Wir danken Fumi Kubo, Tod Thiele und HerwigBaier (UCSF / Max-Planck-Institut) zur Beratung über das Verhalten Experimente und DPSS-Laser eingerichtet; Heesoo Kim und Chiara Cerri aus der MBL Neurobiologie Kurs für die Unterstützung in der Chef-tdTomato Experimente; PetronellaKettunen (University of Gothenburg ) für die erste Zusammenarbeit auf optogenetische Experimente; BaljitKhakh, Eric Hudson, Mike Baca und John Milligan (UCLA) für technische Beratung und Roger Tsien (UCSD) für den Chef-tdTomato konstruieren. AS: Diese Arbeit wurde durch ein NRSA (5F31NS064817) Auszeichnung AMSP und einem Zuschuss von der NSF (0.819.010 RIG) unterstützt.

Bereiten Sie die folgenden vor der Zeit. Ein. Bereiten Sie Optic Cable <ol><li> Erstellen einer Speichereinheit für die Lichtwellenleiter durch Schmelzen des verjüngten Hals einer Pasteurpipette aus Glas über einem Bunsenbrenner ein ~ 150 °-Winkel zu erzeugen. </li><li> Mit einem Seitenschneider oder einer Rasierklinge schneiden Sie vorsichtig die Glasfaserkabel in zwei Stücke. Jedes Stück sollte einen Ende mit einem FC / PC-Adapter und ein freiliegendes Ende aufweisen. Bewahren Sie ein Stück als Reserve-Kabel. </li><li> Streifen der Lichtwellenleiter auf der Verkleidung durch Entfernen der Fasermantel und Verstärkung Fasern (1A) von 5,0 cm von geschnittenen Ende des Kabels. </li><li> Legen Glasfaserkabel in die vorbereitete Pasteurpipette. Achten Sie darauf, Kabel können leicht bewegen und aus der Pipettenspitze. </li><li> Mit LWL vorstehende von der Spitze des Pasteur Pipette vorsichtig schneiden und entfernen Fasermantel aus der ganzen Glasfaser, ~ 2 mm vom abgeschnittenen Ende. </li><li> Mit einem Diamant-pen / Glasschneider, die Glasfaser nick und brechen off das Ende um einen sauberen Schnitt / Fläche am Ende der Faser (1B) zu schaffen. </li><li> Einfahren Glasfaserkabel in Pasteurpipette für die Lagerung. Wiederholen Sie Schritt (1,6), wenn Spitze des LWL wird gesäumt oder Brüche ungleichmäßig. </li><li> Position Glasfaserkabel in Pasteurpipette mit einem Mikromanipulator (1C). </li></ol> Verfahren 2-8 beschreiben ein Verfahren zum Einspritzen von Transgenen in Embryonen die allgemein in vielen Experimenten Zebrafisch. Variationen dieses Verfahrens, wie sie in anderen JoVE Videos 6, 7, 8, 9, 22 sind gleich wirksam. 2. Ziehen Sie Injektionsnadeln <ol><li> Mit einer Nadel Abzieher, ziehen Borosilicatglasröhren in zwei Injektionsnadeln mit einer allmählich sich verjüngende Spitze. Puller Einstellungen variieren. (Auf einem Sutter Instruments Nadel Abzieher verwenden wir Einstellungen: P = 500, Heat = 720, Pull = 50, Velocity = 70 und Time = 150). Jede Nadel Abzieher ist anders, so zu optimieren, Abzieher-Einstellungen emrisch. Für weitere konischen Nadeln, erhöhen die Wärme-und / oder Pull. Für weniger konischen Nadeln, erhöhen Zeit und / oder Abnahme Pull. </li><li> Laden Nadeln in einer sicheren Containers (dh eine Petrischale mit gewalzten Band, Klebeseite out). </li></ol> 3. Gießen Spritzgussformen <ol><li> Melt 0,5 g Agarose in 30 ml Embryo / blauen Wasser, bis Agarose vollständig gelöst hat. </li><li> Gießen Sie in der unteren Hälfte einer Petrischale. </li><li> Zeigen rechteckige Form mit Montage-Bohrungen (Abbildung 2) in Agarose, wobei darauf zu Blasenbildung um den Brunnen zu begrenzen. </li><li> Lassen Agarose zu verfestigen. </li><li> Entfernen Schimmel und füllen Petrischale mit blau / Embryo Wasser. </li><li> Aufrecht lagern, gefüllt mit klarem Wasser, bei Raumtemperatur für den selben Tag Nutzung oder bei 4 ° C für die zukünftige Verwendung. </li></ol> 4. Machen Plasmid DNA Mix für Injektionszwecke <ol><li> Plasmid-DNA zu verdünnen zu einer Konzentration von 50 ng / ul mit 