저자는 라이브 셀 이미징에 자신의 소개를 위해 기술 지원 및 마이클 Rieger에 Bofan 우와 기독교 Raithel 감사하고 싶습니다. NCI, NIH RO1CA112176 (PAF), NCI, NIH의 지원. R01CA89041-10S1 (PAF), Deutscher Akademischer Austaush Dienst EV A/09/72227 참조. 316 (REN), 국방부 W81XWH-11-1-0074 (REN), 교육 과학 기술부 (R31-10069)의 지원을받는 한국의 국립 연구 재단을 통해 WCU (세계 클래스 대학) 프로그램 (PAF ), NIH IG20 RR025828-01 (설치류 장벽 시설 장비), 그리고 NIH NCI 5P30CA051008 (현미경 및 이미징 및 동물 공유 자원).

<html> 1. 전체 계획 <ol><li> 유전 공학의 유방 땀샘에서 preneoplastic 유방 상피 세포의 주요 문화를 생성하고 야생 형 생쥐을 관리 할 수​​ 있습니다. </li><li> 라이브 셀 이미지에게 최대 5 일에 Volocity 이미지 수집 소프트웨어 (버전 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA)를 사용하여 매 15 분 캡처합니다. </li><li> 타이밍 및 상피 세포 식민지 형성의 메커니즘, apoptosis의 입사 및 형태학의 변경 중단을 평가하기 위해 직접 시간 경과 이미지를 볼 수 있습니다. </li><li> 에 생성 Volocity. TIFF 스택을 변환합니다. MetaMorph의 현미경 자동화 및 이미지 분석 소프트웨어 (분자 ​​장치, LLC 서니 베일, CA) 및 이름 바꾸기 디지털 이미지 파일 (이름 바꾸기 2.1.6 사용하여 JPG 파일을 <a href="http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml" target="_blank">http://www.softpedia.com/get은 / 시스템 / 파일 관리 /-Rename.shtml</a> ) Timm의 추적 도구 소프트웨어 (TTT,과의 호환성을 사용하도록 설정하는 방법tz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index.html &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt; http://www.helmholtz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index. html)을 선택합니다. </li><li> TTT 사용하여, 세포 분열 (세포 수명)과 세포 분열의 패턴 (대칭 대 비대칭) 사이의 시간을 결정에 대한 세포 운명지도를 생성합니다. </li><li> 다른 유전 공학 마우스 모델 및 / 또는 야생 형 컨트롤 사이에 통계적으로 의미있는 차이가 있는지 확인하기 위해 3 단계 이상 5에서 양적 데이터를 분석합니다. </li></ol> 2. 기본 유방 상피 세포 문화의 생성 <ol><li> 제조업체의 지시 사항 (EpiCult-B 마우스 중간 키트, Stemcell 기술, 밴쿠버, BC)의 변화에​​ 따라 하나의 유방 상피 세포의 분리에 대한 전체 미디어를 준비합니다. 450 ML 에피 컬트-B 매체, 50 ML 에피 컬트 B 확산 보충, 5 % 태아 소 혈청 (FBS), 50 μg / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신 (PenStr을 결합EP) 10 NG / ML 표피 성장 인자 (EGF). </li><li> 2.1에서 9 부품 전체 미디어가 10 배 Collagenase / Hyaluronidase 혼합물의 한 부분을 결합하여 분리 미디어를 준비합니다. </li><li> 마우스를 안락사시켜야 즉시 검시를 진행합니다. 장소 스티로폼 검시 플랫폼에서의 뒷면에 마우스와 복부 피부가 팽팽하도록 사지를 확보. 하는 70 %의 에탄올과 팔다리 놓인 포함 복부 피부와 머리를, 포화. 중간 각 프런트 사지의 피부를 통해 Y-절개로 확장되는 피부를 통해 중간 선 절개를 (복막를 입력하지 않음)하여 # 2 / 3 (가슴) 및 # 4 / 5 (사타구니) 유방 땀샘에 노출 각 후면 다리의 안쪽 피부를 통해 Y 절개 아래 거꾸로. </li><li> 무딘 절개를 사용 underlyingperitoneum에서 피부를 분리,이 긴장 될 때까지 피부의 양쪽에 철수하고, 핀을 사용하여 스티로폼 검시 플랫폼에 고정하십시오. 바깥 쪽부터, 아까 그 바 말인데의 사려 분별이있는 사용과 무딘 절개를 사용하여ction 가위는 그대로 사타구니 및 / 또는 기본 결합 조직과 근육에서 가슴 유방 땀샘을 분리합니다. 10cm 무균 배양 접시에 더 이상 두 개보다 유방 땀샘을 놓고 조직 문화 후드로 이동합니다. </li><li> 조직 문화 후드에서 노란 색 작은 잘 circumscribed nodules로 표시되어 있습니다 유방 림프절에 대한 분비를 검사합니다. 멸균 메스와 집게를 사용하여 주변 선에서 림프절을 제거합니다. 이 멸균 메스, 각 손에 하나를 사용하여 ~ 1mm 세 조각으로 유방 조직을 이기다. </li><li> 장소 부드럽게 10 ML 피펫을 사용하여 2 ~ 3 배를 아래로 pipetting과로 5 ML 분리 미디어 믹스에서 유방 조직을 다진하고, 5 %의 CO 2와 37 ° C 배양기에서 (최대 ~ 16 시간) 밤 품다 느슨하게 뚜껑이있는 50 ML 원뿔 튜브. </li><li> 다음 날 아침, 붉은 색 BL을 홍보하기 위해 염화 암모늄 솔루션을 버퍼 2퍼센트 FBS, 4 부분을 포함하는 한 부분 행크스 &#39;균형 소금 솔루션 (HBSS)의 차가운 혼합물을 준비ood 세포 용해 (HFAmCl)뿐만 아니라 차가운 HBSS는 2 % FBS (HF)와 보충. 