Die Autoren möchten Bofan Wu und Christian Raithel für technische Hilfe und Michael Rieger herzlich für seine Einführung in die Live-Cell-Imaging. Unterstützt durch NCI, NIH RO1CA112176 (PAF), NCI, NIH. R01CA89041-10S1 (PAF), Deutscher Akademischer Austaush Dienst eV A/09/72227 Ref. 316 (REN), Department of Defense W81XWH-11-1-0074 (REN), WCU (World Class University) Programm durch die National Research Foundation of Korea durch das Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Technologie (R31-10069) finanziert (PAF ), NIH IG20 RR025828-01 (Rodent Barrier Einrichtung Equipment) und NIH NCI 5P30CA051008 (Mikroskopie und Imaging and Animal Freigegebene Ressourcen).

<html> Ein. Insgesamt Scheme <ol><li> Generieren Primärkulturen von präneoplastischen Brustepithelzellen aus Brustdrüsen von gentechnisch hergestellten und zu steuern Wildtyp-Mäusen. </li><li> Nehmen Sie live-cell Bilder alle 15 min mit Volocity Bildaufnahme-Software (Version 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA) für bis zu 5 Tagen. </li><li> Erfahren Zeitraffer-Bilder direkt auf Timing und den Mechanismus der Epithelzelle Koloniebildung, Auftreten von Apoptose und Auslaufen von morphologischen Veränderungen beurteilen. </li><li> Konvertieren Volocity generiert. TIFF Stacks. JPG-Dateien mit MetaMorph Microscopy Automation &amp; Image Analysis Software (Molecular Devices, LLC Sunnyvale, CA) und rename digitalen Bilddateien (THE Rename 2.1.6, <a href="http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml" target="_blank">http://www.softpedia.com/get / System / File-Management / THE-Rename.shtml</a> ), um die Kompatibilität mit Tracking Tool Timm-Software (TTT,tz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index.html &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://www.helmholtz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index. html). </li><li> Mit TTT erzeugen Zellschicksals Karten für die Ermittlung der Zeit zwischen Zellteilungen (Zelle Lebensdauer) und Muster der Zellteilung (symmetrischen gegenüber asymmetrischen). </li><li> Analysieren quantitative Daten aus den Stufen 3 und 5, um festzustellen, ob statistisch signifikante Unterschiede zwischen verschiedenen Mausmodellen gentechnisch und / oder Wildtyp-Steuerelemente sind. </li></ol> 2. Generation of Primary Brustepithelzellen Zellkulturen <ol><li> Bereiten Komplette Medien zur Isolierung von einzelnen Brustepithelzellen nach einer Variation des Herstellers (EpiCult-B Maus Medium Kit, Stemcell Technologies, Vancouver, BC). Kombinieren Sie 450 ml Epi-Cult-B-Medium, 50 ml Epi-Cult B Verbreitung Ergänzung, 5% Fetal Bovine Serum (FBS), 50 ug / ml Penicillin / Streptomycin (PenStrep) und 10 ng / ml Epidermal Growth Factor (EGF). </li><li> Bereiten Dissoziation Medien durch die Kombination von 1 Teil eines 10x Collagenase / Hyaluronidase Mischung mit 9 Teilen Komplett Media von 2,1. </li><li> Einschläfern Maus und sofort zur seziert. Bewegen Sie die Maus auf dem Rücken auf einem Styropor-Autopsie-Plattform und sichern Sie alle vier Gliedmaßen so ventrale Haut ist straff. Sättigen ventralen Haut und Haar, einschließlich, dass die über den Gliedern, mit 70% Ethanol. Expose # 2/3 (Thorax) und # 4/5 (inguinal) Brustdrüsen, indem Sie einen Medianschnitt durch die Haut (nicht in das Bauchfell), die in einer Y-Schnitt durch die mediale Haut jedes vorderen Gliedmaßen und wird verlängert eine umgedrehte Y Schnitt durch die mediale Haut jedes hinteren Extremität. </li><li> Mit stumpf, trennen die Haut vor underlyingperitoneum, ziehen wieder auf beiden Seiten der Haut, bis es gespannt ist, und befestigen Sie es an