1:10 Phenolrot in ddH 2 O. FürBeispiel: <table border="1"><tbody><tr><td> 1,0 ml </td><td> Plasmid-DNA (250 ng / ml) </td></tr><tr><td> 0,5 ml </td><td> Phenolrot </td></tr><tr><td> 3,5 ml </td><td> ddH 2 O </td></tr></tbody></table></li><li> DNA-Mischung kann bei Raumtemperatur gehalten werden, wenn unter Verwendung sofort oder bei 4 ° C über mehrere Tage. </li></ol> 5. Richten Sie Fügepaaren Dies sollte den Abend getan werden, bevor Sie zu Injektionen planen. <ol><li> Füllen Zuchtbecken mit System Wasser und Ort Männchen und Weibchen zusammen. Wenn Injektionen können nicht so schnell durchgeführt werden, wie Anzeigen leuchten in der Anlage, separate Männchen und Weibchen mit einem Teiler. </li></ol> 6. Bereiten Sie sich für Injektionen (Kann getan während der Wartezeit für Embryonen werden) <ol><li> Schalten Sie Injektor rig. Achten Sie darauf, das System so eingestellt ist, pulsieren. Beginnen Sie mit der Impulsdauer auf 1 gesetzt. </li><li> Schalten Sie den AIR Ventil undStellen Sie den Druck Injektor ~ 20 psi. </li><li> Mit einem Binokular bei maximaler Vergrößerung, brechen Spitze der Nadel mit einer Pinzette oder einem Poker um eine ~ 2 um Öffnung (Abbildung 3, Movie 1) zu schaffen. </li><li> Füllen Sie Nadeln mit DNA Mix: 1. Platzieren Sie die Nadel, Spitze nach oben in der DNA-Mix und lassen die Nadel durch Kapillarwirkung oder 2 zu füllen. Mit einem Long-Reach-Spitze 1-2 ul der DNA pipettieren gemischt direkt in die Nadel. </li><li> Platz gefüllt Nadel an einem sicheren Ort, bis die Injektion bereit. </li></ol> 7. Sammle Embryonen <ol><li> Nach Anlage leuchtet eingeschaltet haben, entfernen Teiler (falls zutreffend). Sammle Embryonen mit einem Sieb / small Sieb und übertragen Sie sie auf einer Petrischale mit frischem Blau / Embryo Wasser. </li></ol> 8. Inject Embryonen im 1-2 Zell-Stadium <ol><li> Übertragen geerntet Embryonen Spritzgussformen mit einem Kunststoff-Pipette. </li><li> Mit einem Binokular, schieben Embryonen inBrunnen mit einer Pinzette oder einem stumpfen Poker (Abbildung 4, Movie 2). </li><li> Zeigen geladenen Nadel in einem Mikromanipulator und Position über Embryonen. </li><li> Kalibrieren Injektionsvolumen durch Einstellen der Impulsdauer in 1-Schritt-Schritten, bis Sie die gewünschte Lautstärke (~ 1 nl) zu erreichen. Dies könnte mit einem Mikrometer Folie kalibriert werden, wie es in einer früheren JoVE Videos 8, 22 beschrieben, aber für dieses Experiment Genauigkeit ist nicht erforderlich, da eine große Anzahl Injektionsvolumina in ausreichender Expression führt. </li><li> Inject ~ 1 nl DNA mischen direkt in die Zelle, und wiederholen Sie für alle Embryonen. DNA kann auch in den Dotter injiziert werden, aber dies neigt dazu, weniger effizient sein (Abbildung 5, Kinofilm 3). </li><li> Entfernen Sie injizierten Embryonen aus der Form mit einem sanften Strom von blau / Embryo Wasser. </li><li> Shop injizierten Embryonen bei 28,5 ° C in der Dunkelheit. </li><li> Entfernen unbefruchteten, beschädigte oder abgestorbene Embryonen periodisch. </li><li> Gönnen Embryonen with PTU zwischen 18-24 hpf zur Pigmentierung verhindern. </li></ol> 9. Screen für Transgene Expression <ol><li> Manuelles dechorionate 24-48 hpf Embryonen mit einer Pinzette. </li><li> Anesthetize Larven mit 0,02% Tricain. </li><li> Mit einem fluoreszierenden Seziermikroskop identifizieren Larven mit RB oder Trigeminus Neuron Ausdruck und übertragen Sie diese auf einen neuen Teller mit frischen PTU blau / Embryo Wasser. Embryonen mit spärlichen Ausdruck in leicht identifizierbaren Zellen sind optimal, aber einzelne Neuronen zur Aktivierung mit einem Glasfaserkabel ausgerichtet sein, so ein breites Spektrum des Ausdrucks Dichte ist