미리 따뜻한 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (0.25 %)는 행크의 균형 소금 솔루션 5 MG / ML Dispase, 1 MG / ML DNase I,와 전체 미디어를 수정. </li><li> 보육의 유방 조직과 원뿔 원심 분리기 튜브를 제거하고 부드럽게 소용돌이 2-3 초를 두 번 파동. 5 분 (실내 온도 또​​는 4 ° C)를 450 × g에서 튜브를 원심 분리기하고, 표면에 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 5 분 (실내 온도 또​​는 4 ° C)를 450 × g에서 10 ML의 HFAmCl과 원심 분리기의 최소의 펠렛을 Resuspend하고 표면에 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 펠렛에 3 ML 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 추가하고 5 ML 피펫 처음에 혼합 한 후 실 (1-3 분)까지 P1000 micropipettor와 함께. 5 분 (실내 온도 또​​는 4 ° C)에 대해 450 10 ML HF, 원심 분리기 × g을 추가하고 표면에 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 5 MG / ML Dispase 2 ML 1 MG / ML DNase I 펠릿 1 분을위한 P1000 micropipettor과 믹스에 200 μl를 추가합니다. 샘플 클리오해야udy하지만 실 수 없습니다. 실 경우, DNase I 100 μl를 추가하고 다시 섞는다. </li><li> 5 분 (실내 온도 또​​는 4 ° C) 10 ML 추운 HF, 450에서 40 μm 셀 스트레이너 및 원심 분리기를 통해 변형 × g을 추가하고 표면에 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 전체 미디어의 최종 펠렛을 Resuspend. 세포의 총 수를 (hemocytometer이나 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 카운터를 사용하여) 수량화. 두 유방 땀샘은 약 1 개 10월 6일부터 1일까지 X 10 7 세포를 얻을 수 있습니다. 물론 당 1.5 × 10 5 세포의 밀도를 평면 바닥 6 잘 플레이트에 플레이트 기본 상피 세포. </li></ol> 3. 라이브 셀 이미징 <ol><li> 즉시 세포를 도금 후, 2 / humidity/37를 포화 ° C 온도 배양 챔버 5 % CO 내 현미경 무대에서 안전하게 6 잘 판을 놓습니다. Kohler 조명 및 센터 위상 반지의 콘덴서를 조정합니다. 실험 여기에 제시된를 들어, 역 니콘 이클립스 TE300/PerkinElmer는 디스크 공 촛점을 스피닝10X 목적 렌즈와 widefield 위상 콘트라스트 모드에서 현미경 시스템이 사용되었습니다. </li><li> 오픈 이미지 수집 소프트웨어는 생성하고 시간 경과 이미지에 대한 라이브러리 이름을, 대형 파일에 대한 충분한 공간이있는 위치에 저장합니다. 실험은 여기 활용 Volocity 이미지 수집 소프트웨어 (버전 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA)를 발표했다. </li><li> 플레이트는 15 분의 최소 현미경 보육에 평형 수 있도록 허용합니다. 무대 렌즈 간섭을 방지하기 위해 렌즈를 낮 춥니 다. &quot;무대&quot;제목 아래, &quot;스테이지 조정 &#39;을 선택합니다. 초점 평면, 세트 Z 제목의 &quot;스테이지&quot;아래 &quot;추가 포인트&quot;를 선택하여 X, Y, Z 탭과 마르크 이미징 포인트 미만 = 0.을 Reacquire 위상 콘트라스트 이미지와 같은 이미지를위한 6 잘 플레이트의 각 우물의 중앙에 자리 포인트는 플라스틱 우물의 주변 근처 왜곡 될 수 있습니다. 4 × 4 분야 (650 μm는 x 700 μm 분야), 작은 오버랩 (약 5 %)이 각각의 사각형에 포인트를 마련합니다. &quot;남성 아래의 선택한 지점을 저장전자. &quot; </li><li> &quot;무대&quot;에서 선택 &quot;초점을지도하기 &#39;와 각 지점의 포커스를 설정하라는 메시지가 나타납니다 따릅니다. 시간 당 4 장의 사진을 (매 15 분) 캡처 이미지 수집 타이밍을 설정합니다. 이것은 특정 실험의 요구 사항에 따라 조정할 수 있습니다. &quot;무대&quot;아래의 초점지도를 저장합니다. </li><li> 오른쪽 오른쪽 도구 모음 &#39;이미지 수집 &quot;을 클릭하고 이미지 설정을 저장합니다. 이미지를 시작 레코드 버튼을 누릅니다. 1 시간 후에는, 조정이 필요한 경우 보려면 이미지의 초점을 확인합니다. </li><li> 모니터링 및 세포가 합류 될 때 종료, 5 일 동안 라이브 영상을 계속합니다. </li></ol> 4. 타이밍 및 초기 상피 세포의 콜로니 형성의 메커니즘, Apoptosis의 입사 및 형태학의 변경을 단계적으로 중지를 평가하기 위해 시간 경과 이미지를 직접보기 <ol><li> 시간 경과 이미지를 직접 볼 수는 호환 비디오보기 소프트웨어 (예 : 사용 실적을 할 수 있습니다 <a href="http://www.real.com/" target="_blank">HTTP를 :</a>/ / www.real.com/ 리얼 플레이어 또는 기타 프리웨어 또는 상용 소프트웨어). 이미지는이 단계에서 나. JPG 파일 (5 단계 참조)로 변환 한 후. TIFF 형식으로 볼 수 있습니다. </li><li> 초기 식민지 형성의 메커니즘을 확인하려면 접시에 하나 이미징 사이트를 대표하는 단일 이미지 스택과 함께 시작합니다. 초기 프레임에서 셀은 플로팅 될 것입니다. 첫 번째 상피 세포는 판에 부합시기를 결정하는 일련의 이미지를 따르십시오. 이 단계에서 상피 세포 식별 할 수 있으며, 그들보다 더 cuboidal 형태의 섬유 아세포에서 차별화. 직렬 이미지를 통해이 하나의 상피 세포에 따라 이후 24 시간 동안의 운명을 따르십시오. 이 추가 상피 세포로 둘러싸여되거나 세포 분열 또는 apoptosis를 겪 경우 기록합니다. 상피 세포로 둘러싸여 경우 주변 셀이 다음 초기 점착성의 셀 (들) 또는와 종합 부동 세포에서 파생하는 경우, 식민지 형성의 메커니즘은보고 직접 결정하실 수 있습니다초기 자기편 세포의 분열에서. 처음 24 시간 동안 세포 집계 대 세포 분열에 의해 형성된 콜로니 수를 기록합니다. </li><li> 특정 기간 동안 apoptosis를 받아야 처음 자기편 세포의 수를 확인하려면 자기편 된 셀에 개발 apoptosis의 고전적인 기능의 모양에 대한 일련 이미지를 따라 ( <a href="http://www.alsa.org/research/about-als-research/cell-death-and-apoptosis.html" target="_blank">http://www.alsa.org/research/about -als-research/cell-death-and-apoptosis.html</a> ) 및 이미지의 전체 기간 동안 또는 특정 시간 프레임 내에서 식별 된 apoptotic 세포의 수를 기록했다. </li><li> 시간이 지남에 따라 문화의 상피 세포가 EMT와 일치보다 가늘고 긴 모양으로 초기 cuboidal 모양에서 자신의 형태를 변경합니다. 