauflösender konfokaler Mikroskopie abgebildet, was eine morphometrische Analyse auf mikrometrischer Skala ermöglichte.
