Die Autoren danken Tracy Young-Pearse und Atsushi Kamiya für die Bereitstellung von Plasmiden. CK und (DE 792/2-4) an Masse; Diese Arbeit wurde von NEURON-ERANET entdecken OR und CK (BMBF 01EW1003), DFG (GRK1033 Ko 1679/3-1) gefördert

In Übereinstimmung mit nationalen und europäischen Gesetzgebung, Alle Tierversuche wurden von der zuständigen Landesministerium für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (87-51.05.2010.A301 LANUV NRW) zugelassen. 1. In utero Elektroporation Dieses Verfahren ist im Detail in JoVE für die Ratte durch Walantus et al. 3 sowie Rice et al. 4 beschrieben und wird hier nur kurz zusammengefaßt. Ein Wurfgröße von 6-8 Jungtieren ergibt ein gutes Ergebnis. Es sollte mindestens zwei nicht-Elektroporation Embryonen, um die Gesamtüberlebensrate zu erhöhen (siehe unten). <ol><li> Vorbereitung DNA-Gemisch, das 1,5 ug / ul enthält Target-Plasmid (shRNA: pENTR-U6, Invitrogen, Eugene, OR / DISC1 Expression: pCAX 21), 0,5 &amp;mgr; g / &amp;mgr; l Luciferase-Plasmid, enthaltend (pCAX), 0,5 ug / ul GFP das Plasmid (pCAGGS 22) in 1x PBS-Lösung gefärbt Licht blue mit Fast Green Dye. </li><li> Bereiten Injektionsnadeln aus Glas Kapillaren mit einem Nadel Pipette Puller. Und sterilisieren chirurgische Instrumente entweder durch Autoklavieren oder Inkubation mit einem alkoholhaltigen Desinfektionsmittel (Kodan Tinktur forte). </li><li> Verwalten einer präoperativen Dosis von Buprenorphin (0,05 mg / kg) 15 min vor der Operation, eine schwangere Ratte 16 Tage nach der Befruchtung (E16). Dann betäuben das Tier in einer Isofluran Kammer. <ol><li> Nach der Anästhesie, legen Sie die Ratte in Rückenlage auf einer 37 ° C-Betrieb erwärmt Tisch mit Atemmaske auf die Anästhesie-Gerät verbunden ist, unter Verwendung von Sauerstoff-Einstellung bei 0,4 L / min und Isofluran bei 1,8%. </li><li> Nach der Rasur der Bauch, desinfizieren die rasierte Fläche dreimal mit kodan Tinktur Forte (ein Alkohol-Desinfektionsmittel). </li><li> Decken Sie die Ratte mit sterilen Tüchern, Belichten nur das Operationsfeld rasiert. </li></ol></li><li> Führen Sie in utero Elektroporation. <ol><li> Schneiden Sie den Bauch mit einem scissor entlang der Linea alba (~ 2 cm). </li><li> Expose die Gebärmutterhörner sorgfältig mit einem Ring Pinzette. </li><li> Achten Sie auf die Gebärmutterwand nass mit sterilem PBS erwärmt während der ganzen Operation zu halten. </li><li> Inject DNA-Lösung mit einer dünnen Nadel in ein Glas des lateralen Ventrikel der Embryonen. </li><li> Legen Sie die 7 mm-Elektrode um den Kopf des Embryos. Um eine Zellpopulation der oberen kortikalen Schichten getroffen, führen Sie die IUE bei E16 23 und die Position der positiven Elektrode auf der Halbkugel über der Herzkammer injiziert mit einer leichten Rücken / Seitenneigung. Um gezielt Hippocampus Zellen ändern die positive Elektrodenplatzierung auf der gegenüberliegenden Seite, als der eingespritzten Ventrikel mit seitlichen etwas Rücken Richtung (Abbildung 1). </li><li> Führen Elektroporation von fünf 50 ms Pulse bei 55 V mit 950 msec Pausen mit einem Rechteckimpuls Elektroporator. </li><li> Ersatz die erste Embryo in der vaginalen Ende jedes Uterushorns zur Erhöhung ter Überlebenschancen aller Embryonen. </li><li> Setzen Sie die Hörner Gebärmutter wieder in die Mutter Ratte. </li><li> Stich in die Bauchwand mit einem resorbierbaren Vicryl chirurgisches Nahtmaterial. </li><li> Schließen Sie die Haut mit der Vicryl Nahtmaterial oder mit Wundklammern. </li><li> Legen Sie die Mutter Ratte zurück in den Käfig und warm halten für 2-3 Stunden. </li><li> Halten Sie die Ratten allein in ihrem Käfig in der Tierhaltung Raum und Futter ad libitum. Sie geben der Geburt zwischen E22-24. </li><li> Halten Sie die Rattenjungen mit ihrer Mutter für drei Wochen und trennen sie anschließend nach Geschlecht. </li></ol></li></ol> 2. Biolumineszenz Live-Imaging der enzymatischen Reaktion Luciferase Diese Methode wird verwendet, um die Position der in utero transfizierten Zellen zu analysieren. Co-Elektroporation Leuchtkäfer-Luciferase-cDNA wird in die aktive Luciferase, die auf die Metabolisierung D-Luciferin zu Oxyluciferin, ein Photon emittiert (Fig. 2 übersetzt </strong&gt;). Die resultierende Lumineszenz in den Gehirnen von positiven elektroporiert junge Ratten in einem IVIS Spectrum bis zum Alter von etwa 35 Tage postnatal (Fig. 4) erfaßt werden. In der vorliegenden Studie wurde die Luciferase-Assay und Biolumineszenz-Bildgebung durchgeführt, beginnend bei P7. Dieser Zeitpunkt wurde gewählt, damit Mutter und Welpen von Geburt an Stress zu erholen. Wenn Sie zu Beginn der Arbeit mit den Welpen bei P0, pup Überleben schwer betroffen wurde, dass die Jungtiere wurden tot aufgefunden oder von der Mutter gefressen. Zunächst werden Rattenjungen mit erfolgreichen Elektroporation von einem 2D-Bild Biolumineszenz mit einer Belichtungszeit von drei Minuten identifiziert. Anschließend werden positive Welpen für die Erstellung von 3D-Bildern, um die Lage der Elektroporation Bereich zu spezifizieren. <ol><li> Verdünnen D-Luciferin-Natriumsalz in PBS auf eine Konzentration von 15 mg / ml und sterilisiert durch Filtration durch eine sterile Spritzenfilter. </li><li> Wiegen Sie die Welpen. </li><li> Nehmen Sie den Welpen in einer Hand mit dem Bauch nach oben und strecken Sie den Bauch ein wenig. Spritzen Sie 10 ul / g Körpergewicht Luziferinlösung intraperitoneale. Für ältere und agiler diejenigen, vorge betäuben die Welpen mit Isofluran in der Induktionskammer vor der Injektion des Luciferin. </li><li> Schalten Sie die Isofluran Zustrom der XGI-8 Gas Anästhesie-System innerhalb des IVIS Spectrum mit 3% Isofluran. </li><li> Setzen Sie die Schnauze des Tieres in die Glas Nase Zapfen der Anästhesie-System. </li><li> Halten Sie das Tier in Bauchlage, bis er in tiefer Narkose (2-3 min). Dann reduzieren Sie die Isofluran-Zustrom auf 1,5%. </li><li> Wählen Sie ein 2D-Biolumineszenz-Messung, um positive Welpen aus der ganzen Wurf zu wählen. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen <img alt="Screen 1" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen1.