이러한 경우가 발생하면 도금 후 일 / 시간을 결정하는 일련 이미지를 따르십시오. </li></ol> 5. 이미지 파일 수정 <ol><li&gt;는 Volocity 소프트웨어를 통해, TIFF 스택에 이미지 파일을 내보낼 수 있습니다. 여기 MetaMorph의 현미경 자동화 및 이미지 분석 소프트웨어는 (분자 장치, LLC 서니 베일, CA) TIFF 스택 ​​파일을 여는 데 사용되었다하고 그 다음 하나. JPG 이미지로 MetaMorph에 저장되었습니다. </li><li> Timm의 추적 도구 소프트웨어에 대한 요구 사항에 따라 이미지 폴더와 파일의 이름을 바꿉니다 이름 바꾸기 2.1.6 (같은 프리웨어 프로그램을 사용 <a href="http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml" target="_blank">http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml을</a> 그룹으로 파일 이름을 바꾸는 것이). 실험의 모든 폴더와 파일을 포함하는 하나의 폴더를 생성하고 (예를 들어 폴더 이름을 </em&gt; EXPERIMENTNAME). </li><li> 문화 이미징 된 각 점 / 위치에 대한 하위 폴더를 만듭니다. 하위 폴더의 이름을 지정 : EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER합니다. 위치 번호는 3 자리 숫자가 있어야합니다. 예 : 072511RN_p001. 하위 폴더에서 해당 개인 위치의 모든 이미지 파일을 놔. </li><li> timepoint (5 자리 숫자를 사용)이 형식의 각 파일 이름의 끝 부분에 채널 번호 (하나의 시야 채널이 있기 때문에, &quot;0&quot;사용) 추가 : EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER_tTIMEPOINT_wCHANNELNUMBER.jpgExample : 072511RN_p001_t00001_w0.jpg </li><li> 먼저 TTT 웹 사이트에서 무료로 프로그램 TTTlogfileconverter를 다운로드하여 각 위치에 대한 로그 파일을 생성합니다. TTTlogfileconverter 프로그램을 시작하고 실험 폴더를 선택합니다. 입력 이미지 간격 (초). 매 15 분 촬영 사진의 경우, 900 초를 입력합니다. 그런 다음 녹색 비밀 로그 파일 버튼을 누릅니다. </li></ol> 6. TTT를 사용하여 단일 셀의 셀 운명지도 생성 <ol><li> CTTTexport라는 폴더를 reate 모든 셀 추적 데이터가 TTT 소프트웨어 지침에 따라 저장 될 위치와 하위 폴더는 TTTfiles라고 </li><li> TTT 프로그램을 시작한 사용자의 이니셜을 선택하고를 클릭하십시오 &quot;계속.&quot; </li><li> 키를 눌러 &quot;설정 NAS를&quot;, &quot;TTTexport&quot;폴더를 생성 한 사용자를 선택하고 확인을 클릭합니다. 브라우저에서 다음 Enter 키를 누릅니다 &quot;로드 위치&quot;버튼을, 실험 폴더를 선택 위치 폴더를 선택합니다. </li><li> 에 안구 요소를 설정 &quot;10 배.&quot; 필요한 이미지의 수를로드 (모든 이미지를로드하는 것은 처음 권장합니다). </li><li> 셀 편집기 창에서 파일 메뉴에서 &quot;새 식민지&quot;를 선택합니다. 영화 창에서 셀을 추적 할 수있는 &#39;트랙 셀 &quot;또는 F2 키를 누릅니다. </li><li> M의 셀을 식별ovie 창 및 셀 위로 커서를 할 때 사용하는 마우스. F2를 클릭 한 후 세포의 번호와 원이 나타납니다. 다음 사진에 셀 사전의 위치를​​ 추적 할 수 키보드의 숫자 패드에있는 &quot;0&quot;키를 사용합니다. 각 프레임을 통해 각 셀의 위치를​​ 따라 커서를 이동합니다. 트랙을 삭제하고 숫자 패드에있는 이전 이미지 프레스 &quot;푸&quot;로 돌아갑니다. &quot;3&quot;셀 프레스를 추적하지 않고 앞으로 프레임을 이동하려면, 전화 번호 패드에 눌러 &quot;1&quot;을 추적하지 않고 뒤로 이동합니다. </li><li> 세포 분열은 영화 창에서 &quot;부&quot;버튼을 클릭 표시합니다. 세포 사망을 표시하려면 영화 창에서 &#39;셀 사망&#39;버튼을 클릭합니다. 부서가 발생되면, 딸 세포는 바로 자동 모드를 추적 할 수있는 셀 편집기 창에서 지정 딸 셀의 원 기호를 클릭하여 동일한 세포 운명지도에서 추적 할 수 있습니다. </li><li> 트리를 저장 F10을 누르십시오. 각 나무는 지정된 출력 배에 저장됩니다어 (TTTExport). 새로운 세포 운명지도를 시작하려면 셀 편집기 창에서 &quot;파일&quot;다음 &quot;열기&quot;메뉴에서 &quot;새 식민지&quot;를 선택합니다. </li><li> 셀 편집기 창에서 &#39;셀 데이터&#39;탭에서 수집 한 후 세포 수명 데이터를 집계. </li></ol> 7. 통계 분석 <ol><li> 어느 학생의 t-테스트를​​ 사용하여 (두 genotypes을 비교하는 경우) 또는 ANOVA 결정 (&gt; 두 genotypes을 비교하는 것은 경우) 등 초기 세포 식민지, 세포 수명 또는 시간 숫자로 파라 메트릭 데이터의 차이는 다른 genotypes 사이 EMT의 모습은 통계적 때까지 경우 중요 하지요. Apoptotic 주파수 번호 / 학생의 t-test 또는 ANOVA를 사용하여 총 도금 셀 또는 자기편 세포의 비율로 파생 맨 - 휘트니 또는 Kruskal-월리스와 비교할 수 있습니다. </li><li> 필요한 실험은 복제 얼마나 많은 결정하는 초기 실험의 분석에서 데이터를 사용하여 전력 테스트를 수행 충분한 s에 대한 수행과 세포 운명지도는 각 복제에서 생성 된사용 가능한 프리웨어를 사용하여 tatistical 전원 (예 : <a href="http://statpages.org/" target="_blank">http://statpages.org/</a> ). 여기에 제시된 실험에서 유전자형 당 3 쥐에서 파생 된 세포 문화는 특정 유전 수정이 만들어 질 때 세포 식민지 형성과 세포 수명의 통계적으로 의미있는 차이가 있었다 여부를 결정하기에 충분했다. </li></ol>

