Les auteurs tiennent à remercier Bofan Wu et Christian Raithel pour l&#39;assistance technique et Michael Rieger pour son introduction à l&#39;imagerie des cellules vivantes. Soutenu par le NCI, NIH RO1CA112176 (PAF), NCI, NIH. R01CA89041-10S1 (PAF), Deutscher Akademischer Austaush Dienst eV A/09/72227 Réf. 316 (REN), ministère de la Défense W81XWH-11-1-0074 (REN), WCU (World Class University), grâce à la Fondation Nationale de la Recherche de Corée financé par le ministère de l&#39;Éducation, de la Science et de la Technologie (R31-10069) (PAF ), NIH IG20 RR025828-01 (matériel de l&#39;usine rongeurs Barrière), et les NIH NCI 5P30CA051008 (microscopie et d&#39;imagerie et des ressources animales partagées).

<html> 1. Schéma général <ol><li> Générer des cultures primaires de cellules épithéliales mammaires précancéreuses de glandes mammaires de génie génétique et de contrôler souris de type sauvage. </li><li> Capturez cellules vivantes images toutes les 15 min en utilisant un logiciel d&#39;acquisition d&#39;image Volocity (version 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA) pour un maximum de 5 jours. </li><li> Voir le time-lapse images directement pour évaluer le calendrier et le mécanisme de la formation de colonies de cellules épithéliales, l&#39;incidence de l&#39;apoptose, et l&#39;échelonnement des changements morphologiques. </li><li> Autre Volocity généré. Piles TIFF. Fichiers JPG l&#39;aide d&#39;Automation Microscopie MetaMorph et logiciels d&#39;analyse d&#39;images (Molecular Devices, Sunnyvale, CA LLC) et renommer des fichiers d&#39;images numériques (THE Rename 2.1.6, <a href="http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml" target="_blank">http://www.softpedia.com/get / Système / Fichier-Gestion / LA Rename.shtml-</a> ) pour permettre la compatibilité avec les logiciels Timm outil de suivi (TTT,tz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index.html &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://www.helmholtz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index. html). </li><li> Utiliser TTT, de générer des cartes du destin cellulaire pour la détermination du temps entre les divisions cellulaires (durée de vie des cellules) et les modèles de la division cellulaire (symétrique par rapport asymétrique). </li><li> Analyser les données quantitatives des étapes 3 et 5 ci-dessus afin de déterminer s&#39;il existe des différences statistiquement significatives entre les différents modèles de souris génétiquement modifiées et / ou de type sauvage contrôles. </li></ol> 2. Génération des primaires cultures de cellules épithéliales mammaires <ol><li> Préparer les médias complètes pour l&#39;isolement de simples cellules épithéliales mammaires suite à une variation d&#39;instructions du fabricant (EpiCult-B Kit Souris moyen, StemCell Technologies, Vancouver, Colombie-Britannique). Mélanger 450 ml Epi-Cult-B moyenne, 50 ml Epi-Cult B prolifération supplément, 5% de sérum fœtal bovin (FBS), 50 ug / ml de pénicilline / streptomycine (PenStrep) et 10 ng / ml de facteur de croissance épidermique (EGF). </li><li> Préparer dissociation des médias en combinant 1 partie d&#39;un 10x collagénase / hyaluronidase mélange avec 9 parties complètes de médias 2.1. </li><li> Euthanasier souris et procéder immédiatement à une autopsie. Placer la souris sur le dos sur une plate-forme autopsie mousse de polystyrène et de sécuriser les quatre membres pour une peau ventrale est tendue. Saturer la peau ventrale et les cheveux, y compris celle recouvrant les jambes, avec de l&#39;éthanol à 70%. Exposer # 2/3 (thoracique) et n ° 4/5 (inguinal) des glandes mammaires en faisant une incision médiane à travers la peau (ne pas entrer dans le péritoine) qui se prolonge dans un Y-incision à travers la peau médiale de chaque membre antérieur et une incision à l&#39;envers Y à travers la peau médiale de chaque patte arrière. </li><li> Utilisation dissection, séparer la peau de underlyingperitoneum, tirez sur les deux côtés de la peau jusqu&#39;à ce qu&#39;elle soit bien tendue, et le fixer à la plate-forme autopsie polystyrène en utilisant des épingles. A partir de la face externe, utilisez dissection avec une utilisation judicieuse des dissection ciseaux pour isoler le inguinal intact et / ou thoraciques glandes mammaires de tissu conjonctif sous-jacent et le muscle. Placer pas plus de deux glandes mammaires d&#39;un 10 cm boîte de Petri stérile et à déplacer le capot de culture tissulaire. </li><li> En hotte de culture de tissus, d&#39;examiner les glandes mammaires pour les ganglions lymphatiques qui sont identifiés comme de