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <ol><li> Legen Sie ein checkmark auf Medium Fotografie mit Binning und F / Stop bei 8, nimmt die Kamera ein Foto von oben nach Beginn der Messung. </li><li> Stellen Anregungsfilter: block. </li><li> Stellen Emissionsfilter: geöffnet. </li><li> Stellen Binning bis mittel. </li><li> Set F / Stop in 1. </li><li> Stellen Bühnenniveau A. </li><li> Stellen Lumineszenz Belichtungszeit auf 180 Sekunden. </li></ol></li><li> Zur Erstellung von 3D-Bildern, um besser zu quantifizieren, die Elektroporation von den positiven Bereich Welpen, verwenden Sie die folgenden Einstellungen für DLIT Firefly Luziferase. <img alt="Screen 3" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen3.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <ol><li> Setzen Sie ein Häkchen auf Foto, die Kamera nimmt ein Foto von oben nach Beginn der Messung. </li><li> Setzen Sie ein Häkchen auf Struktur, wird die Oberfläche des Tieres durch das IVIS vor der Biolumineszenz-Messung gescannt. </li><li> Use folgende Emissionsfilter und Belichtungszeiteinstellung bis zum Alter von zwei Wochen: Emissionsfilter 1: 590 nm, Belichtungszeit 300 Sekunden Emissionsfilter 2: 600 nm, Belichtungszeit 240 Sekunden Emissionsfilter 3: 620 nm, Belichtungszeit 180 Sekunden Emissionsfilter 4: 640 nm, Belichtungszeit 120 Sekunden Für Ratten älter als P20 Emissionsfilter 1: 600 nm, Belichtungszeit 300 Sekunden Emissionsfilter 2: 620 nm, Belichtungszeit 300 Sekunden Emissionsfilter 3: 640 nm, Belichtungszeit 300 Sekunden <img alt="Screen 3" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen3.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . Aufgrund der Abnahme in der Signalstärke bei älteren Tieren ist die Belichtungszeit für die drei besten Emissionsfilter ein. </li><li> Stellen Bühnenstufe B </li><li> Stellen Binning bis mittel. </li><li> Set F / Stop bei 1 </li></ol></li><li> Nach der Messung mar<html> k die Ratten durch eine Ohröffnung Code, um sie voneinander zu unterscheiden und sie zu den IVIS Live-Imaging Bilder entsprechen </li><li> Am Ende des Messverfahrens, schalten Sie Isofluran Zustrom und halten Sie die Ratte auf der erwärmten Platte für einige Minuten, bevor es wieder in seinen Käfig. </li></ol> 3. Analyse der Biolumineszenz Images Die Erzeugung von 3D-Bilder, 3D-Filme und die Quantifizierung des Volumens der Signalquelle wird von der Living-Image Software auf dem IVIS Spectrum vorinstalliert gemacht. <ol><li> Erzeugung von 3D-Bildern <ol><li> Zunächst rekonstruieren eine Oberflächentopographie, daher setzen Schwelle zwischen 20-30%. <img alt="Screen 4" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen4.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Bild 5" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen5.jpg" /> een 6 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50146/50146screen6.jpg &quot;/&gt; </li><li> Starten DLIT 3D-Rekonstruktion mit einem Bild Schwelle von 10% für jede Wellenlänge. <img alt="Screen 7" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen7.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen7large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Screen 8" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen8.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen8large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Screen 9" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen9.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen9large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . </li><li> 3D-Filme erstellen, indem Sie die Taste animieren in der 3D-Werkzeugleiste. </li><li> Wählen Sie verschiedene Ausrichtungen des 3D-Bildes sowie das Zoomen Ansichten als Schlüsselbilder und drücken Sie die &quot;Record &amp; #39, Taste, die Aufzeichnung der Wechsel von einer Position / Orientierung zum anderen. <img alt="Screen 10" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen10.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen10large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . </li></ol></li></ol> 4. Verhaltenstest Verhaltenstests wurden in, um festzustellen, ob IUE-vermittelte Gen-Manipulationen in der Ratte könnte langfristige Auswirkungen, die bis ins Erwachsenenalter fortbestehen zu initiieren durchgeführt. Im vorliegenden Fall wurde die Wirkung von transienten, einseitige voller Länge menschlichen DISC1 kortikalen Überexpression nach IUE wurde durch Testen Fortbewegung in einem offenen Feld (OF), mit und ohne einer niedrigen Dosis von Amphetamin, als eine spezifische Test für Dopamin-ähnliche sucht Verhalten 24. In einem ähnlichen Verfahren durchgeführt von Niwa et al. IUE in Mäusen unter Verwendung DISC1 Knockdown, IUE-Mäusen, nicht aber Kontrollen zeigten ÜberempfindlichkeitAmphetamin 18. Ratten, die in utero Elektroporation wurden mit einer Überexpression DISC1 Vektor wurden unter Laborbedingungen mit 12 Stunden Licht von 7.00 Uhr bis 7.00 Uhr statt und wurden ad libitum gefüttert. Bei 3 Monate alt, unterzog Ratten Verhaltenstests. Zur Quantifizierung der Fortbewegung als eine Auslese von Amphetamin-Effekte, ein Open-Feld einer Tru-Scan-System-Aktivität in einem schall-und licht isoliert Kammer befindet, verwendet. Dieses System misst die Zeitdauer und Entfernung der Tier bewegt, Zeit und Distanz in der Marge oder in der Mitte offenen Feld verbrachte, als auch das Erziehungsverhalten 25. <ol><li> Am ersten Tag, zu testen, nachdem Kochsalzinjektion <ol><li> Wiegen der Tiere. </li><li> Inject intraperitoneal 1 ul / g Körpergewicht von einer Kochsalzlösung (1x PBS). </li><li> Direkt nach der Injektion, legte das Tier in den offenen Bereich und starten Sie die Messung der TruScan-System. Rekord für 15 Minuten eind unterteilen Daten in 3 x 5 min Teile. </li><li> Setzen Sie das Tier wieder in seine Heimat Käfig. </li></ol></li><li> Zweiter Tag, Test auf Amphetamin-Injektion <ol><li> Wiegen der Tiere. </li><li> Inject intraperitoneal 1 ul / g Körpergewicht einer 0,5 mg / ml Lösung Amphetamin. </li><li> Direkt nach der Injektion setzen das Tier in den offenen Bereich und starten Sie die Messung der TruScan-System. Rekord für 15 Minuten zu unterteilen und Daten in 3 x 5 min Teile. </li><li> Bringen Sie das Tier in seinen Heimkäfig. </li></ol></li><li> Analysieren Sie die Fortbewegung und Aufzuchtverhalten durch spezifische Tru Scan-Software generiert. Erstellen von Diagrammen mit GraphPad (Prisma) und berechnen Statistiken, die von SPSS Statistics-Software. </li></ol>