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	<li>Jones, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+estrogen+signaling+pathways+collaborates+with+loss+of+Brca1+to+promote+development+of+ERalpha-negative+and+ERalpha-positive+mammary+preneoplasia+and+cancer.">Activation of estrogen signaling pathways collaborates with loss of Brca1 to promote development of ERalpha-negative and ERalpha-positive mammary preneoplasia and cancer.</a> Oncogene. 27, 794-802 (2008).</li><li>Burga, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+proliferation+and+differentiation+properties+of+primary+mammary+epithelial+cells+from+BRCA1+mutation+carriers.">Altered proliferation and differentiation properties of primary mammary epithelial cells from BRCA1 mutation carriers.</a> Cancer Res. 69, 1273-1278 (2009).</li><li>Li, M., Wagner, K., Furth, P. A., Ip, M., Asch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+primary+mammary+epithelial+cells+and+transfection+by+viral+and+nonviral+methods.">Preparation of primary mammary epithelial cells and transfection by viral and nonviral methods.</a> Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer. , (2000).</li><li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+stem-cell-driven+regeneration+in+mammals.">Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals.</a> Nature. 453, 345-351 (2008).</li><li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+single-cell+imaging+of+mammalian+stem+cells.">Long-term single-cell imaging of mammalian stem cells.</a> Nature Methods. 8, S30-S35 (2011).</li><li>Eilken, H. M., Nishikawa, S. -. I., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+single-cell+imaging+of+blood+generation+from+haemogenic+endothelium.">Continuous single-cell imaging of blood generation from haemogenic endothelium.</a> Nature. 457, 896-900 (2009).</li><li>Kokkaliaris, K. D., Loeffler, D., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+tracking+hematopoiesis+at+the+single-cell+level.">Advances in tracking hematopoiesis at the single-cell level.</a> Current opinion in hematology. , (2012).</li><li>Rieger, M. A., Hoppe, P. S., Smejkal, B. M., Eitelhuber, A. C., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+cytokines+can+instruct+lineage+choice.">Hematopoietic cytokines can instruct lineage choice.</a> Science. 325, 217-218 (2009).</li><li>Rieger, M. A., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instruction+of+lineage+choice+by+hematopoietic+cytokines.">Instruction of lineage choice by hematopoietic cytokines.</a> Cell Cycle. 8, 4019-4020 (2009).</li><li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex.">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nat. Protoc. 6, 214-228 (2011).</li></ol>