petits nodules bien circonscrites avec une couleur jaunâtre. Enlever les ganglions lymphatiques de la glande qui entoure l&#39;utilisation scalpel stérile et une pince. Mince tissu mammaire dans ~ 1 mm 3 cubes en utilisant deux scalpels stériles, un dans chaque main. </li><li> Lieu hachée tissu mammaire dans 5 ml de dissociation des médias, mélanger doucement par pipetage de haut en bas 2-3 fois à l&#39;aide d&#39;une pipette de 10 ml et incuber pendant la nuit (jusqu&#39;à ~ 16 h) dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2 dans un 50 ml avec bouchon tube conique desserré. </li><li> Le lendemain matin, préparer un mélange froid de la solution 1 partie «saline équilibrée de Hanks (HBSS) contenant 2% de FBS et 4 parties une solution tamponnée de chlorure d&#39;ammonium à promouvoir rouge blla lyse des cellules ood (HFAmCl) ainsi que HBSS froid additionné de 2% de FBS (HF). Préchauffer trypsine-EDTA (0,25%), 5 mg / ml dans une solution de dispase saline équilibrée de Hank jour, 1 mg / ml de DNase I et Media complètes. </li><li> Retirer le tube de centrifugation conique avec le tissu mammaire de l&#39;incubateur et doucement impulsion tourbillonnaire 2-3 Sec deux fois. Centrifuger le tube à 450 g pendant 5 min (température ambiante ou à 4 ° C) et jeter le surnageant. </li><li> Remettre en suspension le culot dans un minimum de 10 ml HFAmCl et centrifuger à 450 g pendant 5 min (température ambiante ou à 4 ° C) et éliminer le surnageant. </li><li> Ajouter 3 ml de trypsine-EDTA au culot et mélanger d&#39;abord avec une pipette de 5 ml, puis avec une micropipette P1000 jusqu&#39;à filandreuse (1-3 min). Ajouter 10 ml de HF, centrifuger à 450 × g pendant 5 min (température ambiante ou à 4 ° C) et éliminer le surnageant. </li><li> Ajouter 2 ml de 5 mg / ml Dispase et 200 pi de 1 mg / ml de DNase I au culot et mélanger avec une micropipette P1000 pendant 1 min. L&#39;échantillon doit être cloudy mais pas filandreuse. Si filandreux, ajouter 100 ul de DNase I et mélanger à nouveau. </li><li> Ajouter 10 ml HF à froid, de la souche à travers une passoire cellule 40 um et centrifuger à 450 g pendant 5 min (température ambiante ou à 4 ° C) et éliminer le surnageant. </li><li> Remettre en suspension le culot final dans les médias complètes. Quantifier le nombre total de cellules (à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre ou un compteur Coulter). Deux glandes mammaires obtenir environ 1 x 10 6 à 1 x 10 7 cellules. Plate cellules primaires épithéliales dans un fond plat à 6 puits plaque à une densité de 1,5 x 10 5 cellules par puits. </li></ol> 3. Imagerie des cellules vivantes <ol><li> Immédiatement après l&#39;étalement des cellules, placez la plaque à 6 puits en toute sécurité sur une platine de microscope dans un 5% de CO 2 / saturé humidity/37 ° C chambre d&#39;incubation de la température. Réglez le condenseur pour éclairage de Köhler et le centre des anneaux de phase. Pour les expériences présentées ici, inversé Nikon Eclipse TE300/PerkinElmer Spinning Disc ConfocalSystème de microscope à contraste de phase en mode grand champ avec une lentille d&#39;objectif 10x a été utilisé. </li><li> Ouvrez le logiciel d&#39;acquisition d&#39;images, créez et nommez une bibliothèque pour les images à intervalles de temps, et enregistrer dans un emplacement avec suffisamment d&#39;espace pour les fichiers volumineux. Les expériences présentées ici utilisé le logiciel d&#39;acquisition d&#39;image Volocity (version 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA). </li><li> Laisser la plaque s&#39;équilibrer dans l&#39;incubateur microscope pour un minimum de 15 minutes. Abaissez les lentilles afin d&#39;éviter les interférences stade-lentille. Dans le cadre du «Stage» rubrique, sélectionnez &quot;Calibrer scène.&quot; Réacquérir le plan focal, série Z = zéro dans les points d&#39;imagerie x, y, z onglet et en sélectionnant la marque &quot;Ajouter point&quot; dans le &quot;Stage&quot; rubrique. Points de place dans le milieu de chaque puits de la plaque à 6 puits pour l&#39;imagerie comme l&#39;imagerie à contraste de phase peut être déformé à proximité de la périphérie du puits en plastique. Organiser des points dans un carré de 4 x 4 champs (650 um x 700 um champs), chacune avec un léger chevauchement (environ 5%). Enregistrez les points sélectionnés sous &quot;Stage ». </li><li> Sous la rubrique «Stage» sélectionnez «Make carte focus&quot; et suivez les instructions pour placer le focus sur chaque point. Définir le calendrier d&#39;acquisition d&#39;image pour capturer 4 photos par heure (toutes les 15 min). Ce peut être ajustée en fonction