den Styropor-Sektion Plattform mit Pins. Ausgehend von der Außenseite, verwenden Sie stumpfe Dissektion mit gezielten Einsatz von dissection Schere zu isolieren die intakte inguinal und / oder Thorax Milchdrüsen aus den zugrunde liegenden Bindegewebe und Muskulatur. Nicht mehr als zwei Milchdrüsen in einem 10 cm sterile Petrischale und zu bewegen, um Gewebekultur Kapuze. </li><li> In Gewebekulturen Kapuze, untersuchen Verschraubungen für Mamma Lymphknoten, die als kleine, gut abgegrenzte Knötchen mit einer gelblichen Farbe identifiziert werden. Entfernen Lymphknoten aus der umgebenden Drüse mit sterilen Skalpell und Pinzette. Mince Brustgewebe in ~ 1 mm 3 Würfel mit zwei sterilen Skalpellen, ein in jeder Hand. </li><li> Ort zerkleinert Brustgewebe in 5 ml Dissoziation Media, Mischung durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren 2-3 mal mit einer 10 ml Pipette, und über Nacht (bis zu ~ 16 h) in einem 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2 in einem 50 ml konischen Röhrchen mit gelockerten Kappe. </li><li> Am nächsten Morgen, bereiten eine kalte Mischung aus Balanced Salt 1 Teil Hanks &#39;Solution (HBSS) mit 2% FBS und 4 Teilen gepufferte Ammoniumchloridlösung auf rot bl fördernood Zelllyse (HFAmCl) sowie kaltem HBSS mit 2% FBS (HF) ergänzt. Pre-warm Trypsin-EDTA (0,25%), Modified 5 mg / ml Dispase in Balanced Salt Hank-Lösung, 1 mg / ml DNase I und Complete Media. </li><li> Nehmen Sie die konische Zentrifugenröhrchen mit dem Brustgewebe aus dem Inkubator und sanft pulsieren Vortex 2-3 sec zweimal. Zentrifugieren bei 450 × g für 5 min (Raumtemperatur oder 4 ° C) und den Überstand verwerfen. </li><li> Das Pellet in einem Minimum von 10 ml HFAmCl und Zentrifuge bei 450 × g für 5 min (Raumtemperatur oder 4 ° C) und Überstand verwerfen. </li><li> 3 ml Trypsin-EDTA zu dem Pellet und mischen zuerst mit einer 5 ml-Pipette und dann mit einer Mikropipette bis P1000 fadenziehend (1-3 min). 10 ml HF, Zentrifuge bei 450 × g für 5 min (Raumtemperatur oder 4 ° C) und Überstand verwerfen. </li><li> 2 ml 5 mg / ml Dispase und 200 ul 1 mg / ml DNase I zu dem Pellet und mischen mit einem P1000 Mikropipette für 1 min. Die Probe sollte clo werdenudy aber nicht faserig. Wenn sehnig, mit 100 ul von DNase I und nochmals mischen. </li><li> 10 ml kaltem HF, Belastung durch ein 40 um Zellsieb und Zentrifuge bei 450 × g für 5 min (Raumtemperatur oder 4 ° C) und Überstand verwerfen. </li><li> Resuspendieren Endpellet in Complete Media. Quantifizierung der Gesamtzahl der Zellen (unter Verwendung eines Hämozytometers oder Coulter Counter). Zwei Milchdrüsen die ungefähr 1 x 10 6 bis 1 x 10 7 Zellen. Platte primären Epithelzellen in einem flachem Boden 6-Well-Platte mit einer Dichte von 1,5 x 10 5 Zellen pro Vertiefung. </li></ol> 3. Live-cell Imaging <ol><li> Unmittelbar nach Ausplattieren der Zellen, platzieren Sie den 6-Well-Platte sicher auf einem Mikroskoptisch in einem 5% CO 2 / gesättigte humidity/37 ° C Temperatur Inkubationskammer. Stellen Sie den Kondensator für Kohler Beleuchtung und in der Mitte die Phase Ringe. Für die Experimente hier vorgestellten Spinning eine invertierte Nikon Eclipse TE300/PerkinElmer Disc KonfokaleMikroskop-System in Weitfeld Phasenkontrast-Modus mit einem 10x Objektiv verwendet wurde. </li><li> Offene Bildaufnahme-Software, erstellen und benennen eine Bibliothek für die Zeitraffer-Aufnahmen, und speichern Sie an einen Ort mit ausreichend Platz für große Dateien. Die Experimente hier vorgestellten genutzt Volocity Bildaufnahme-Software (Version 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA). </li><li> Damit die Platte im Mikroskop Inkubator für mindestens 15 min sich ausgleichen lassen. Senken Sie die Linsen auf die Bühne-lens Interferenzen zu vermeiden. Unter der &quot;Stage&quot; Überschrift, wählen Sie &quot;Kalibrieren Bühne.