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Die Autoren dieser Studie haben keine finanziellen Interessen an dieser Studie und wurden nicht von der Industrie für diese Studie gefördert. Offener Zugang Gebühren wurden von PerkinElmer Inc. post-Veröffentlichung beigetragen.

Unsere Untersuchung zeigt, dass IUE geeignet ist, erwachsenen Ratten mit Neuronen, die ein Transgen in einem selektiven Bereich des Gehirns, und dass als Ergebnis dieser Maßnahme, diese Tiere zeigen Verhaltensänderungen Funktionalität des geführt Manipulation anzeigt, zu erzeugen. In dieser Studie als ein Beispiel, Ratten überexprimieren DISC1 einseitig in einem kleinen Teil des präfrontalen Cortex zeigte Überempfindlichkeit gegen Amphetamin (Abbildung 9). Auswählen Ratten für die Elektroporation Erfolg durch in vivo Biolumineszenz-Bildgebung war wirksam bei der Kontrolle für die inhärente Variabilität der IUE Zelltransfektion und wurde angelegt, um Gruppen mit einer homogenen IUE Bereich der niedrigen interindividuelle Variabilität für spätere Untersuchungen zu generieren. In dieser Studie konnten wir elektroporiertem Welpen aus dem Wurf durch Nachweis der Co-Elektroporation GFP-induzierte Fluoreszenz bei Neugeborenen Tier auswählen, auch though zur gleichen Zeit und im gleichen Tier ein Biolumineszenz-Signal der ebenso Co-Elektroporation Luciferase-Luciferin konnte nach Injektion (Abbildung 6) festgestellt werden, und die GFP-exprimierenden Neuronen waren noch in einem Alter von sechs Monaten im Gehirn vorhanden. Wir schließen, dass, gut geeignet, um Tiere mit erfolgreichen Elektroporation Gehirn (Abbildung 3) zu differenzieren in der Ratte ist die Luciferase / Luciferin-Reaktion. Die quantitative Überwachung der IUE Erfolg betrifft die Stärke des Biolumineszenz-Signal, das durch die Grafen von Photonen innerhalb der gleichen Belichtungszeit (Fig. 3) gemessen wird, und entspricht der enzymatischen Aktivität des co-exprimierten Luciferase. Kleine Biolumineszenz-Signale von 100-200 Grafen von Photonen nachweisbar, und bei einer Ausstrahlung von ~ 1x10 4 Photonen / sec / cm 2 / Steradian Show 1000-2000 GFP-gefärbten Zellen in der Histologie in der 6 Monate alte Rattenhirn. Die höchste Signal dispverlegt eine Ausstrahlung von bis zu ~ 5x10 6 Photonen / sec / cm 2 / Steradian und ~ 64.000 zählt. In der Sprague Dawley-Rattenstamm verwendet, beobachteten wir eine Schwächung des Biolumineszenz-Signal in Längsrichtung mit zunehmendem Alter und das Signal über das Alter von P35 (Abbildung 4) verschwunden. Zu diesem Zeitpunkt wissen wir nicht, ob entweder die transiente Plasmid-Vektor-basierte Expression von Luciferase abnimmt, oder wenn der Biolumineszenz-Signal aufgrund der zunehmenden Hirnmasse oder beides sind die Ursachen für das Verschwinden Signal schwächt. Für die vorliegende funktionelle Assays in erwachsenen Ratten wurde die Selektion für Verhaltensstudien lediglich auf den Standort des Signals, aber nicht durch Biolumineszenz Signalstärke. Auch wenn 3D quantitative Biolumineszenz-Überwachung erlaubt die Differenzierung zwischen verschiedenen Bereichen Elektroporation (Abbildung 5), wurde deren Richtigkeit für Zellen in der Tiefe befindet Cent begrenztnsion des Gehirns. Fig. 6 zeigt ein Beispiel eines hippocampalen Elektroporation, wo die Messung der Biolumineszenz in der 2D-und dem 3D-Bild zeigte eine gute Positionierung der Elektroporation. In der post mortem Gehirn seziert wurde ein GFP-Fluoreszenzsignal bei etwa der gleichen Position wie der Biolumineszenz-Signal detektiert, was anzeigt, korrekte Ausrichtung des Hippocampus. Histologie zeigt, dass aber auch Zellen in der Rinde des dorsalen Hippocampus gezielt worden war (Fig. 7). Dies zeigt, dass die Biolumineszenz-Assay ist ein nützliches Werkzeug, um positive, IUE Welpen erkennen und auch eine Vorstellung von der Elektroporation Bereich haben, aber letztlich Bildgebung kann nicht post mortem Histologie positiv Zielzellen genau lokalisieren zu ersetzen. Unsere Demonstration zeigt Versprechen für die Anwendung der IUE-Technologie, um subtile gezielte Manipulationen der kortikalen Gehirnregionen Hippocampus oder zu aberrances in C simulieren erzeugenortical Migration oder anderen Mängeln, die die Entwicklung des Nerven erwachsenen Tier beeinflussen können. Während bilaterale Elektroporation 26 hat den Vorteil einer größeren Wahrscheinlichkeit Wirkung auf das Verhalten gibt es auch mehr Sterblichkeit der Embryos. Einseitige Elektroporation wurde, um die beiden Halbkugeln mit einem als interne Kontrolle sowie für die Ansicht, dass auch IUE Manipulation in einem einseitigen, kleinen Region ist ausreichend, um Verhalten zu ändern vergleichen gewählt. IUE-induzierte Veränderungen der Konnektivität oder Architektur zwischen Neuronen können somit ohne eine Läsion hervorzurufen und die erforderliche Übereinstimmung der zu-sein-IUE-manipuliert Region mit den entsprechenden Verhaltenstest induziert wird, hängt von der wissenschaftlichen Frage. Fehlersuche Reduzierte Wurfgröße Es gibt mehrere Vorschläge zur Erhöhung der Überlebensrate der Jungtiere IUE. Erstens, die Verwendung von sehr dünnen Glas-Kapillaren bei der Elektroporation, um Gewebe zu minimieren Lesion empfohlen. Zweitens, nicht die erste Embryo elektroporieren am Scheiden Ende jeder Uterus Horn: Tod des Erstgeborenen Embryo erhöht die Chancen auf einen Abbruch aller anderen Embryonen. Drittens, nach der Geburt, die Mutter zu töten Ratten oft Teil ihrer Nachkommen durch perinatalen Stress. Um zusätzlichen Stress zu reduzieren, nicht mit dem Live-Bild direkt nach der Geburt beginnen, sondern warten für sieben Tage. GFP-Fluoreszenz-Detektion der Welpen Nach einer Woche nach der Geburt, kein Signal der Fluoreszenz entweder mit Live-Fernglas fluoreszenzmikroskopische Abbildung oder Fluoreszenz-Imaging mit der IVIS Spectrum (Epi-Fluoreszenz und transfluorescence Modi, für GFP Anregung / Emission: 465/520 nm und 500/540 nm). Es ist möglich, dass sowohl die begrenzte Übertragung von kurzen Wellenlänge Anregungs-und Emissionslicht durch Gewebe wie der Schädel und der hohen Autofluoreszenz Hintergrund der Haut mit Fluoreszenz unter dem desc verhindernribed Bedingungen bei der Ratte. Wie in Fig. 6 gezeigt, kann die Luciferase-Signal im lebenden Tier auch im Gehirn seziert (ohne Schädel) nachgewiesen werden, und es gibt auch ein Fluoreszenzsignal detektierbar (Fig. 6D) ist. Differenzierung der Biolumineszenz in eng benachbarten Hirnregionen Auch in der 3D-Darstellung die Lage der Biolumineszenz-Bereich kann nicht zu 100% vorhergesagt werden. Insbesondere Zellen auf oder unterhalb der vorhergesagten Bereich kann auch zufällig gezielt und transfiziert werden. Die genaue Position ist durch post mortem (Fluoreszenz) Histologie gesteuert werden (siehe Abbildung 7).