akzeptabel. </li><li> Laden Embryonen bei 28,5 ° C im Dunkeln bis zur gewünschten Versuchsstadium. </li></ol> 10. Montieren Larven für Behavior Experiments <ol><li> Machen 1,5% niedrig schmelzende Agarose in ddH 2 O und Speicher in einem 42 ° C Heizblock es ein Erstarren zu verhindern. </li><li> Verwendung eines Glases Pasteurpipette Übertragung eines der vorbedruckte Larven in eine Wannee von 1,5% niedrig schmelzende Agarose mit so wenig blau / Embryo Wasser wie möglich. </li><li> Übertragen Larven in einem Tropfen Agarose auf eine kleine Petrischale. </li><li> Unter einem Binokular, Position Larve dorsalen up. </li><li> Wenn Agarose erstarrt ist, schneiden Sie das Agarose mit einer dünnen Rasierklinge (# 11 Skalpell), so dass ein Keil aus Agar um den gesamten Larve. </li><li> Machen Sie zwei diagonale Schnitte auf beiden Seiten der Dotter; darauf achten, nicht nick die Larve. </li><li> Füllen Sie den Bereich rund um die Agarose mit Embryo / blauen Wasser. </li><li> Ziehen Agarose vom Rumpf und Schwanz der Larve (Abbildung 6). </li></ol> 11. Bereiten Sie High-Speed ​​Camera and Imaging Software <ol><li> Montieren Sie High-Speed-Kamera auf Binokular. </li><li> Schließen Sie die Kamera an den Computer. </li><li> Schalten Sie den Computer ein. </li><li> Schalten Sie High-Speed-Kamera. </li><li> Open video / Imaging-Software (Wir verwenden AOS Imaging-Software und Verfahren für den Einsatz hier zu beschreiben, aber andere bildgebendeSoftware ist gleichermaßen akzeptabel). </li><li> Passen Sie die Kameraeinstellungen entsprechend (dh 1.000 Frames pro Sekunde (fps), 50% Triggerpuffer oder andere Einstellungen). </li><li> Starten Sie die Aufnahme. </li></ol> 12. Aktivieren einzelner Neurone mit einem 473 nm Laser <ol><li> Bringen Stimulator, Laser und Lichtwellenleiter. </li><li> Schalten Sie Stimulator. </li><li> Stimulator eingestellt auf maximal 5 Volt und einer Pulsdauer von 5 msec. </li><li> Schalten Sie Laser nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Verwenden Sie ein Binokular, um die Spitze des optischen Kabels in der Nähe Zellkörper eines Neurons mit Chef-tdTomato Ausdruck (Abbildung 6) zu positionieren. </li><li> Deliver Puls von blauem Licht auf sensorische Neuronen zu aktivieren. </li><li> Rekord Verhalten mit einem High-Speed-Kamera mit 500 oder 1.000 Bildern pro Sekunde. </li><li> Wiederholen Experiment wie gewünscht, wartet 1 Minute zwischen jeder Betätigung zur Gewöhnung zu vermeiden. (Wir nehmen ein Minimum von drei Antworten für jedes Neuron). </li><li> AufRelease Larven, hebeln auseinander Agarose mit einer Pinzette, kümmert sich nicht um das Tier zu verletzen. Dieses Tier erlaubt werden kann, weiter zu entwickeln, und das Verfahren kann in einem höheren Stufe wiederholt werden, um die Entwicklung des Verhaltens zu charakterisieren. Der Embryo kann auch für hochauflösende konfokale Abbildung der aktivierten Zelle Verhalten mit Zellstruktur korrelieren, wie unten beschrieben, wieder montiert werden. </li><li> Übertragen Larve Kultur Teller mit frischem blau / Embryo Wasser. Wir verwenden eine 24-Well-Platte zu verfolgen einzelnen Larven halten. </li></ol> 13. Bild Neuron (en) mit einem Konfokalmikroskop <ol><li> Anesthetize Larven mit 0,02% Tricain. </li><li> Berg Larven, dorsalen Seite nach oben in 1,2% niedrig schmelzende Agarose oder in einer dorsalen Form. </li><li> Bild Chef-tdTomato Neuronen mit einem 543-nm-Laser und geeignete Filter und Ziel. Wir verwenden ein 20x-Objektiv. </li><li> Entfernen Larven aus Agarose und zur individuellen Wohlbefindens mit blau / Embryo Wasser. </li><li> Lagerung bei 28,5 ° C im Dunkeln further Analyse. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanzielles Interesse haben.