제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.

중요 단계 그것은 유방 땀샘은 유방 상피 세포의 행동에 연령 관련 변화에 대한 제어 할 수있는 같은 시대의 마우스에서 수확되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 세포를 도금 할 때, 셀의 동일한 번호가 모든 실험에 대한 각각의 우물에 도금해야합니다. 문화가 가능한 직렬 이미지를 통해 여러 개별 셀을 따르도록하고 너무 빨리 합류가되지 않도록 도금 할 때 세포는 상대?...

유전 공학 마우스 모델은 공부하고 다른 유전자 병변이 유방암을 개발의 위험에 기여하는 방법을 이해하는 도구입니다. 예를 들어, 유전자 변형 마우스가 게재 한 광고 세 가지 요소의 조합 : 전체 길이 유방암 암 1, 초기 발병 (Brca1) 유방 상피 세포에서 유전자, 종양 단백질 p53의 (Tp53) 세균 라인 haploinsufficiency, 그리고 상피 유방의 손실 셀은 목표 상향 조절 에스트로겐 수용체 알파 Brca1 floxed (F) 11/f11/Mouse 유방 종양 바이러스 (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator (의 100 %에서 유방암의 개발에 (시대) 식 결과 tet 조합) -ER/MMTV-reverse 테트라 사이클린 transactivator (Brca1 f11/f11/MMTV-Cre/p53에서보고 된 낮은 비율 + /에 비해 세 12 개월로 rtTA 쥐 - 시대없이 마우스 이상 표현 (~ 50 - 60 %)와 Tp53 haploinsuf없이 Brca1 f11/f11/MMTV-Cre 마우스ficiency (&lt;5 %) 1. preneoplastic 기본 유방 상피 세포의 행동의 동적 시간 경과 영상 적은 쉽게 정적 조직 섹션에 부탁드립니다 셀 동작의 차이를 보여줍니다. 증식과 분화에 변경이 인간의 BRCA1 변이 캐리어의 기본 유방 세포에서 관찰됩니다. 단일 셀 정상적인에서 기본 유방 상피 세포의 중지 및 유전 공학 마우스의 2 제작이 resected 유선 조직의 효소 disassociation을 통해 생성됩니다. 3 시간 경과 이미지는 셀 식민지의 모양과 상피 - 중간 엽 전이 (EMT) 및 apoptosis를 포함한 세포의 형태학의 변화의 입사 메커니즘 및 타이밍을 평가하기 위해 볼 수 있습니다. 세포 운명지도의 생성은 세포 분열 (세포 수명) 및 세포 분열의 패턴 결정 사이의 시간 길이의 정량화는 단일 셀 추적의 사용에 의해 촉진된다. Timm의 추적 도구 (TTT)는 단일 셀의 운명지도를 생성하는 데 사용 공개적으로 사용 가능한 소프트웨어입니다. 세포 운명의 메커니즘을 elucidating에서의 유틸리티는 정상적인 조혈 줄기 세포 개발 6-9 뉴런의 생성을 조사 4,5 설립되었습니다. 10