Die Entwicklung der in utero Elektroporation (IUE)-Methode, die eine Modulation der Genexpression im sich entwickelnden Gehirn ermöglicht, hat einen Durchbruch, da es aktiviert Studium der Entwicklung des Nerven relativ einfach gewesen. 1-7 Änderungen im Expressionsspiegel eines Zielgens in eine bestimmte Hirnregion während der embryonalen und / oder perinatale Entwicklung bei Nagern wurden nachweislich Einfluss der neuronalen Proliferation, Migration, Verzweigung und Konnektivität kritisch. 8-10 Schizophrenie ist eine Geisteskrankheit Komplex mit akuten und chronischen Symptomen, die Neuroentwicklungsanomalien 11, 12 und daher viele der identifizierten Kandidatengene für Schizophrenie sind für mögliche modulierende Wirkungen auf die Entwicklung des Nervensystems wie zum Beispiel untersucht, bezogen wurde die aufgeschlossene-in-Schizophrenie -1 (DISC1)-Gen 13-15. Die Entwicklung des Gehirns ist Regulatdurch genetische Faktoren und deren Wechselwirkungen mit der Umwelt, die Rollen in der prä-, peri-und postnatalen Entwicklungszeiten spielen ed. Ein Haupt genetische Risikofaktor für verschiedene Verhaltensstörungen ist die DISC1 16 Gen. DISC1 Knockdown führt zur Migration Defekte bei Mäusen 13, 17, und Manipulation von DISC1 Expression in der Entwicklung von IUE Kortex wurde gezeigt, dass das Verhalten der erwachsenen Mäuse 18 auswirken. Manipulieren Gehirn Genexpression durch IUE 19 hat mehrere Vorteile gegenüber der Erzeugung von transgenen Tierlinien. Zunächst wird die Genexpression in Bereichen von Interesse innerhalb von Wochen bis Monaten, anstatt mehrere Generationen der Zucht transgener Nager Linien erreicht. Zweitens werden die Kompensationsmechanismen während der frühen Entwicklung, die Phänotypen in Keimbahn-engineered 20 Tiere schützen kann vermieden. Dritte, durch Targeting nur eine bestimmte Zellpopulation oder bestimmten Bereich des Gehirns, migratioder Proliferation Unterschiede können direkt mit dem nicht-mutierten Kontrolle verglichen werden oder kontralateralen Seite, wenn einseitige electroporations gewählt werden. Andererseits bedeutet IUE nicht die Genauigkeit der Promotor getriebene cre / lox-induzierte Zeitpunkt der Expression und nur eine Subpopulation von Zellen in einem bestimmten Bereich ausgerichtet ist, die zu einem Mosaik Art von Genexpressionsmustern. Für viele Anwendungen in der experimentellen erwachsenen Nagetieren, kann eine vorübergehende Transfektion einer begrenzten Anzahl von Zellen in einer Gehirnregion ausreichend oder sogar erwünscht sein, so dass der Hauptvorteil der stabilen Keimbahn-transgene Nager ist vernachlässigbar. In der Tat ist IUE nützlich, zu untersuchen, ob einige abnormal entwickelt Zellen können ein ganzes Netzwerk von Zellen oder Schaltungen beeinflussen. Ein weiterer Vorteil kann die Fähigkeit, nicht zellautonome Wirkung eines Gens durch die Mosaik Natur der Hit zu demonstrieren. Darüber hinaus ist die Herstellung von transgenen und Knockout-Ratten noch in den Kinderschuhen und die Verwendungvon IUE in dieser Art für das Studium abweichende Gehirnentwicklung Folgen ist von hohem Interesse. Bisher ein wesentliches Hindernis der Verwendung von IUE zur Untersuchung der Folgen Interventions in dieser Tiere Erwachsene ist die mangelnde Kontrolle Elektroporation Erfolg. So weit, GFP-co-transfiziert fluoreszierende Nervenzellen in der Live neugeborenen Rattenjungen konnte nicht unter einer geeigneten Fernglas Fluoreszenz-Mikroskop oder mit der Fluoreszenz-Bildgebung des IVIS Spectrum nachgewiesen werden. Um dieses Hindernis zu überwinden, wir co-transfiziert ein Luciferase-Reportergens durchgeführt und Biolumineszenz-Live-Bildgebung von Jungtieren durch 3-dimensionale (3D) Quantifizierung der IUE Gehirnbereich. Als ein Beispiel zur Demonstration der Anwendbarkeit dieses Verfahrens in einem späteren funktionellen Assay testet die Neuroentwicklungs genetische Manipulation, eine Co-Injektion von Plasmiden, die menschliche DISC1, Luciferase und GFP in den lateralen Ventrikel des Rattenembryonen <sup&gt; 3 gefolgt durch Elektroporation mit einer Pinzette Elektrode durchgeführt wurde. Während die Fluoreszenzsignale nicht in postnatalen Stadien in vivo nachgewiesen werden, wurde eine feste Biolumineszenz-Signal von Luciferin Stoffwechsel von co-transfizierten Luciferase-Gen abgeleitet bis zu fünf Wochen nach der Geburt festgestellt. 3D-Messungen der Elektroporation Gehirnbereich erlaubt die Quantifizierung wobei Welpen mit zu wenig oder falsch Elektroporation waren von Anfang an erkannt, so, so dass die Zuordnung der IUE Tiere (Gen von Interesse und Rührei Steuerung) zu Versuchsgruppen mit pass Elektroporation Gehirn Bereichen geringer Variabilität . Die Verwendung von adulten Ratten IUE in Verhaltensexperimenten wurde als ein Beispiel für die Nützlichkeit dieses Protokolls gezeigt.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent name</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-250</td>