Wir haben einen Ansatz für optogenetische Aktivierung der einzelnen RB Neuronen im Live Zebrafisch beschrieben. Unsere Methode beschäftigt transiente Transgenese einen fluoreszenzmarkierten Channelrhodopsin Variante Chef-tdTomato 13, in bestimmten somatosensorischen Neuronen auszudrücken. Dieser Ansatz könnte leicht zur Verwendung in anderen larvalen Zebrafisch Zellpopulationen angepasst werden. Mit diesem Ansatz konsequent ausgelöst Verhaltensreaktionen 34 bis 48 hpf Larven ...

Die Entwicklung optogenetische Verfahren zur Förderung oder Hemmung neuronaler Erregbarkeit mit definierten Wellenlängen von Licht hat es möglich gemacht, um die Funktion der unterschiedlichen Populationen von Neuronen in der neuronalen Schaltkreise Regelung des Verhaltens 1, 19, 21 zu studieren. Diese Technik wird oft verwendet, um Gruppen von Neuronen zu aktivieren, aber es kann auch verwendet werden, um einzelne Neuronen aktiviert werden. Zebrafisch-Larven sind besonders empfänglich zu diesen Methoden, da sie durchsichtig sind, entwickelt ihr Nervensystem schnell, und die Schaffung von transgenen Tieren ist schnell und Routine. Allerdings müssen erhebliche technische Hürden zu überwinden, um sicher zu erreichen einzelnes Neuron aktiviert werden. Um ein Verfahren zur optogenetische Aktivierung der einzelnen Zebrafisch Neuronen zu optimieren, haben wir uns auf somatosensorischen Neuronen. Zebrafischlarven erkennen eine Vielzahl von somatosensorischen Reize mit zwei Populationen von Neuronen: Trigeminus Neuronen, die den Kopf innervieren und Rohon-Beard (RB) Neuronen, die den Rest des Körpers innervieren. Jedes Neuron trigeminaler und RB projiziert einen peripheren Axon dass Zweige extensiv in der Haut auf Reize und eine zentrale, die Axon stromabwärts neuronalen Schaltkreise verbindet detektieren. Tiere reagieren, so früh wie 21 Stunden nach der Befruchtung (hpf) berühren, was darauf hinweist, dass eine kohärente somatosensorischen Schaltungen 5 gebildet, 18. Während Larvalentwicklung zumindest einige trigeminaler und RB Neuronen Synapse auf die Zelle zu aktivieren Mauthner klassischen Escape Reaktionen, aber vermehrt Hinweise darauf deutet, dass es mehrere Klassen von somatosensorischen Neuronen mit unterschiedlichen Mustern auf die Anbindung, die Variationen des Fluchtverhalten 2, 4 hervorrufen kann, 10, 12, 14, 15, 16, 17. Unsere Motivation zur Entwicklung dieser Verfahren war, die Verhaltens-Funktion von verschiedenen Klassen von Neuronen somatosensorischen charakterisieren, aber dieser Ansatz könnte im Prinzip verwendet werden, um die Funktion von nahezu jedem Neuron oder Population von Neuronen in lar studierenval Zebrafisch. Douglass et al. Zuvor beschrieben ein Verfahren zur Aktivierung Channelrhodopsin-2-Expression somatosensorischen Neuronen mit blauem Licht, entlocken Fluchtverhalten 3. Ihr Ansatz verwendet ein Enhancer-Element aus dem ISL1 Gen zur Expression von ChR2-EYFP in somatosensorischen Neuronen fahren. Dieses Transgen wurde jedoch berichtet, dass relativ schwache Fluoreszenz anzuzeigen, erfordern Coinjektion eines zweiten Reporters, um UAS :: GFP erlauben Visualisierung der Zellen, die EYFP-ChR2. Dieser Ansatz wurde verwendet, um das Verhalten Antworten zwischen 24-48 hpf entlocken, konnte aber nie eine Reaktion hervor letzten 72 hpf. Während also diese Methode funktioniert für das Studium neuronalen Schaltkreisen in einem sehr frühen Larvenstadien (24-48 hpf), ist es nicht ausreichend für die Charakterisierung von neuronalen Schaltkreisen und Verhaltensreaktionen bei älteren Larven, wenn mehr diverse Verhaltensreaktionen offensichtlich sind und neuronale