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> EpiCult-B 자연적으로 흐르는 것과 매체 마우스 </td><td> StemCell 기술 </td><td> 05,610 </td><td></td></tr><tr><td> EpiCult-B의 확산 보조 식품 마우스 </td><td> StemCell 기술 </td><td> 05,612 </td><td></td></tr><tr><td> 재조합 인간 표피 성장 인자 (rhEGF) </td><td> StemCell 기술 </td><td> 02,633 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase / Hyaluronidase </td><td> StemCell 기술 </td><td> 07,912 </td><td></td></tr><tr><td> 일회용 Scapels </td><td> 깃 </td><td> 2975 # 10 </td><td></td></tr><tr><td> 행크스 &#39;균형 소금 솔루션 </td><td> StemCell 기술 </td><td> 37,150 </td><td></td></tr><tr><td>mmonium 염화 </td><td> StemCell 기술 </td><td> 07,800 </td><td></td></tr><tr><td> Tryspin-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> StemCell 기술 </td><td> 07,901 </td><td></td></tr><tr><td> Dispase </td><td> StemCell 기술 </td><td> 07,913 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> StemCell 기술 </td><td> 07,900 </td><td></td></tr><tr><td> 40 μm 셀 스트레이너 </td><td> StemCell 기술 </td><td> 27,305 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> StemCell 기술 </td><td> 06,100 </td><td></td></tr><tr><td> PenStrep </td><td> Gibco </td><td> 15,140 </td><td></td></tr></tbody></table>

time-lapse imaging of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer

시간 경과 영상은 유방암의 여러 유전자 변형 마우스 모델에서 파생 된 배양 주요 preneoplastic 유방 상피 세포의 행동을 비교하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 세포 분열 (세포 수명), apoptotic 세포 번호, 형태학의 변화의 진화, 그리고 식민지 형성의 메커니즘 사이의 시간은 정량 할 수 있으며, 특정 유전 병변을 가진 세포에 비교했다. 기본 유방 상피 세포 문화가 만져서 알 수있는 종양이없는 유방 땀샘에서 생성됩니다. 분비는 신중하게 인접 근육의 명확한 분리와 resected 있으며, 림프절이 제거되며, 풍부한 유방 상피 세포의 단일 셀 중지는 효소 분해 및 여과 뒤에 날카 유방 조직에 의해 생성됩니다. 단일 셀 중지는 라이브 세포 이미징을위한 보육 챔버 내에서 도금과 현미경 바로 아래에 배치됩니다. 각 w에서 4x4 구성에서 열 여섯 650 μm X 700 μm 분야6 잘 접시의 엘자은 5 일 동안 매 15 분 이미징 있습니다. 시간 경과 이미지는 직접 처음 24 세포를 도금 시간 (집계 대 세포 증식), apoptosis의 입사 및 형태학의 변경 사항을 단계적으로 내 세포 식민지 형성의 메커니즘과 주파수를 포함 할 수있다 세포 행동을 측정하는 검사입니다. 단일 셀 추적은 개별 셀 수명과 세포 분열 패턴 조사 측정을위한 세포 운명지도를 생성하는 데 사용됩니다. 양적 데이터는 통계적으로 특정 유전 병변과 상관 행동에 상당한 차이를 평가하기 위해 분석하고 있습니다.

상피 및 섬유 아세포 세포는 세포 형태에 의해 구별 할 수 있습니다. 상피 세포는 cuboidal 모양 (그림 1A-B) 및 양식 세포 식민지 (그림 1A)를 갖추고 있습니다. 섬유 아세포, stromal 세포의 종류, 가늘고 긴 형태 (그림 1C)을 갖추고 있습니다. 세포는 반올림 및 이미징의 시작 (그림 2A-D)에 떠 있었다. 플레이트에 부착 후에는 평면이?...