			<td>without calcium, without magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin, sodium salt</td>
			<td>SynChem OHG, Germany</td>
			<td>BC218</td>
			<td>CAS number: 103404-75-7 substrate for firefly-luciferase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>CAS: 2353-45-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Amphetamine</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>A 5880</td>
			<td>CAS: 51-63-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kodan Tinktur forte</td>
			<td>Sch&#252;lke &#38; Mayr GmbH, Germany</td>
			<td>104 005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Material / product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>Novato, California, USA</td>
			<td>borosilicate glass O.D.:1 mm, I.D.: 0.78 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Pipette Puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Tujunga, California, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer electrode</td>
			<td>Nepa Gene CO., LTD.</td>
			<td>Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan</td>
			<td>7 mm in diameter platinum disc electrodes (<a href="http://www.sonidel.com/product_info.php?products_id=129" target="_blank">CUY650P7</a>)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Heidelberg, Germany</td>
			<td>Straight, 12 cm (14002-12)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Heidelberg, Germany</td>
			<td>2.2 mm ID, 3 mm OD (11021-12)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square wave pulse electroporator (CUY21SC)</td>
			<td>Nepa Gene CO., LTD.</td>
			<td>Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan</td>
			<td>(CUY21SC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl surgical suture material</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Norderstedt, Germany</td>
			<td>3-0; 2 Ph. Eur;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound Clip Applicator</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Heidelberg, Germany</td>
			<td>Reflex 9 mm (12032-09)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Darmstadt, Germany</td>
			<td>0.45 &#956;m cellulose acetate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum</td>
			<td>Caliper Life Science / PerkinElmer</td>
			<td>Waltham, MassachusettsUSA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XGI-8 Gas Anesthesia System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Waltham, Massachuset tsUSA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open-field</td>
			<td>Coulbourn Instruments</td>
			<td>Allentown, USA</td>
			<td>(40 x 40 x 39 cm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tru Scan activity system</td>
			<td>Coulbourn Instruments</td>
			<td>Allentown, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<table border="1">
				<tbody>
					<tr>
						<td colspan="4">Table of recipes</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Number</td>
						<td>Buffer name</td>
						<td>Content</td>
						<td>Comments </td>
					</tr>
					<tr>
						<td>1</td>
						<td>DNA-Mixture for DISC-1 overexpressing</td>
						<td>1.5 &#956;g/&#956;l pCAX humanDISC-1, 
						0.5 &#956;g/&#956;l pCAX-luciferase, 
						10x PBS (10%) Fast Green Dye (0.5%) add H2O</td>
						<td>100 &#956;l of the mixture are enough for ~5 IUE</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>2</td>
						<td>DNA-Mixure for control</td>
						<td>0,75 &#956;g/&#956;l control shRNA1, 0,75 &#956;g/&#956;l control shRNA2, 0.5 &#956;g/&#956;l pCAX-luciferase, 0.5 &#956;g/&#956;l pCAGGS-GFP 10x PBS (10%) Fast Green Dye (0.5%) add H2O</td>
						<td>100 &#956;l of the mixure are enough for ~5 IUE</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>3</td>
						<td>Fast green Dye</td>
						<td>10 mg/ml Fast Green FCF in ddH2O</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>4</td>
						<td>D-luciferin solution</td>
						<td>15 mg/ml D-luciferin, sodium salt in PBS</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>5</td>
						<td>Amphetamine solution</td>
						<td>0.5 mg/ml D-Amphetamine in PBS</td>
						<td></td>
					</tr>
				</tbody>
			</table>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of topically transgenic rats by in utero electroporation and in vivo bioluminescence screening