Schaltkreise sind reifer. Wir versuchten,Verbesserung der Empfindlichkeit dieser Technik, um die Funktion von Subpopulationen von Larven RB Neuronen zu charakterisieren. Verbesserung der Expression verwendeten wir eine somatosensorischen-spezifischen Enhancer (CREST3) 20, um die Expression von LexA-VP16 und eine Strecke von LexA Operatorsequenzen (4xLexAop) 11 anzutreiben, um die Expression eines fluoreszierend markierten lichtaktivierten Kanal amplifizieren. Diese Konfiguration verstärkten Expression des Kanals, wodurch die Notwendigkeit für Co-Expression eines zweiten Reportergens und es uns ermöglicht, direkt die relative Häufigkeit des Kanals in jedem Neuron. Verwendung des LexA / LexAop Sequenz hatte den zusätzlichen Vorteil, dass es uns, die das Transgen in Zebrafische Linien, die die Reporter-System verwenden Gal4/UAS einzuführen. Transiente Expression dieses Transgen führte in verschiedenen Ebenen des Ausdrucks, sondern war in der Regel robust genug, um sowohl den Zellkörper und axonale Projektionen einzelner Neuronen über mehrere Tage zu visualisieren. Um sensitiv zu optimierenkeit zu beleuchten haben wir das Licht aktiviert Kanal Koch, ein Channelrhodopsin Variante, bestehend aus einer Chimäre channelopsin-1 (Chop1) und channelopsin-2 (CHOP2) mit einem Crossover-Website unter Helix-Schleife EF 13. Dieser Kanal wird bei der gleichen Wellenlänge wie ChR2 aktiviert, sondern erfordert geringere Lichtintensität für die Aktivierung, wodurch es empfindlicher als andere üblicherweise verwendete Kanäle, einschließlich ChR2. Der Küchenchef Protein wurde das rot fluoreszierende Protein, tdTomato verschmolzen, so dass wir für die Proteinexpression ohne Aktivierung des Kanals zu screenen. Als Lichtquelle verwendeten wir einen diodengepumpten Festkörperlaser (DPSS)-Laser, der mit einem faseroptischen Kabel, um eine präzise, ​​High-Power Pulses von blauem Licht auf eine bestimmte Region der Larven zu liefern. Dies erlaubte uns, Laserlicht auf einzelnen Neuronen zu konzentrieren, wodurch die Notwendigkeit für die Suche nach seltenen transgenen Tieren Ausdruck der Kanal in einem einzelnen Neuron. Mit diesem Ansatz konnten wir einzelne RB Neuronen zu aktivieren, notieren Verhaltensreaktions mit einem High-Speed-Video-Kamera und Bild die aktivierten Neuronen bei hoher Auflösung mit der konfokalen Mikroskopie.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Material </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Materialien </td></tr><tr><td> Glas Pasteurpipette </td><td> Fischer </td><td> 1367820B </td><td> o. dgl. (10-15 mm Durchmesser) </td></tr><tr><td> 200 &amp;mgr; Glasfaser </td><td> Thorlabs </td><td> AFS200/220Y-CUSTOM </td><td> Patchkabel, Länge: 3 m, A: FC / PC, B: FC / PC, Jacket: FT030 </td></tr><tr><td> 50 um Glasfaser </td><td> Thorlabs </td><td> AFS50/125Y-CUSTOM </td><td> Patchkabel, Länge: 3 m, A: FC / PC, B: FC / PC, Jacket: FT030 </td></tr><tr><td> Einstellbare Stripping Tool </td><td> Thorlabs </td><td> AFS900 </td><td> oder Drei-Loch Stripping Tool (FTS4) </td></tr><tr><td> Diamant Wedge Schreiber </td><td> Thorlabs </td><td> S90W </td><td></td></tr><tr><td> Flaming / Brown Feinpipettenziehvorrichtung </td><td> Sutter Instruments </td><td> P-97 </td><td> oder gleichwertige </td></tr><tr><td> Borosilicatglasröhren mit Filament </td><td> Sutter Instruments </td><td> BF-100-78-10 </td><td></td></tr><tr><td> Spritzgießwerkzeug </td><td> n / a </td><td> n / a </td><td> Abbildung 5 </td></tr><tr><td> 1,5 ml Zentrifugenröhrchen </td><td> Jeder </td><td> Jeder </td><td></td></tr><tr><td> Petrischale (100x15 mm) </td><td> Jeder </td><td> Jeder </td><td></td></tr><tr><td> Petrischale (60x15 mm) </td><td> Jeder </td><td> Jeder </td><td></td></tr><tr><td> Injektor </td><td> ASI </td><td> MPPI-3 </td><td> oder gleichwertige </td></tr><tr><td> Mikromanipulator und Metallständer </td><td> Narashige </td><td> M152 </td><td> oder gleichwertige </td></tr><tr><td> Einweg-Pipetten </td><td> Fisherbrand </td><td> 13-711-7 </td><td> oder gleichwertige </td></tr><tr><td> Poker (Pin Halter und Insekten pin) </td><td> Fine Science Tools, Inc. </td><td> 26018-17 und 26000-70 </td><td> oder gleichwertige </td></tr><tr><td> Zange </td><td> Fine Science Tools, Inc. </td><td> 11255-20 </td><td> oder gleichwertige </td></tr><tr><td> Microloader Pipettenspitzen </td><td> Eppendorf </td><td> 9300001007 </td><td></td></tr><tr><td> 28,5 ° C Inkubator </td><td> jeder </td><td> jeder </td><td></td></tr><tr><td> 42 ° C Heizblock </td><td> Jeder </td><td> Jeder </td><td></td></tr><tr><td> Non-Sterile Skalpellklingen Nr. 11 </td><td> Feine Scientific Tools, Inc. </td><td> 10011-00 </td><td> oder gleichwertige </td></tr><tr><td> Sezieren szurechtkommen </td><td> Zeiss </td><td> Stemi </td><td> oder gleichwertige </td></tr><tr><td> Fluorescent Binokular mit Standard-Filter </td><td> Jeder </td><td> jeder </td><td> oder gleichwertige </td></tr><tr><td> Konfokalmikroskop </td><td> Zeiss </td><td> LSM 510 oder 710 </td><td> oder gleichwertig mit Lasern für GFP und RFP und 10x, 20x und 40x </td></tr><tr><td> High-Speed-Kamera </td><td> AOS Technologies, Inc. </td><td> X-PRI (130025-10) </td><td> oder gleichwertige </td></tr><tr><td> 473 nm tragbare Laser </td><td> Kristall-Laser </td><td> CL-473 bis 050 </td><td> oder höhere Macht, mit TTL-Option </td></tr><tr><td> S48 Stimulator </td><td> Astro-Med, Inc. Grass Instrument Division </td><td> S48K </td><td> oder gleichwertige </td></tr><tr><td> FC / PC auf FC / PC Verbindungshülse </td><td> Thorlabs </td><td> ADAFC1 </td><td> May need für LWL-Verbindung </td></tr><tr><td> Laserschutzbrillen </td><td> Thorlabs </td><td> LG10 </td><td> oder gleichwertige </td></tr><tr><td> 24 Petrischalen </td><td> Genesee </td><td> 25-102 </td><td> oder gleichwertige </td></tr><tr><td> Einzel Depressionen Dias </td><td> Fischer </td><td> S175201 </td><td> Oder gleichwertig </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagens </td></tr><tr><td> Instant Ocean </td><td> Aquatic Ecosystems </td><td> IS50 </td><td></td></tr><tr><td> Methylenblau </td><td> Fischer </td><td> S71325 </td><td></td></tr><tr><td> Phenolrot </td><td> Sigma </td><td> P4758 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> EMD </td><td> 2125 </td><td> oder gleichwertige </td></tr><tr><td> Low Melt Agarose </td><td> Sigma </td><td> A9045 </td> &lt;td&gt; oder gleichwertig </td></tr><tr><td> PTU </td><td> Sigma </td><td> P7629 </td><td></td></tr><tr><td> Tricaine </td><td> Sigma </td><td> A5040 </td><td></td></tr><tr><td> blau / Embryo Wasser </td><td></td><td></td><td> 10 L ddH 2 O 0,6 g Instant Ocean 6 Tropfen Methylenblau </td></tr><tr><td> Phenolrot </td><td></td><td></td><td> (5 mg / ml in 0,2 M KCl) </td></tr><tr><td> 100x PTU </td><td></td><td></td><td> 0,150 g PTU 50 ml ddH 2 O lösen sich bei 70 ° C, oft schütteln aliquotieren und bei -20 ° C </td></tr><tr><td> 1x PTU </td><td></td><td></td><td> 1 ml 100x PTU 99 ml blau / Fisch Wasser </td></tr><tr><td> Tricaine Stammlösung </td><td></td><td></td><td> 400 mg Tricain 97,9 ddH 2 O </td></tr><tr><td> ~ 2,1 ml 1M Tris, pH 9,0, </td><td></td><td></td> &lt;td&gt; pH-Wert auf ~ 7,0 store in 4 ° C oder -20 ° C für die langfristige Lagerung </td></tr></tbody></table>

