Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es sich um eine optogenetische oder lichtaktivierte Methode zur Induktion der Genexpression in einem intakten Organismus handelt. In unserem Fall ein Zebrafisch-Embryo. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass sie Licht als induzierendes Mittel verwendet, das eine sehr präzise, räumliche und zeitliche Kontrolle der Induktion ermöglicht.
Dieses Protokoll wäre nützlich für jede Situation, in der eine induzierbare Genexpression nützlich wäre. Dazu gehören Dinge wie Lineage Tracing, Gain-of-Function-Assays oder Rettungsexperimente. Zunächst positioniert man das LED-Panel relativ zu den Petrischalen mit Embryonen, um mehrere Embryonen gleichzeitig mit 1,5 Milliwatt pro Quadratzentimeter Lichtleistung zu versorgen.
Um das Risiko einer Fotoschädigung des Tail Transcriptional Activator zu verringern, schalten Sie das Licht in Abständen von einer Stunde mit einem Timer-Relais ein, wenn Es länger als drei Stunden leuchtet. Entfernen Sie die Deckel der Petrischale, um die Lichtstreuung durch Kondensation zu minimieren. Stellen Sie Petrischalen mit Kontrollembryonen und einer lichtdichten Box für dunkle Kontrollen auf.
Entfernen Sie Embryonen nach der gewünschten Aktivierungsdauer aus der Beleuchtung. Verwenden Sie für die vollständige RNA-Extraktion ein RNA-Extraktionskit. Die Embryonen werden in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen und das überschüssige Eiwasser entfernen.
Nach Zugabe von Lysepuffer homogenisieren Sie die Embryonen mit dem Kunststoffstößel. Übertragen Sie das Lysat in eine mitgelieferte Säule und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers zur Reinigung der RNA. Lagern Sie die gereinigte RNA bei minus 20 bis minus 80 Grad Celsius bis zur Verwendung oder synthetisieren Sie cDNA sofort aus einem Mikrogramm Gesamt-RNA mit dem cDNA-Synthese-Kit, indem Sie den Anweisungen des Herstellers folgen.
Fügen Sie ein Mikrogramm RNA in ein dünnwandiges PCR-Röhrchen mit 0,2 Millilitern hinzu, das vier Mikroliter aus fünffacher cDNA-Reaktionsmastermischung enthält, gefolgt von der Zugabe eines Mikroliters mit 20-facher Reverse-Transkriptase-Enzymlösung. Als nächstes bilden Sie ein endgültiges Volumen von 20 Mikrolitern mit nukleasefreiem Wasser. Legen Sie das Rohr in einen programmierten Thermocycler für die cDNA-Synthese.
Lagern Sie die synthetisierte cDNA bei minus 20 Grad Celsius bis zur Verwendung oder sofort zur quantitativen Beurteilung. Richten Sie die quantitativen PCR-Reaktionen ein, die einen cybergrünen Enzym-Master-Mix enthalten. Fünffach verdünnte cDNA- und GFP-Primer in 325 Nanomolarkonzentration in Triplikaten und führen die Reaktion in einer programmierten Echtzeit-PCR-Maschine durch.
Analysieren Sie nach Abschluss der Reaktion die Schmelzkurve, um die Reaktionsspezifität zu bestimmen. Berechnen Sie die lichtaktivierte Induktion als Faltenänderung relativ zu den Kontrollembryonen mit der doppelten Delta-CT-Methode. Und verwenden Sie statistische Software, um die Signifikanz zu bestimmen.
Nachdem Sie die Embryonen aus der Beleuchtung entfernt haben, immobilisieren Sie embryonen für die Bildgebung in 3% Methylcellulose mit 0,01% Tricain in Glasdepressionobjektträgern. Erfassen Sie Fluoreszenz- und Hellfeldbilder auf einem fluoreszierenden Stereomikroskop, das mit einer Digitalkamera verbunden ist, wobei die Standard-GFP-Filtereinstellungen verwendet werden. Verschmelzen Sie Hellfeld- und Fluoreszenzbilder nach der Aufnahme mit einer Bildverarbeitungssoftware.
Die Quantifizierung der GFP-Expression zeigte eine Induktion der Expression bereits 30 Minuten nach der Blaulichtexposition an. Die GFP-Expression stieg dann bis zu sechs Stunden nach der Aktivierung stetig an. Die GFP-Induktion wurde auch qualitativ bewertet, indem die Fluoreszenzintensität gleichzeitig nach der Aktivierung untersucht wurde.
GFP-Fluoreszenz über dem Hintergrundniveau wurde erstmals drei Stunden nach der Aktivierung beobachtet und wurde nach sechs Stunden nach der Aktivierung merklich heller. Im Gegensatz dazu zeigten Kontrollembryonen für alle Zeitpunkte, die im Dunkeln gehalten wurden, keine nennenswerte GFP-Fluoreszenz. Das aktivierende Licht muss im blauen Bereich des sichtbaren Lichtspektrums liegen.
Sowohl Raumlicht als auch Sonnenlicht enthalten etwas blaues Licht. Achten Sie also darauf, Ihre Negativkontrollen vor Umgebungslichtquellen zu schützen. Das TAEL C120-System ist genetisch kodiert und modular und kann die Expression jedes interessierenden Gens steuern.
In Kombination mit anderen Techniken kann es verwendet werden, um eine Reihe von biologischen Fragen zu beantworten.