des besoins spécifiques de l&#39;expérience. Enregistrer la carte sous point &quot;Stage&quot;. </li><li> Faites un clic droit sur l&#39;outil côté &quot;Image Acquisition&quot; right bar et enregistrer les paramètres d&#39;imagerie. Appuyez sur le bouton d&#39;enregistrement pour commencer l&#39;imagerie. Après 1 heure, vérifiez l&#39;orientation des images pour voir si un ajustement est nécessaire. </li><li> Surveiller et continuer imagerie en temps réel pendant 5 jours, se terminant lorsque les cellules deviennent confluentes. </li></ol> 4. Affichage direct de Time-lapse Images pour évaluer calendrier et le mécanisme de formation initiale des colonies de cellules épithéliales, l&#39;incidence de l&#39;apoptose, et mise en phase de changements morphologiques <ol><li> L&#39;observation directe du time-lapse images peuvent être réaliser en utilisant n&#39;importe quel logiciel de visualisation vidéo compatible (par exemple <a href="http://www.real.com/" target="_blank">http:</a>/ / Www.real.com/ realplayer ou autre logiciel freeware ou disponible dans le commerce). Images peuvent être visualisées en format. TIFF à cette étape ou après conversion en fichiers JPG. (Voir étape 5). </li><li> À déterminer mécanisme de formation de colonies initial, commencer par un empilement d&#39;une seule image représentant une place sur la plaque de formation d&#39;image. Dans les trames initiales, les cellules seront flottante. Suivre images de série pour déterminer si la cellule épithéliale première adhère à la plaque. À cette étape, les cellules épithéliales peuvent être identifiés et différenciés à partir de fibroblastes par leur morphologie cubique plus. Suivez cette seule cellule épithéliale à travers des images en série et suivre son destin sur la suivante 24 h. Notez s&#39;il devient entouré par d&#39;autres cellules épithéliales ou subit la division cellulaire ou l&#39;apoptose. Si entouré par les cellules épithéliales, le mécanisme de formation de colonies peut être déterminée directement en regardant si les cellules environnantes sont dérivées de cellules flottantes qui agrègent ensuite à la cellule initiale adhérent (s) oude division de la cellule initiale adhérente. Notez le nombre de colonies formées par agrégation cellulaire et la division cellulaire au cours des 24 premières heures. </li><li> Pour déterminer le nombre de cellules initialement adhérentes qui subissent l&#39;apoptose au cours d&#39;une période de temps spécifique, suivez images en série de l&#39;apparition de caractéristiques classiques de l&#39;apoptose en développement dans une cellule qui a été adhérente ( <a href="http://www.alsa.org/research/about-als-research/cell-death-and-apoptosis.html" target="_blank">http://www.alsa.org/research/about -als-research/cell-death-and-apoptosis.html</a> ), et le nombre de cellules apoptotiques identifiés au cours de toute la durée de la formation d&#39;image ou dans des délais spécifiques enregistrés. </li><li> Au fil du temps, les cellules épithéliales en culture de modifier leur morphologie d&#39;une forme cubique initiale à un aspect plus allongé conforme aux EMT. Suivez images en série pour déterminer le jour / heure après le plaquage lorsque cela se produit. </li></ol> 5. Modification du fichier image <ol><li&gt; Grâce au logiciel Volocity, exporter les fichiers image TIFF piles. Voici automatisation Microscopie MetaMorph et logiciels d&#39;analyse d&#39;images (Molecular Devices, Sunnyvale, CA LLC) a été utilisé pour ouvrir les fichiers TIFF pile puis ils ont été enregistrés dans MetaMorph comme simples. Images JPG. </li><li> Renommez les dossiers d&#39;images et de fichiers en fonction des besoins pour le logiciel Timm outil de suivi Utilisez un programme freeware comme LE 2.1.6 Renommer ( <a href="http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml" target="_blank">http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml</a> ) pour renommer les fichiers en groupes. Créer un dossier contenant tous les dossiers et fichiers de l&#39;expérience et nommez le dossier (par exemple, </em&gt; EXPERIMENTNAME). </li><li> Créer un sous-dossier pour chaque point / position où la culture a été mis en image. Nommez les sous-dossiers: EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER. Le numéro de position doivent avoir 3 chiffres. Exemple: 072511RN_p001. Mettez tous les fichiers image de cette position individuelle dans le sous-dossier. </li><li> Ajouter le point temporel (avec 5 chiffres) et le numéro de canal (puisqu&#39;il n&#39;y a qu&#39;un seul canal à fond clair, utilisez «0») à la fin de chaque nom de fichier dans ce format: EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER_tTIMEPOINT_wCHANNELNUMBER.jpgExample: 072511RN_p001_t00001_w0.jpg </li><li> Générer un fichier journal pour chaque poste en téléchargeant d&#39;abord le programme TTTlogfileconverter gratuitement sur le site TTT. Démarrez le programme TTTlogfileconverter et sélectionnez le dossier expérience. Entrez un intervalle d&#39;image (en secondes). Pour une photo prise toutes les 15 minutes, entrez 900 sec. Puis appuyez sur le bouton vert journal clandestin fichiers. </li></ol> 6. Génération de cartes du destin cellulaire des cellules isolées à l&#39;aide TTT <ol><li> Créer un dossier appelé TTTexport et un sous-dossier appelé TTTfiles où toutes les données de suivi de cellules seront stockées selon les instructions du logiciel TTT </li><li> Démarrez le programme TTT, sélectionnez initiales de l&#39;utilisateur, puis cliquez sur &quot;Continuer&quot;. </li><li> Appuyez sur la touche &quot;Set NAS», sélectionnez l&#39;utilisateur créé &quot;TTTexport&quot; dossier et cliquez sur OK. Dans le navigateur, sélectionnez un dossier expérimentation, sélectionnez un dossier de position, puis appuyez sur &quot;position Charger&quot;. </li><li> Réglez le facteur oculaire à &quot;10x&quot;. Chargez le nombre d&#39;images requises (chargement de toutes les images est recommandé pour la première fois). </li><li> Dans la fenêtre éditeur de cellule, sélectionnez «colonie Nouveau&quot; dans le menu Fichier. Dans la fenêtre Film, appuyez sur la &quot;cellule Track&quot; ou F2 pour commencer à suivre une cellule. </li><li> Identifier une cellule de la Movie fenêtre et utiliser la souris pour placer le curseur sur la cellule. Un cercle avec le numéro de la cellule doit apparaître après F2 a été cliqué. Utilisez la touche &quot;0&quot; du pavé numérique du clavier pour suivre la mise en place de la cellule et passer à la photo suivante. Déplacez le curseur de suivre la mise en place de chaque cellule dans chaque cadre. Pour supprimer une piste et revenir à l&#39;image précédente appuyez sur &quot;Suppr&quot; sur le pavé numérique. Pour déplacer des cadres avant sans suivre la presse cellule &quot;3&quot;, et pour revenir en arrière sans suivi appuyez sur &quot;1&quot; sur le pavé numérique. </li><li> Pour marquer une division cellulaire cliquez sur la «Division» dans la fenêtre Film. Pour marquer la mort cellulaire cliquez sur le &quot;mort cellulaire&quot; dans la fenêtre Film. Une fois une division s&#39;est produite, les cellules filles peuvent être suivis dans la carte des territoires présomptifs même cellule par un clic droit sur le symbole du cercle de la cellule fille désignée dans la fenêtre de l&#39;éditeur de cellules de commencer à suivre le mode automatique. </li><li> Appuyez sur F10 pour sauvegarder l&#39;arbre. Chaque arbre permettra d&#39;économiser dans le pli de sortie désignéer (TTTExport). Pour démarrer une nouvelle cellule destinée carte, sélectionnez «colonie de la Nouvelle&quot; sous le menu &quot;Fichier&quot; puis &quot;Ouvrir&quot; dans le menu fenêtre de l&#39;éditeur Cell. </li><li> Classifier les données de durée de vie des cellules après avoir recueilli de «cellule de données&quot; onglet dans la fenêtre de l&#39;éditeur Cell. </li></ol> 7. Analyses statistiques <ol><li> Utilisez t de Student-test (si on compare deux génotypes) ou ANOVA (si comparant&gt; deux génotypes) afin de déterminer si les différences dans les données paramétriques comme le nombre de colonies de cellules initiales, les durées de vie des cellules ou des heures jusqu&#39;à l&#39;apparition d&#39;EMT entre différents génotypes sont statistiquement significative. Fréquence apoptotique peut être comparé au nombre / nombre total de cellules plaquées à l&#39;aide de Student t-test ou analyse de la variance ou de Mann-Whitney ou de Kruskal-Wallis lorsque calculée comme un pourcentage de cellules adhérentes. </li><li> Effectuer des tests de puissance en utilisant les données de l&#39;analyse des premières expériences pour déterminer combien expérimental reproduit devez effectuée et cartes du destin cellulaire générée par chaque répétition pour s adéquateSTATISTIQUES pouvoir utiliser freeware disponible (par exemple <a href="http://statpages.org/" target="_blank">http://statpages.org/</a> ). Dans les expériences présentées ici, les cultures cellulaires dérivées de trois souris par génotype étaient suffisantes pour déterminer s&#39;il y avait des différences statistiquement significatives dans la formation de colonies de cellules et la durée de vie des cellules spécifiques lorsque des modifications génétiques ont été faites. </li></ol>