optogenetic activation of zebrafish somatosensory neurons using chef-tdtomato

Larven Zebrafisch als Modell für die Beschreibung der Entwicklung und Funktion von einfachen neuronalen Schaltungen entstehen. Aufgrund ihrer äußeren Befruchtung rasante Entwicklung, und Transluzenz werden Zebrafisch besonders gut für optogenetische Ansätze geeignet neuronalen Schaltkreis Funktion zu untersuchen. In diesem Ansatz werden lichtempfindlichen Ionenkanäle in bestimmten Neuronen exprimiert, so dass die Versuchsleiter zu aktivieren oder hemmen sie an Willen und somit beurteilen, ihren Beitrag zur spezifischen Verhaltensweisen. Die Anwendung dieser Methoden in der larvalen Zebrafisch ist konzeptionell einfach, erfordert aber die Optimierung der technischen Details. Hier zeigen wir, ein Verfahren zur Expression eines Channelrhodopsin Variante im Larvenstadium Zebrafisch somatosensorischen Neuronen, photo-aktivierenden Einzelzellen, und Aufzeichnen der resultierenden Verhaltensweisen. Durch die Einführung von ein paar Änderungen an bereits etablierten Methoden, könnte dieser Ansatz verwendet werden, um Verhaltensreaktionen von einzelnen Neuronen aktiviert bis hervorzurufenmindestens 4 Tagen nach der Befruchtung (dpf). Konkret haben wir ein Transgen mit einem somatosensorischen Neuronen Enhancer, CREST3, um den Ausdruck des markierten Channelrhodopsin Variante Chef-tdTomato fahren. Injektion dieses Transgen in 1-Zellen-Stadium Embryonen führt Mosaik Expression in somatosensorischen Neuronen, die mit Konfokalmikroskopie abgebildet werden können. Beleuchten identifizierten Zellen in diesen Tieren mit Licht von einer 473 nm Laser DPSS, geführt durch ein Glasfaserkabel, hervorruft Verhaltensweisen, die mit einer Hochgeschwindigkeits-Videokamera aufgezeichnet und analysiert werden können quantitativ. Diese Technik könnte zur Studie Verhaltensweisen hervorgerufen durch Aktivierung keine Zebrafisch Neuron angepasst werden. Kombiniert mit genetischen oder pharmakologischen Störungen wird eine leistungsfähige Methode zur Schaltung Bildung und Funktion zu untersuchen.

<img src="/files/ftp_upload/50184/50184fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Optic-Kabel eingerichtet. (A) Ebenen eines faseroptischen Kabels. (B) Stripped Glasfaserkabels in einer Pasteurpipette. (C) LWL-Kabel in Pasteurpipette positioniert mit einem Mikromanipulator. <img src="/files/ftp_upload/50184/50184fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Spritzgießwerkzeug Vorlage....

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Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato

Optogenetische Techniken haben es ermöglicht, den Beitrag der spezifischen Neuronen zu studieren. Wir beschreiben ein Verfahren in larvalen Zebrafisch zur Aktivierung einzelner somatosensorischen Neuronen Ausdruck einer Channelrhodopsin Variante (Chef) mit einem diodengepumpten Festkörperlaser (DPSS-Laser) und Aufzeichnung der ausgelöste Verhalten mit einem High-Speed-Video-Kamera.

Optogenetische Aktivierung der Zebrafisch Somatosensory Neuronen mit Chef-tdTomato

Larval  zebrafish are emerging as a model for describing the development and function  of simple neural circuits. Due to their  external fertilization, ...

optogenetic-activation-zebrafish-somatosensory-neurons-using-chef

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.7K Aufrufe.  University of California, Los Angeles. Optogenetische Techniken haben es ermöglicht, den Beitrag der spezifischen Neuronen zu studieren. Wir beschreiben ein Verfahren in larvalen Zebrafisch zur Aktivierung einzelner somatosensorischen Neuronen Ausdruck einer Channelrhodopsin Variante (Chef) mit einem diodengepumpten Festkörperlaser (DPSS-Laser) und Aufzeichnung der ausgelöste Verhalten mit einem High-Speed-Video-Kamera.