&quot; Rückkauf der Fokalebene, Set Z = Null unter den x, y, z Registerkarte und markieren Bildgebung Punkten durch Auswahl von &quot;Add point&quot; im Rahmen der &quot;Stage&quot; Überschrift. Platz Punkte in der Mitte jeder Vertiefung der Platte mit 6 Vertiefungen als zur Abbildung der Phasenkontrast-Abbildung kann in der Nähe der Peripherie des Kunststoffvertiefungen verzerrt. Vereinbaren Punkten auf einem Platz in 4 x 4 Felder (650 um x 700 um Felder), die jeweils mit einer kleinen Überlappung (ca. 5%). Speichern Sie die ausgewählten Punkte unter &quot;Stage &quot;. </li><li> Unter &quot;Stage&quot; &quot;Make Fokus map&quot; und folgen Sie den Anweisungen, um den Fokus von jedem Punkt zu setzen. Set Bildaufnahme Timing zu 4 Bilder pro Stunde (alle 15 min) zu erfassen. Dies kann eingestellt abhängig von den Anforderungen der spezifischen Experiment werden. Speichern Sie die Fokus-Karte unter &quot;Stage&quot;. </li><li> Rechts auf der rechten Seite tool bar &quot;Image Acquisition&quot; klicken und speichern Sie die Bildeinstellungen. Drücken Sie die Aufnahmetaste, um die Abbildung zu beginnen. Nach 1 Stunde, überprüfen Sie den Fokus der Bilder, um zu sehen, ob eine Anpassung erforderlich ist. </li><li> Überwachen und weiterhin Live-Bildgebung für 5 Tage und endet, wenn die Zellen konfluent geworden. </li></ol> 4. Direkte Anzeige von Zeitraffer-Aufnahmen, um Timing und Mechanismus der Initial Epithelial Cell Colony Formation, Inzidenz von Apoptose, und Phasing von morphologischen Veränderungen zu beurteilen <ol><li> Direkte Anzeige von Zeitraffer-Aufnahmen kann die Durchführung mit einem kompatiblen Video-Wiedergabe-Software (zB <a href="http://www.real.com/" target="_blank">http:</a>/ / Www.real.com/ realplayer oder andere Freeware oder kommerziell erhältliche Software). Bilder können in der. TIFF-Format bei diesem Schritt oder nach der Umstellung auf. JPG-Dateien (siehe Schritt 5) eingesehen werden. </li><li> Mechanismus zur anfänglichen Koloniebildung zu bestimmen, mit einer ein-Bildstapels repräsentiert ein Abbildungsstelle auf der Platte zu beginnen. In ersten Frames werden Zellen zu schweben. Folgen seriellen Bilder, um zu bestimmen, wenn der erste Epithelzelle haftet an der Platte. Bei diesem Schritt kann Epithelzellen identifiziert und differenziert von Fibroblasten durch ihren mehreren quaderförmigen Morphologie. Folgen Sie dieser einzelnen Epithelzellen über serielle Bilder und folgen ihr Schicksal über die folgenden 24 Stunden. Aufnehmen, wenn es wird umgeben von zusätzlichen Epithelzellen oder erfährt Zellteilung oder Apoptose. Wenn von Epithelzellen umgeben, kann der Mechanismus der Koloniebildung durch Betrachten direkt bestimmt werden, wenn die umgebenden Zellen aus schwimmenden Zellen, die dann mit der anhaftenden ersten Zelle (n) oder aggregieren abgeleitetaus der Division des ersten adhärenten Zellen. Notieren Sie die Anzahl der Kolonien durch Zellaggregation gegenüber Zellteilung während der ersten 24 Stunden gebildet. </li><li> Um die Anzahl der anfänglich adhärenten Zellen, die Apoptose durchlaufen über einen bestimmten Zeitraum zu bestimmen, gehen seriellen Bilder für das Aussehen von klassischen Merkmale der Apoptose in einer Zelle die Entwicklung, die bereits adhärenten hat ( <a href="http://www.alsa.org/research/about-als-research/cell-death-and-apoptosis.html" target="_blank">http://www.alsa.org/research/about -als-research/cell-death-and-apoptosis.html</a> ), und die Anzahl der apoptotischen Zellen während der ganzen Dauer der Bildgebung oder in bestimmten Zeitfenstern identifiziert aufgezeichnet. </li><li> Im Laufe der Zeit verändern Epithelzellen in Kultur ihre Morphologie von einer Anfangsposition zu einer Quaderform mehrere längliche Erscheinungsbild konsistent mit EMT. Folgen seriellen Bilder, um die Tag / Stunde nach der Beschichtung bestimmen, wann dies geschieht. </li></ol> 5. Image File Modification <ol><li&gt; Durch die Volocity Software, exportieren Sie die Bilddateien in das TIFF-Stacks. Hier MetaMorph Microscopy Automation &amp; Image Analysis Software (Molecular Devices, LLC Sunnyvale, CA) wurde verwendet, um die TIFF-Stack-Dateien zu öffnen und sie wurden dann in MetaMorph als Single. JPG-Bilder gespeichert. </li><li> Benennen Sie die Bild Ordner und Dateien gemäß den Anforderungen für Tracking Tool Timm-Software Verwenden Sie ein Freeware-Programm wie THE Rename 2.1.6 ( <a href="http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml" target="_blank">http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml</a> ), um Dateien in Gruppen umbenennen. Erstellen Sie einen Ordner mit allen Ordnern und Dateien des Experiments und nennen Sie den Ordner (z. B. </em&gt; EXPERIMENTNAME). </li><li> Erstellen Sie einen Unterordner für jeden Punkt / Position, wo die Kultur wurde abgebildet. Benennen Sie die Unterordner: EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER. Die Positionsnummer sollten 3-stellig. Beispiel: 072511RN_p001. Legen Sie alle Bilddateien dieser einzelnen Position in den Unterordner. </li><li> Fügen Sie den Zeitpunkt (mit 5 Ziffern) und Kanalnummer (da es nur ein Hellfeldkanal, verwenden Sie &quot;0&quot;) am Ende des Dateinamens in diesem Format: EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER_tTIMEPOINT_wCHANNELNUMBER.jpgExample: 072511RN_p001_t00001_w0.jpg </li><li> Generieren Sie eine Protokolldatei für jede Position, indem Sie zuerst den Download der kostenlosen Programm TTTlogfileconverter aus dem TTT Website. Starten Sie den TTTlogfileconverter Programm und wählen Sie das Experiment Ordner. Eingang ein Bild Intervall (in Sekunden). Für ein Bild gemacht alle 15 min, geben Sie 900 sec. Dann drücken Sie die grüne verdeckte Protokolldateien Taste. </li></ol> 6. Generation of Cell Fate Karten von Einzelzellen mit TTT <ol><li> Create einen Ordner namens TTTexport und ein Unterordner mit dem Namen TTTfiles wo alle Zellen Tracking-Daten nach TTT Software-Anweisungen gespeichert werden </li><li> Starten Sie das TTT-Programm, wählen Sie den Benutzer Initialen, und klicken Sie auf &quot;Weiter&quot;. </li><li> Drücken Sie die &quot;Set NAS&quot;, wählen Sie den Benutzer erstellt &quot;TTTexport&quot;-Ordner, und klicken Sie auf Ok. In den Browser, wählen Sie ein Experiment Ordner, wählen Sie eine Position Ordner, und drücken Sie dann &quot;Load Position&quot;-Taste. </li><li> Set okuläre Faktor &quot;10x&quot;. Legen Sie die Anzahl der Bilder erforderlich (Laden aller Bilder wird zum ersten Mal empfohlen). </li><li> In Zell-Editor-Fenster, wählen Sie &quot;New Kolonie&quot; im Datei-Menü. Im Filmfenster, drücken Sie die &quot;Track Zelle&quot; oder F2 zu beginnen Verfolgung einer Zelle. </li><li> Identifizieren einer Zelle, in der Movie Fenster und verwenden Sie die Maus, um den Cursor über die Zelle zu platzieren. Ein Kreis mit der Anzahl der Zelle erscheinen soll nach F2 geklickt wurde. Verwenden Sie die Taste &quot;0&quot; auf dem Ziffernblock der Tastatur, um die Platzierung der Zelle und zum nächsten Bild zu verfolgen. Bewegen Sie den Cursor, um