<ol>
	<li>Jones, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+estrogen+signaling+pathways+collaborates+with+loss+of+Brca1+to+promote+development+of+ERalpha-negative+and+ERalpha-positive+mammary+preneoplasia+and+cancer.">Activation of estrogen signaling pathways collaborates with loss of Brca1 to promote development of ERalpha-negative and ERalpha-positive mammary preneoplasia and cancer.</a> Oncogene. 27, 794-802 (2008).</li><li>Burga, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+proliferation+and+differentiation+properties+of+primary+mammary+epithelial+cells+from+BRCA1+mutation+carriers.">Altered proliferation and differentiation properties of primary mammary epithelial cells from BRCA1 mutation carriers.</a> Cancer Res. 69, 1273-1278 (2009).</li><li>Li, M., Wagner, K., Furth, P. A., Ip, M., Asch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+primary+mammary+epithelial+cells+and+transfection+by+viral+and+nonviral+methods.">Preparation of primary mammary epithelial cells and transfection by viral and nonviral methods.</a> Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer. , (2000).</li><li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+stem-cell-driven+regeneration+in+mammals.">Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals.</a> Nature. 453, 345-351 (2008).</li><li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+single-cell+imaging+of+mammalian+stem+cells.">Long-term single-cell imaging of mammalian stem cells.</a> Nature Methods. 8, S30-S35 (2011).</li><li>Eilken, H. M., Nishikawa, S. -. I., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+single-cell+imaging+of+blood+generation+from+haemogenic+endothelium.">Continuous single-cell imaging of blood generation from haemogenic endothelium.</a> Nature. 457, 896-900 (2009).</li><li>Kokkaliaris, K. D., Loeffler, D., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+tracking+hematopoiesis+at+the+single-cell+level.">Advances in tracking hematopoiesis at the single-cell level.</a> Current opinion in hematology. , (2012).</li><li>Rieger, M. A., Hoppe, P. S., Smejkal, B. M., Eitelhuber, A. C., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+cytokines+can+instruct+lineage+choice.">Hematopoietic cytokines can instruct lineage choice.</a> Science. 325, 217-218 (2009).</li><li>Rieger, M. A., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instruction+of+lineage+choice+by+hematopoietic+cytokines.">Instruction of lineage choice by hematopoietic cytokines.</a> Cell Cycle. 8, 4019-4020 (2009).</li><li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex.">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nat. Protoc. 6, 214-228 (2011).</li></ol>