In utero Elektroporation (IUE) ist eine Technik, die genetische Veränderung von Zellen zur Untersuchung der neuronalen Entwicklung ermöglicht im Gehirn. Bisher wurde die Verwendung von IUE zur Untersuchung Verhalten oder Neuropathologie im erwachsenen Gehirn durch unzureichende Methoden zur Überwachung des Erfolgs IUE Transfektion von nicht-invasiven Techniken in postnatale Tiere beschränkt. Für die vorliegende Studie wurden Ratten E16 für IUE verwendet. Nach intraventrikuläre Injektion von Nukleinsäuren in die Embryonen, die Positionierung der Pinzetten Elektroden war kritisch für die Ausrichtung entweder der Entwicklungs Kortex oder des Hippokampus. Ventrikulären Co-Injektion und Elektroporation von einem Luciferase-Gen erlaubt die Überwachung der transfizierten Zellen postnatal nach intraperitonealer Injektion von Luciferin in der narkotisierten Live P7 Welpen durch in vivo-Biolumineszenz unter Verwendung eines IVIS Spectrum Vorrichtung mit 3D Quantifizierungssoftware. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Bereichsdefinition durch Biolumineszenz konnte klar zwischen kortikalen und hippocampalen Elektroporationen differenzieren und zu erkennen, ein Signal in Längsrichtung über Zeit bis zu 5 Wochen nach der Geburt. Diese Bildgebungstechnik erlaubt es uns, Welpen mit einer ausreichenden Anzahl von transfizierten Zellen zur Auslösung biologischer Wirkungen und anschließend zu Verhaltensuntersuchungen bei 3 Lebensmonat durch angenommen erforderlich auszuwählen. Als ein Beispiel zeigt diese Studie, dass IUE mit dem menschlichen Volllängen DISC1 Gens in das Rattencortex führte zu Amphetamin Empfindlichkeit. Co-transfizierten GFP konnte in Neuronen von Post-mortem-Fluoreszenzmikroskopie in Gefrierschnitten angibt, bei ≥ 6 Monate nach der Geburt vorhanden Genexpression festgestellt werden. Wir schließen, dass postnatale Biolumineszenz-Bildgebung ermöglicht die Bewertung des Erfolgs von transienten Transfektionen mit IUE bei Ratten. Untersuchungen über den Einfluss der aktuellen Gen-Manipulationen während neurodevelopment auf den Erwachsenen-Gehirn und seine Konnektivität sind sehr erleichtert. Für viele wissenschaftliche Fragen, kann diese Technik zu ergänzen oder sogar ersetzen die Verwendung von transgenen Ratten und eine neuartige Technologie für die Verhaltensneurowissenschaften.