Serie: Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

Targeting Riechhirn Neuronen mit kombinierten In Vivo Elektroporation und Gal4-Based Enhancer-Trap Zebrafischlinien

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Forschung

Neurowissenschaften

Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons

Standard slice electrophysiology has allowed researchers to probe individual components of neural circuitry by recording electrical responses of single cells in response to electrical or pharmacological manipulations1,2. With the invention of methods to optically control genetically targeted neurons (optogenetics), researchers now have an unprecedented level of control over specific groups of neurons in the standard slice preparation. In particular, photosensitive channelrhodopsin-2 (ChR2) allows researchers to activate neurons with light3,4. By combining careful calibration of LED-based photostimulation of ChR2 with standard slice electrophysiology, we are able to probe with greater detail the role of adult-born interneurons in the olfactory bulb, the first central relay of the olfactory system. Using viral expression of ChR2-YFP specifically in adult-born neurons, we can selectively control young adult-born neurons in a milieu of older and mature neurons. Our optical control uses a simple and inexpensive LED system, and we show how this system can be calibrated to understand how much light is needed to evoke spiking activity in single neurons. Hence, brief flashes of blue light can remotely control the firing pattern of ChR2-transduced newborn cells.

Adult-born neurons expressing ChR2 can be manipulated in slice electrophysiological preparations in order to examine their contribution towards the function of olfactory neural circuits.

Mit Affordable LED Arrays für Photo-Stimulation von Neuronen

Standard slice electrophysiology has allowed researchers to probe individual components of neural circuitry by recording electrical responses of single ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Selektive Viral Transduktion von Adult-geboren olfaktorischen Neuronen für chronische In vivo Optogenetische Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

Eine Methode zur High Fidelity optogenetische Kontrolle der Einzelpyramidenzellen<em&gt; In-vivo-</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

Optogenetische Stimulation des Hörnervs

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

Somatosensory Event-related Potentials from Orofacial Skin Stretch Stimulation

Cortical processing associated with orofacial somatosensory function in speech has received limited experimental attention due to the difficulty of providing precise and controlled stimulation. This article introduces a technique for recording somatosensory event-related potentials (ERP) that uses a novel mechanical stimulation method involving skin deformation using a robotic device. Controlled deformation of the facial skin is used to modulate kinesthetic inputs through excitation of cutaneous mechanoreceptors. By combining somatosensory stimulation with electroencephalographic recording, somatosensory evoked responses can be successfully measured at the level of the cortex. Somatosensory stimulation can be combined with the stimulation of other sensory modalities to assess multisensory interactions. For speech, orofacial stimulation is combined with speech sound stimulation to assess the contribution of multi-sensory processing including the effects of timing differences. The ability to precisely control orofacial somatosensory stimulation during speech perception and speech production with ERP recording is an important tool that provides new insight into the neural organization and neural representations for speech.

This paper introduces a method for obtaining somatosensory event-related potentials following orofacial skin stretch stimulation. The current method can be used to evaluate the contribution of somatosensory afferents to both speech production and speech perception.

Somatosensorischen Ereignis-korrelierte Potenziale von Orofaziale Haut Stretch Stimulation

Cortical processing associated with orofacial somatosensory function in speech has received limited experimental attention due to the difficulty of ...

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after severe damage. Investigating the regeneration pathways in zebrafish might bring new insights to develop innovative strategies for the treatment of retinal degenerative diseases in mammals. Herein, we focused on the induction of a focal lesion to the outer retina in adult zebrafish by means of a 532 nm diode laser. A localized injury allows investigating biological processes that take place during retinal degeneration and regeneration directly at the area of damage. Using non-invasive optical coherence tomography (OCT), we were able to define the location of the damaged area and monitor subsequent regeneration in vivo. Indeed, OCT imaging produces high-resolution, cross-sectional images of the zebrafish retina, providing information which was previously only available with histological analyses. In order to confirm the data from real-time OCT, histological sections were performed and regenerative response after the induction of the retinal injury was investigated by immunohistochemistry.

M&amp;#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

The zebrafish is a popular animal model to study mechanisms of retinal degeneration/regeneration in vertebrates. This protocol describes a method to induce localized injury disrupting the outer retina with minimal damage to the inner retina. Subsequently, we monitor in vivo the retinal morphology and the M&#252;ller glia response throughout retinal regeneration.

Müller Glia-Zell-Aktivierung in einer laserinduzierten Netzhautdegeneration und Regeneration Modell im Zebrafisch

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Neuronalen Aktivität im primären somatosensorischen Cortex mit Thy1Imaging-GCaMP6s transgene Mäuse

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.

Tracking von Drosophila Larven Verhalten als Reaktion auf optogenetische Stimulation der olfaktorischen Neuronen

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

Isolation und RNA-Extraktion von Neuronen, Makrophagen und Mikroglia aus Larven Zebrafisch Gehirne

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...