die Platzierung der einzelnen Zelle durch jeden Frame folgen. Um einen Titel zu löschen und zum vorherigen Bild drücken &quot;Entf&quot; auf dem Ziffernblock. Um vorwärts Frames ohne Tracking die Zelle Presse zu bewegen &quot;3&quot; und rückwärts zu bewegen, ohne Tracking press &quot;1&quot; auf dem Ziffernblock. </li><li> So markieren Sie eine Zellteilung auf die &quot;Division&quot; in der Movie-Fenster. Zum Zelltod markieren klicken Sie auf den &quot;Cell death&quot;-Taste im Filmfenster. Sobald eine Division aufgetreten ist, können die Tochterzellen in der gleichen Zelle Schicksal Karte mit der rechten Maustaste auf den Kreis Symbol der benannten Tochter Zelle in der Zelle Editor-Fenster, um das Tracking automatisch verfolgt werden. </li><li> Drücken Sie F10, um den Baum zu retten. Jeder Baum wird in den dafür vorgesehenen Ausgang fach sparener (TTTExport). Um eine neue Zellschicksals Karte zu starten, wählen Sie &quot;Neu Kolonie&quot; im &quot;Datei&quot; und dann auf &quot;Öffnen&quot;-Menü in der Zelle Editor-Fenster. </li><li> Tabellieren Zelle Lebensdauer von Daten nach dem Sammeln von &quot;Cell Daten&quot; in der Zelle Editor-Fenster. </li></ol> 7. Statistische Analysen <ol><li> Verwenden Sie entweder Student-t-Test (falls Vergleich zweier Genotypen) oder ANOVA (beim Vergleich&gt; beiden Genotypen), um festzustellen, ob Unterschiede in der parametrischen Daten wie Anzahl der ersten Zellkolonien, Zell-Lebensdauer oder Stunden bis zum Erscheinen des EMT zwischen verschiedenen Genotypen sind statistisch signifikant. Apoptotische Frequenz kann als die Anzahl / Gesamtzahl plattierten Zellen unter Verwendung des Student-t-Test oder ANOVA oder mit Mann-Whitney oder Kruskal-Wallis als Prozentsatz von adhärenten Zellen abgeleiteten verglichen werden. </li><li> Leistungsmessung Tests unter Verwendung von Daten aus Analysen der anfänglichen Experimenten zu bestimmen, wie viele experimentelle repliziert müssen durchgeführt und das Schicksal der Zelle Karten aus jeder Wiederholung generiert für eine angemessene sTATISTISCHE Leistung anhand der verfügbaren Freeware (zB <a href="http://statpages.org/" target="_blank">http://statpages.org/</a> ). In den Experimenten hier vorgestellten wurden Zellkulturen von drei Mäusen pro Genotyp abgeleitet ausreichend, um festzustellen, ob es statistisch signifikanten Unterschiede in der Zelle und Zelle Koloniebildung Lebensdauern wenn spezifische genetische Modifikationen vorgenommen wurden. </li></ol>

<ol>
	<li>Jones, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+estrogen+signaling+pathways+collaborates+with+loss+of+Brca1+to+promote+development+of+ERalpha-negative+and+ERalpha-positive+mammary+preneoplasia+and+cancer.">Activation of estrogen signaling pathways collaborates with loss of Brca1 to promote development of ERalpha-negative and ERalpha-positive mammary preneoplasia and cancer.</a> Oncogene. 27, 794-802 (2008).</li><li>Burga, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+proliferation+and+differentiation+properties+of+primary+mammary+epithelial+cells+from+BRCA1+mutation+carriers.">Altered proliferation and differentiation properties of primary mammary epithelial cells from BRCA1 mutation carriers.</a> Cancer Res. 69, 1273-1278 (2009).</li><li>Li, M., Wagner, K., Furth, P. A., Ip, M., Asch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+primary+mammary+epithelial+cells+and+transfection+by+viral+and+nonviral+methods.">Preparation of primary mammary epithelial cells and transfection by viral and nonviral methods.</a> Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer. , (2000).