<html> Abbildung 3 zeigt die Live-Imaging-Messungen von drei Rattenjungen bei P7 nach der Injektion von 150 mg Luciferin / kg Körpergewicht. Unterschiede der Signalstärke, welche die Variabilität in der Effizienz der IUE sichtbar. Starke Signale wurden Biolumineszenz bis P36 (Figur 4) gespeichert. In Fig. 5 ist die Fähigkeit, kortikale (5A und 5C) und Hippocampus-(5B und 5D) Elektroporation durch Biolumineszenz-Bildgebung definieren dargestellt. Korrelation des Biolumineszenz-Signal (Fig. 7A) mit dem Fluoreszenzsignal nach Schädel Entfernung (7B) und der entsprechenden GFP-elektroporierten Zellen in kryogeschnitten Gehirn (Fig. 8) auf P14 sind in den Fig. 6-8 dargestellt. Zu beachten ist, gab es keinen Nachweis eines Fluoreszenzsignals in lebenden Ratten zu jedem Zeitpunkt. Zelt &quot;&gt; In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung ermöglicht ungefähre Diskriminierung verschiedener elektroporiert Gehirnbereichen von 2D (Fig. 5A und 5B), die stark mit der DLIT Programm der Software IVIS Spectrum Erzeugung von 3D-Bildern (Figuren 5C und 5D) verbessert wird. In den gezeigten Beispielen Elektroporation des präfrontalen Cortex und Hippocampus-Zeit bestimmt werden. Es sei darauf hingewiesen, dass zwar mit dem Ziel, den Hippocampus Elektroporation einige Vorläuferzellen der Hirnrinde liegen dorsal des Hippocampus kann auch getroffen werden (Fig. 7) werden. Ratten einseitig in utero mit pCAX Vektor in die Rinde elektroporiert und anschließend Überexpression in voller Länge menschlichen DISC1 wurden sowohl für spontane und Amphetamin-induzierten Hyperaktivität als Erwachsene untersucht. Ratten, die mit pCAX-DISC1 elektroporiert waren überempfindlich auf einer niedrigen Dosis von Amphetamin. Diese Ratten signifikant bewegt moRe nach Amphetamin-Behandlung als nach den Kochsalzinjektion, während Kontrolltiere nicht (Abbildung 10). <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. Schema der Elektrodenposition für A) Kortex Elektroporation und B) Hippocampus Elektroporation, grün = injizierte DNA-Mix in der Herzkammer. <img alt="Figur 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig2.jpg" /> 2. Die Luciferase-Reaktion. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig3.jpg" /> 3. Lumineszenzmessung von P7 Ratten nach Injektion von 150 mg / kg Körpergewicht Luciferin; Belichtungszeit 180 sec; A) Ratten ohne Lumineszenzsignal, B) Ratten<html> mit einem schwachen Signal Biolumineszenz, C) Ratte mit einem starken Lumineszenz-Signal. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig4.jpg" /> 4. Zeitlinie aufeinanderfolgender Biolumineszenz-Messungen derselben Ratten nach Injektion von 150 mg / kg Luciferin zeigt eine große Zeitfenster, in dem IUE Erfolg nachgewiesen werden können. <img alt="Figur 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig5.jpg" /> . Abbildung 5 Abbildung der Unterschiede zwischen kortikalen und hippocampalen Elektroporation bei P7 A) und B) 2D-Bildern;. C) und D) 3D-Bilder, A) und C) aus Rinde, B) und D) von Hippocampus.files/ftp_upload/50146/50146fig5highres.jpg &quot;&gt; Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen. <img alt="Fig. 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig6.jpg" /> 6. Illustration von E16 Hippocampus einer Ratte Elektroporation Welpen bei P14 A) 2D-Bild der Biolumineszenz B) 3D-Darstellung des Biolumineszenz-Signal C) seziert Gehirn mit Biolumineszenz-Signal D) Gehirn mit GFP-Auflicht-Fluoreszenz-Signal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146fig6large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Fig. 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig7.jpg" /> Abbildung 7. Detail eines Fluoreszenz-Bild aus einer 20 um Kryo Schnitt des gleichen P14 Rattenhirn mit GFP enthaltende Plasmid elektroporiert und LuciferaseVektor, Kerne mit DAPI-Färbung; CA1-3 = 1-3 Ammonshorn, DG = Gyrus dentatus, FC = Fasciolarum cinereum. Video 1. 3D-Animation eines Hippocampus Elektroporation Ratte auf P14. <img alt="Fig. 8" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig8.jpg" /> Abbildung 8. Benzedrintest Schema: am ersten Tag Kochsalzinjektion vor dem Versuch 15 min, 24 Stunden später Amphetamin-Injektion vor der Prüfung in der offenen Feldkammer. <img alt="Fig. 9" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig9.jpg" /> Abbildung 9. Amphetamin-Test. Bar Graph, bewegten Abstand (in cm) des Tieres durch eine Truescan-System über 15 min Weiße Balken = Kontrollgruppe aufgenommen;. Graue Balken = DISC1 Überexpression Gruppe; Kontrollgruppe n = 10; DISC1 Überexpression Gruppe n = 11; ANOVA: geno * p = 0,043 Behandlung, T-Test für Gesamtzeit Kochsalzlösung vs Amphetamin ns = nicht signifikant pcontrol = 0,172, pDISC1 = 0,001.