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Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

시간 경과 영상은 특정 행동 매개 변수 독특한 유전 적 병변 사이에 상관 관계가 있는지 확인하기 위해 유방암 위험 유전자 변형 마우스 모델에서 파생 된 기본 preneoplastic 유방 상피 세포의 행동을 평가하는 데 사용됩니다.

기본 Preneoplastic 유방 상피 세포의 시간 경과 영상은 유방암의 유전자 변형 마우스 모델에서 파생

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

11.8K 조회수.  Georgetown University. 시간 경과 영상은 특정 행동 매개 변수 독특한 유전 적 병변 사이에 상관 관계가 있는지 확인하기 위해 유방암 위험 유전자 변형 마우스 모델에서 파생 된 기본 preneoplastic 유방 상피 세포의 행동을 평가하는 데 사용됩니다.

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In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

유방암 뇌 전이의 종양 Hypoxia 역학 생체내의 Bioluminescence 이미징에서는 마우스 모델에서

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

연구

의학

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of extracellular matrix (ECM) and a variety of mesenchymal cells, including fibroblasts, myofibroblasts, endothelial cells, pericytes and leukocytes 1-3.
The tumour-associated stroma is responsive to substantial paracrine signals released by neighbouring carcinoma cells. During the disease process, the stroma often becomes populated by carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) including large numbers of myofibroblasts. These cells have previously been extracted from many different types of human carcinomas for their in vitro culture. A subpopulation of CAFs is distinguishable through their up-regulation of &alpha;-smooth muscle actin (&alpha;-SMA) expression4,5. These cells are a hallmark of 'activated fibroblasts' that share similar properties with myofibroblasts commonly observed in injured and fibrotic tissues 6. The presence of this myofibroblastic CAF subset is highly related to high-grade malignancies and associated with poor prognoses in patients.
Many laboratories, including our own, have shown that CAFs, when injected with carcinoma cells into immunodeficient mice, are capable of substantially promoting tumourigenesis 7-10. CAFs prepared from carcinoma patients, however, frequently undergo senescence during propagation in culture limiting the extensiveness of their use throughout ongoing experimentation. To overcome this difficulty, we developed a novel technique to experimentally generate immortalised human mammary CAF cell lines (exp-CAFs) from human mammary fibroblasts, using a coimplantation breast tumour xenograft model.
In order to generate exp-CAFs, parental human mammary fibroblasts, obtained from the reduction mammoplasty tissue, were first immortalised with hTERT, the catalytic subunit of the telomerase holoenzyme, and engineered to express GFP and a puromycin resistance gene. These cells were coimplanted with MCF-7 human breast carcinoma cells expressing an activated ras oncogene (MCF-7-ras cells) into a mouse xenograft. After a period of incubation in vivo, the initially injected human mammary fibroblasts were extracted from the tumour xenografts on the basis of their puromycin resistance 11.
We observed that the resident human mammary fibroblasts have differentiated, adopting a myofibroblastic phenotype and acquired tumour-promoting properties during the course of tumour progression. Importantly, these cells, defined as exp-CAFs, closely mimic the tumour-promoting myofibroblastic phenotype of CAFs isolated from breast carcinomas dissected from patients. Our tumour xenograft-derived exp-CAFs therefore provide an effective model to study the biology of CAFs in human breast carcinomas. The described protocol may also be extended for generating and characterising various CAF populations derived from other types of human carcinomas.

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) rich in myofibroblasts present within the tumour stroma, play a major role in driving tumour progression. We developed a coimplantation tumour xengraft model for experimentally generating CAFs from human mammary fibroblasts. The protocol describes how to establish CAF myofibroblasts that acquire an ability to promote tumourigenesis.

인간 Mammary 섬유아 세포에서 암종 - 관련 섬유아 세포의 실험 세대 (CAFs)

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

유방암의 마우스 모델에서 종양 Microenvironment에 약물 응답의 영상을 라​​이브

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

환자 유래 세포 배양 및 CD133의 절연<sup&gt; +</sup흑종에서&gt; Putative 암 줄기 세포

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

유방암 세포에서 에스트로겐 조절 마이크로 RNA의 프로파일

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

고체 시편에서 기본 난소 암 세포를 얻는 방법

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

마우스의 유방 지방 패드에 유방암 세포의 소성 주입은 종양의 성장을 연구한다.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Tracking the Mammary Architectural Features and Detecting Breast Cancer with Magnetic Resonance Diffusion Tensor Imaging

