Dieses Protokoll ermöglicht es uns also, pathologische Phasenübergänge von TDP-43 zu induzieren und ihre zellulären Folgen in den spinalen Motoneuronen in vivo zu adressieren, was für das Verständnis relevant ist, warum Motoneuronen bei ALS degenerieren. Durch die hohe Transparenz der Zebrafischlarven sind die Motoneuronen im Rückenmark direkt sichtbar. So kann man das dynamische Verhalten von TDP-43 visualisieren, das Phasenübergänge in einzelnen spinalen Motoneuronen durchläuft.
Diese Methode bietet ein neuartiges Tiermodell von ALS. Wir glauben, dass jede Methode, die den lichtinduzierten TDP-43-Phasenübergang und die Aggregation in diesem ALS-Modell verhindern kann, ein potenzieller Kandidat für die ALS-Therapie sein könnte. Andere ALS-bezogene Proteine mit intrinsisch gestörten Regionen können exprimiert werden, um die Neurotoxizität zu untersuchen, die mit den abnormalen Phasenübergängen verbunden ist.
Der Schlüssel zum Erfolg bei diesem Ansatz liegt darin, das optogenetische TDP-43 in den spinalen Motoneuronen auf ungiftiger Ebene zu exprimieren. Bac-Transgenese ist ein zeitaufwendiger Schritt, aber sobald Sie einen richtigen transgenen Fisch erzeugt haben, sind die folgenden Schritte relativ einfacher und unkomplizierter. Schalten Sie zunächst die Leuchtdiode oder das LED-Panel ein, indem Sie die zugehörige Anwendung verwenden, die auf einem Tablet oder Smartphone installiert ist.
Als nächstes legen Sie die Spektrometersonde in einen leeren Brunnen einer 6-Well-Schüssel. Stellen Sie dann mit der Anwendung das LED-Licht auf eine Wellenlänge von 456 nm ein. Platzieren Sie den optischen Sensor eines optischen Leistungsmessers in der leeren Vertiefung und stellen Sie die Leistung des LED-Lichts ein.
Stellen Sie dann die Schüssel mit der LED-Panel-Einstellung bei 28 ° C in einen Inkubator.Für die Bildgebung der Zebrafischlarven, die optogenetische TDP-43 exprimieren, dekreionieren Sie die doppelt transgenen Fische und betäuben Sie sie in einem E3-Puffer, der 250 g / ml Trican enthält. Als nächstes 1% Agarose mit niedriger Schmelztemperatur, die 250 g / ml Ethyl-3-Aminobenzoat-Methansulfonat enthält, bei 42 ° C vorheizen.Dann einen Tropfen der Agarose auf die Glasgrundschale geben. Der Durchmesser des kuppelförmigen Agarosetropfens auf der Glasschale sollte 8 bis 10 mm betragen.
Als nächstes geben Sie mit einer Pasteur-Pipette den betäubten Fisch zur Agarose auf der Glasschale. Minimieren Sie die Menge an E3-Puffer, die der Agarose zusammen mit dem Fisch hinzugefügt wird. Mischen Sie dann einige Male durch Pipettieren.
Halten Sie den Fisch während der Erstarrung der Agarose mit einer Spritzennadel auf der Seite, so dass sich das Rückenmark in einer geeigneten horizontalen Position befindet. Nachdem die Agarose erstarrt ist, fügen Sie ein paar Tropfen E3-Puffer auf den kuppelförmigen Agarose-montierten Fisch hinzu. Mit einem konfokalen Mikroskop, das mit einer 20-fachen Wasserimmersionsobjektivlinse ausgestattet ist, erfassen Sie serielle konfokale Z-Abschnitte des Rückenmarks.
Fügen Sie die Kloake auf der ventralen Seite des Fisches in den interessierenden Regionen als Referenz hinzu, um die Wirbelsäulensegmente über die Zeitpunkte hinweg zu identifizieren und zu vergleichen. Sobald die Bildgebung abgeschlossen ist, verwenden Sie eine Spritzennadel, um die Agarose vorsichtig zu knacken und den Fisch aus der Agarose zu entfernen. Halten Sie die Zeit, in der der Fisch in die Agarose eingebettet ist, so kurz wie möglich, obwohl die Einbettung von Agarose für weniger als 30 Minuten die Lebensfähigkeit des Fisches nicht beeinträchtigt.
Fügen Sie 7,5 ml E3-Puffer in einen Brunnen einer 6-Well-Schüssel hinzu und legen Sie den abgebildeten doppelt transgenen Fisch in diesen Brunnen. Platzieren Sie dann die Schüssel auf dem LED-Panel, halten Sie die Schüssel und das LED-Panel mit einem Abstandshalter 5 mm voneinander entfernt und schalten Sie das blaue LED-Licht ein. Bewahren Sie einige doppelt transgene Fische in einer separaten 6-Well-Schüssel auf, die mit Aluminiumfolie für unbeleuchtete Kontrollfische bedeckt ist.
Nach der gewünschten Beleuchtungszeit wurde das Rückenmark des beleuchteten Fisches wie zuvor gezeigt abgebildet. Die zytoplasmatische Verlagerung des opTDP-43h in einzelnen spinalen Motoneuronen wurde durch Trennung der bei 48 aufgenommenen Bilder der z-Serie visualisiert. und 72 Stunden nach der Befruchtung in jeden EGFP-TDP-43z- und opTDP-43h-Kanal.
Aus Projektionsbildern mit maximaler Intensität von EGFP-TDP-43z, einem einzelnen isolierten Spinalneuron, das bei beiden 48 identifizierbar ist. und 72 Stunden nach der Befruchtung wurde ausgewählt. Regionen von Interesse, die die Somas der Motoneuronen abdecken, wurden festgelegt, indem der Rand des EGFP-Signals bei 48 verfolgt wurde.
und 72 Stunden nach der Befruchtung. Die normalisierte Fluoreszenzintensität entlang der Hauptachse des Somas wurde aufgetragen. Und 48 Stunden nach der Befruchtung überlappten sich die Muster beider Signale weitgehend.
Im Gegensatz dazu wurde der Peak für das opTDP-43h-Signal nach 72 Stunden in der Region gefunden, in der das EGFP-TDP-43z-Signal niedrig war, was auf die zytoplasmatische Verlagerung von opTDP-43h hinweist. Um die OpTDP-43h- und EGFP-TDP-43z-Signale vor und nach der Blaulichtstimulation zu quantifizieren, wurden bei 48 einige Slices-Projektionsbilder für jeden Kanal der gleichen Z-Serie-Bilder erzeugt. und 72 Stunden nach der Befruchtung.
Von den vier untersuchten mnr2b+-Zellen zeigte Zelle 1 insbesondere ein gesättigtes EGFP-TDP-43z-Signal. Die relativen Mengen von opTDP-43h zu EGFP-TDP-43z wurden berechnet, indem der RFP-Wert durch den GFP-Wert dividiert wurde. Die Zellen 2 bis 4 zeigten nach blauer Lichtbeleuchtung abnehmende opTDP-43h-Werte an.
Es ist wichtig, die Zeit zu minimieren, in der die Fische in die Agarose eingebettet sind, um sie gesund zu halten. Durch die Anpassung der Intensität und Dauer der LED-Beleuchtung steuern wir den TDP-43-Phasenübergang auf temporär regulierte Weise, was dazu beitragen kann, das Fortschreiten des pathologischen TDP-43-Phasenübergangs im Motoneuron zu sezieren.