Les auteurs déclarent n&#39;avoir aucun conflit d&#39;intérêts financiers.

Les étapes critiques Il est important de veiller à ce que les glandes mammaires sont récoltées à partir des souris du même âge à contrôler la variabilité liée à l&#39;âge dans le comportement des cellules épithéliales mammaires. Lorsque l&#39;étalement des cellules, le même nombre de cellules doivent être déposées dans chaque puits pour chaque expérience. Les cellules doivent être relativement rares lorsque le placage de sorte que les cultures ne deviennent confluentes tro...

Modèles de souris génétiquement modifiées sont des outils pour étudier et comprendre comment les différentes lésions génétiques augmentent le risque de développer un cancer du sein. Par exemple, des souris génétiquement modifiées ont montré que la combinaison de trois facteurs: la perte de la poitrine pleine longueur cancer 1, l&#39;apparition précoce (BRCA1) de gènes dans les cellules épithéliales mammaires, la protéine p53 de tumeur (TP53) haplo-insuffisance de la lignée germinale, et épithéliales mammaires cellule ciblée régulation à la hausse alpha récepteurs d&#39;œstrogènes résultats d&#39;expression (EER) dans le développement du cancer mammaire chez 100% des Brca1 floxé (f) Virus 11/f11/Mouse tumeur mammaire (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator ( tet-op) -ER/MMTV-reverse tétracycline transactivateur (RTTA souris par âge de 12 mois par rapport aux pourcentages inférieurs rapportés dans Brca1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / - souris sans ERa sur-expression (~ 50 - 60%) et les souris BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre sans TP53 haploinsufcacité (&lt;5%). 1 Dynamique imagerie time-lapse de la conduite de pré-néoplasiques primaires cellules épithéliales mammaires révèle des différences dans le comportement des cellules qui sont moins facilement apprécié dans des coupes de tissus statiques. Modifications dans la prolifération et la différenciation sont observées dans les cellules mammaires primaires de l&#39;homme porteuses d&#39;une mutation du gène BRCA1. 2 Création d&#39;une seule cellule suspensions primaires de cellules épithéliales mammaires à la normale et des souris génétiquement modifiées sont générés par dissociation enzymatique du tissu réséqué glande mammaire. 3 Time-lapse les images sont vues à évaluer mécanisme de synchronisation et de l&#39;apparence colonie de cellules et l&#39;incidence des modifications morphologiques dans les cellules y compris transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) et l&#39;apoptose. Génération de cartes du destin cellulaire, la quantification de la longueur de temps entre les divisions cellulaires (durée de vie des cellules), et la détermination des modes de division cellulaire sont facilitées par l&#39;utilisation d&#39;une seule cellule de suivi. TimmOutil de suivi de l &#39;(TTT) est un logiciel disponible publiquement utilisé pour générer des cartes destin unicellulaires. Son utilité dans la compréhension des mécanismes de destin cellulaire a été établi 4,5 examiner le développement normal de cellules souches hématopoïétiques 6-9 et la génération de neurones. 10