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Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Gene bei der Entwicklung des Kortex oder des Hippokampus von Ratten über in utero Elektroporation (IUE) an E16 manipuliert werden, um eine schnelle und gezielte Modifikationen der neuronalen Verbindungen für spätere Untersuchungen des Verhaltens oder der Neuropathologie in erwachsenen Tieren ermöglichen. Postnatale in-vivo-Bildgebung für die Kontrolle der IUE Erfolg durch Biolumineszenz der Aktivierung co-transfizierten Luciferase durchgeführt.

Erzeugung von Aktuell transgenen Ratten durch<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporation und<em&gt; In-vivo-</em&gt; Biolumineszenz Screening

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

generation-topically-transgenic-rats-utero-electroporation-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

13.4K Aufrufe.  Medical School Düsseldorf.  Gene bei der Entwicklung des Kortex oder des Hippokampus von Ratten über in utero Elektroporation (IUE) an E16 manipuliert werden, um eine schnelle und gezielte Modifikationen der neuronalen Verbindungen für spätere Untersuchungen des Verhaltens oder der Neuropathologie in erwachsenen Tieren ermöglichen. Postnatale in-vivo-Bildgebung für die Kontrolle der IUE Erfolg durch Biolumineszenz der Aktivierung co-transfizierten Luciferase durchgeführt. 

Serie: Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

In utero Elektroporation gefolgt von primären neuronalen Kultur für ein Studium Gene Function in Subset von kortikalen Neuronen

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Forschung

Neurowissenschaften

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Die Transfektion von Maus retinalen Ganglienzellen durch In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

Effiziente Gene Lieferung in mehrere ZNS Territories mit In Utero Elektroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Maus in Utero Elektroporation: Kontrollierte Spatiotemporal Gene Transefection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

Erweiterung der embryonalen und adulten neuralen Stammzellen<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation oder Viral stereotaktische Injektion

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualisierung und genetische Manipulation von Dendriten und Dornen in der Maus Hirnrinde und im Hippocampus mit<em&gt; In utero</em&gt; Die Elektroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

Genetische Manipulation der Maus entwickeln Hypothalamus durch<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporation

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Gleichzeitig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funktionsprüfung von zwei Netzhäute von<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogramm-System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

In vivo - Gentransfer auf Schwann - Zellen in der Nagerischiasnerv durch Elektroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein prionoids, which cause neuropathology within the central nervous system (CNS). Here we describe that intraglossal or intraperitoneal injection of alpha-synuclein fibrils into bigenic Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice, which overexpress human alpha-synuclein with the A53T mutation from the prion protein promoter and firefly luciferase from the promoter for glial fibrillary acidic protein (Gfap), is sufficient to induce neuropathologic disease. In comparison to homozygous Tg(M83+/+) mice that develop severe neurologic symptoms beginning at an age of 8 months, heterozygous Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) animals remain free of spontaneous disease until they reach an age of 22 months. Interestingly, injection of alpha-synuclein fibrils via the intraperitoneal route induced neurologic disease with paralysis in four of five Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice with a median incubation time of 229 &#177;17 days. Diseased animals showed severe deposits of phosphorylated alpha-synuclein in their brains and spinal cords. Accumulations of alpha-synuclein were sarkosyl-insoluble and colocalized with ubiquitin and p62, and were accompanied by an inflammatory response resulting in astrocytic gliosis and microgliosis. Surprisingly, inoculation of alpha-synuclein fibrils into the tongue was less effective in causing disease with only one of five injected animals showing alpha-synuclein pathology after 285 days. Our findings show that inoculation via the intraglossal route and more so via the intraperitoneal route is suitable to induce neurologic illness with relevant hallmarks of synucleinopathies in Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice. This provides a new model for studying prion-like pathogenesis induced by alpha-synuclein prionoids in greater detail.

Peripheral injection of alpha-synuclein fibrils into the peritoneum or tongue of Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice, which express human alpha-synuclein with the familial A53T mutation and firefly luciferase, can induce neuropathology, including neuroinflammation, in their central nervous system.