</li><li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+stem-cell-driven+regeneration+in+mammals.">Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals.</a> Nature. 453, 345-351 (2008).</li><li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+single-cell+imaging+of+mammalian+stem+cells.">Long-term single-cell imaging of mammalian stem cells.</a> Nature Methods. 8, S30-S35 (2011).</li><li>Eilken, H. M., Nishikawa, S. -. I., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+single-cell+imaging+of+blood+generation+from+haemogenic+endothelium.">Continuous single-cell imaging of blood generation from haemogenic endothelium.</a> Nature. 457, 896-900 (2009).</li><li>Kokkaliaris, K. D., Loeffler, D., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+tracking+hematopoiesis+at+the+single-cell+level.">Advances in tracking hematopoiesis at the single-cell level.</a> Current opinion in hematology. , (2012).</li><li>Rieger, M. A., Hoppe, P. S., Smejkal, B. M., Eitelhuber, A. C., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+cytokines+can+instruct+lineage+choice.">Hematopoietic cytokines can instruct lineage choice.</a> Science. 325, 217-218 (2009).</li><li>Rieger, M. A., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instruction+of+lineage+choice+by+hematopoietic+cytokines.">Instruction of lineage choice by hematopoietic cytokines.</a> Cell Cycle. 8, 4019-4020 (2009).</li><li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex.">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nat. Protoc. 6, 214-228 (2011).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Kritische Schritte Es ist wichtig sicherzustellen, dass Brustdrüsen von Mäusen des gleichen Alters für altersbedingte Variabilität Brustepithelzellen Zellverhalten steuern geerntet. Wenn Ausplattieren der Zellen, sollte die gleiche Anzahl an Zellen in jeder Vertiefung zu jedem Experiment plattiert werden. Zellen sollten relativ spärlichen beim Plattieren, so dass Kulturen nicht zu schnell konfluieren die es ermöglichen, mehrere einzelne Zellen durch serielle Bilder folgen. Es ist wichtig,...

Gentechnisch veränderte Mausmodelle sind Werkzeuge, um zu studieren und zu verstehen, wie verschiedene genetische Läsionen das Risiko an Brustkrebs zu erkranken beitragen. Beispielsweise wurden gentechnisch Mäusen gezeigt, dass die Kombination von drei Faktoren ab: Verlust des Volllängen-Brustkrebs 1, früher Ausbruch (BRCA1) Gens in Brustepithelzellen, Tumor Protein p53 (TP53) Keimbahn Haploinsuffizienz und Brustepithelzellen Zelle gezielt hochreguliert Östrogenrezeptor alpha (ERa) Expression zur Entwicklung von Brustkrebs in 100% der BRCA1 floxed (f) 11/f11/Mouse Mammary Tumor Virus (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator ( Tet-op) -ER/MMTV-reverse Tetracyclin-Transaktivator (rtTA Mäusen durch Alter von 12 Monaten im Vergleich zu den niedrigeren Prozentsätzen in BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 berichteten + / - Mäuse ohne ERa Überexpression (~ 50 - 60%) und BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre Mäuse ohne TP53 haploinsufenz (&lt;5%). 1 Dynamische Zeitraffer-Bildgebung des Verhaltens von präneoplastischen primäre Brustepithelzellen zeigt Unterschiede in Zellverhalten, die weniger leicht in statischen Gewebeschnitte sind erwünscht. Änderungen in der Proliferation und Differenzierung in der primären Mamma-Zellen aus menschlichen BRCA1-Mutation Träger beobachtet. 2 Erstellung von Einzel-Zell-Suspensionen von primären Brustepithelzellen von normalen und gentechnisch veränderten Mäusen durch enzymatische Dissoziation von resezierten Brustdrüsengewebe generiert werden. 