Breast cancer is the most common cause of cancer among women worldwide. Early detection of breast cancer has a critical role in improving the quality of life and survival of breast cancer patients. In this paper a new approach for the detection of breast cancer is described, based on tracking the mammary architectural elements using diffusion tensor imaging (DTI). 
The paper focuses on the scanning protocols and image processing algorithms and software that were designed to fit the diffusion properties of the mammary fibroglandular tissue and its changes during malignant transformation. The final output yields pixel by pixel vector maps that track the architecture of the entire mammary ductal glandular trees and parametric maps of the diffusion tensor coefficients and anisotropy indices. 
The efficiency of the method to detect breast cancer was tested by scanning women volunteers including 68 patients with breast cancer confirmed by histopathology findings. Regions with cancer cells exhibited a marked reduction in the diffusion coefficients and in the maximal anisotropy index as compared to the normal breast tissue, providing an intrinsic contrast for delineating the boundaries of malignant growth. Overall, the sensitivity of the DTI parameters to detect breast cancer was found to be high, particularly in dense breasts, and comparable to the current standard breast MRI method that requires injection of a contrast agent. Thus, this method offers a completely non-invasive, safe and sensitive tool for breast cancer detection.

We describe how to obtain parametric and vector maps of the diffusion tensor of the breast using magnetic resonance imaging. The protocol and final output following imaging processing are tailored for tracking breast architectural features and detecting breast malignancy.

자기 공명 확산 텐서 영상과 유방 아키텍처 특징을 추적 및 탐지 유방암

Breast cancer is the most common cause of cancer among women worldwide. Early detection of breast cancer has a critical role in improving the quality of ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal systems. HFUS has the ability to detect structures as small as 30 &#181;m, a property that has been utilized for visualizing superficial lymph nodes in rodents in brightness (B)-mode. Combining power Doppler with B-mode imaging allows for measuring circulatory blood flow within lymph nodes and other organs. While HFUS has been utilized for lymph node imaging in a number of mouse&#160; model systems, a detailed protocol describing HFUS imaging and characterization of the cervical lymph nodes in mice has not been reported. Here, we show that HFUS can be adapted to detect and characterize cervical lymph nodes in mice. Combined B-mode and power Doppler imaging can be used to detect increases in blood flow in immunologically-enlarged cervical nodes. We also describe the use of B-mode imaging to conduct fine needle biopsies of cervical lymph nodes to retrieve lymph tissue for histological&#160; analysis. Finally, software-aided steps are described to calculate changes in lymph node volume and to visualize changes in lymph node morphology following image reconstruction. The ability to visually monitor changes in cervical lymph node biology over time provides a simple and powerful technique for the non-invasive monitoring of cervical lymph node alterations in preclinical mouse models of oral cavity disease.

This protocol describes the application of high-frequency ultrasound (HFUS) for imaging mouse cervical lymph nodes. This technique optimizes visualization and quantification of cervical lymph node morphology, volume and blood flow. Image-guided biopsy of cervical lymph nodes and processing of lymph tissue for histological evaluation is also demonstrated.

마우스 경부 림프절의 고주파 초음파 이미징

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and heterogeneity of patient-derived multiple myeloma (MM) cells. This approach consists in seeding primary MM cells freshly extracted from bone marrow aspirates into microfluidic chambers implemented in multi-well plates, each consisting of a reconstruction of the bone marrow microenvironment, including extracellular matrix (collagen or basement membrane matrix) and stroma (patient-derived mesenchymal stem cells) or human-derived endothelial cells (HUVECs). The chambers are drugged with different agents and concentrations, and are imaged sequentially for 96 hr through bright field microscopy, in a motorized microscope equipped with a digital camera. Digital image analysis software detects live and dead cells from presence or absence of membrane motion, and generates curves of change in viability as a function of drug concentration and exposure time. We use a computational model to determine the parameters of chemosensitivity of the tumor population to each drug, as well as the number of sub-populations present as a measure of tumor heterogeneity. These patient-tailored models can then be used to simulate therapeutic regimens and estimate clinical response.

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

차 다발성 골수종 세포의 약물 민감도의 특성에 대한의 Organotypic 높은 처리량 시스템

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

기본 Preneoplastic 유방 상피 세포의 시간 경과 영상은 유방암의 유전자 변형 마우스 모델에서 파생

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

유방암 뇌 전이의 종양 Hypoxia 역학 생체내의 Bioluminescence 이미징에서는 마우스 모델에서

인간 Mammary 섬유아 세포에서 암종 - 관련 섬유아 세포의 실험 세대 (CAFs)

유방암의 마우스 모델에서 종양 Microenvironment에 약물 응답의 영상을 라이브

환자 유래 세포 배양 및 CD133의 절연

유방암 세포에서 에스트로겐 조절 마이크로 RNA의 프로파일

고체 시편에서 기본 난소 암 세포를 얻는 방법

마우스의 유방 지방 패드에 유방암 세포의 소성 주입은 종양의 성장을 연구한다.

자기 공명 확산 텐서 영상과 유방 아키텍처 특징을 추적 및 탐지 유방암

마우스 경부 림프절의 고주파 초음파 이미징

차 다발성 골수종 세포의 약물 민감도의 특성에 대한의 Organotypic 높은 처리량 시스템

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