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> EpiCult-B Souris Basal Medium </td><td> StemCell Technologies </td><td> 05610 </td><td></td></tr><tr><td> EpiCult-prolifération B Suppléments souris </td><td> StemCell Technologies </td><td> 05612 </td><td></td></tr><tr><td> recombinante du facteur de croissance épidermique humain (rhEGF) </td><td> StemCell Technologies </td><td> 02633 </td><td></td></tr><tr><td> Collagénase / hyaluronidase </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07912 </td><td></td></tr><tr><td> Scapels jetables </td><td> Plume </td><td> 2975 # 10 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks Balanced Salt Solution </td><td> StemCell Technologies </td><td> 37150 </td><td></td></tr><tr><td> AChlorure mmonium </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07800 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine-EDTA </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07901 </td><td></td></tr><tr><td> Dispase </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07913 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07900 </td><td></td></tr><tr><td> 40 um tamis cellulaire </td><td> StemCell Technologies </td><td> 27305 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> StemCell Technologies </td><td> 06100 </td><td></td></tr><tr><td> Penstrep </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr></tbody></table>

time-lapse imaging of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer

En accéléré d&#39;imagerie peut être utilisé pour comparer le comportement de culture primaire des cellules épithéliales mammaires néoplasiques provenant de différents modèles de souris transgéniques de cancer du sein. Par exemple, le temps entre les divisions cellulaires (durée de vie des cellules), le nombre de cellules apoptotiques, l&#39;évolution des changements morphologiques, et le mécanisme de formation de colonies peuvent être quantifiés et comparés dans les cellules portant lésions génétiques spécifiques. Primaires de cellules épithéliales mammaires cultures sont produites par les glandes mammaires sans tumeur palpable. Glandes sont soigneusement réséquée avec une séparation claire de muscle adjacent, les ganglions lymphatiques sont enlevés, et les suspensions monocellulaires de cellules épithéliales mammaires enrichis sont générées par hachage tissu mammaire suivie par dissociation enzymatique et filtration. Simple suspensions de cellules sont ensemencées et placé directement sous un microscope dans une chambre d&#39;incubation pour imagerie des cellules vivantes. Seize 650 um um champs x 700 dans une configuration 4x4 de chaque well d&#39;une plaque à 6 puits sont imagés toutes les 15 minutes pendant 5 jours. Time-lapse images sont directement examinés pour mesurer les comportements cellulaires qui peuvent inclure des mécanismes et la fréquence de la formation de colonies de cellules dans les 24 premières heures d&#39;étalement des cellules (agrégation contre la prolifération des cellules), l&#39;incidence de l&#39;apoptose, et l&#39;échelonnement des changements morphologiques. Une seule cellule de suivi est utilisé pour générer des cartes du destin cellulaire pour la mesure de la durée de vie des cellules individuelles et les enquêtes sur les modèles de division cellulaire. Les données quantitatives sont analysées statistiquement pour évaluer des différences significatives dans le comportement en corrélation avec lésions génétiques spécifiques.

Les cellules épithéliales et fibroblastes peuvent être distingués par la morphologie des cellules. Les cellules épithéliales ont une forme parallélépipédique (figure 1A-B) et forment des colonies de cellules (figure 1A). Fibroblastes, un type de cellules stromales, ont une morphologie allongée (figure 1C). Les cellules ont été arrondies et flottant à l&#39;apparition de l&#39;imagerie (figure 2A-D). Après la fi...

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Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Imagerie time-lapse est utilisé pour évaluer le comportement des principaux pré-néoplasiques des cellules épithéliales mammaires issues de modèles de souris génétiquement modifiées de risque de cancer du sein afin de déterminer s&#39;il existe des corrélations entre certains paramètres comportementaux et génétiques distinctes des lésions.

Imagerie time-lapse de primaires prénéoplasiques cellules épithéliales mammaires issues de modèles de souris génétiquement modifiées de cancer du sein

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

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