3 Zeitraffer Bilder betrachtet werden, um den Mechanismus und den Zeitpunkt der Zellkolonie Aussehen und Auftreten von morphologischen Veränderungen in Zellen, einschließlich epithelial-mesenchymale Transition (EMT) und Apoptose zu beurteilen. Erzeugung Zellschicksals Karten werden Quantifizierung der Länge der Zeit zwischen Zellteilungen (Zelle Lebensdauern), und Bestimmung von Mustern der Zellteilung durch Verwendung von Single-Cell-Tracking erleichtert. Timm&#39;S Tracking Tool (TTT) ist öffentlich verfügbaren Software verwendet, um einzelne Zellen Schicksal Karten zu erzeugen. Ihre Nutzbarkeit in der Aufklärung der Mechanismen Zellschicksals wurde festgestellt 4,5 Prüfung normalen hämatopoetischen Stammzelle Entwicklung 6-9 und die Erzeugung von Neuronen. 10

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> EpiCult-B Basal Medium Maus </td><td> StemCell Technologies </td><td> 05610 </td><td></td></tr><tr><td> EpiCult-B Proliferation Supplements Maus </td><td> StemCell Technologies </td><td> 05612 </td><td></td></tr><tr><td> rekombinanten humanen Epidermal Growth Factor (rhEGF) </td><td> StemCell Technologies </td><td> 02633 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase / Hyaluronidase </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07912 </td><td></td></tr><tr><td> Disposable Scapels </td><td> Feder </td><td> 2975 # 10 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks &#39;Balanced Salt Solution </td><td> StemCell Technologies </td><td> 37150 </td><td></td></tr><tr><td> Ammonium Chloride </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07800 </td><td></td></tr><tr><td> Tryspin-EDTA </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07901 </td><td></td></tr><tr><td> Dispase </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07913 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07900 </td><td></td></tr><tr><td> 40 um Zellsieb </td><td> StemCell Technologies </td><td> 27305 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> StemCell Technologies </td><td> 06100 </td><td></td></tr><tr><td> PenStrep </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr></tbody></table>

time-lapse imaging of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer

Zeitraffer-Aufnahmen verwendet werden, um das Verhalten von kultivierten primären präneoplastischen Brustepithelzellen aus verschiedenen gentechnisch veränderten Mausmodellen von Brustkrebs ableiten zu vergleichen. Zum Beispiel kann zwischen Zellteilungen (Zelle Lebensdauern), apoptotischen Zellzahlen, Evolution von morphologischen Veränderungen, und der Mechanismus der Koloniebildung quantifiziert und verglichen werden Zellen, die spezifische genetische Läsionen. Primäre Brustepithelzellen Zellkulturen aus Milchdrüsen ohne tastbaren Tumor erzeugt. Drüsen sorgfältig mit klare Trennung von angrenzenden Muskels reseziert werden Lymphknoten entfernt, und Einzelzellsuspensionen von angereichertem Brustepithelzellen werden durch Zerkleinern Brustgewebe durch enzymatische Dissoziation und anschließender Filtration erzeugt. Single-Zellsuspensionen ausplattiert und direkt unter dem Mikroskop platziert innerhalb einer Inkubatorkammer für Live-Cell-Imaging. Sixteen 650 um x 700 um Felder in einer 4x4-Konfiguration von jedem well einer 6-Well-Platte werden alle 15 min 5 Tage lang abgebildet. Zeitraffer-Bilder untersucht direkt an zellulären Mechanismus Verhaltensweisen, und die Häufigkeit der Zellkolonie Bildung innerhalb der ersten 24 Stunden der Ausplattieren der Zellen (Aggregation gegenüber Zellproliferation), Auftreten von Apoptose und Auslaufen von morphologischen Veränderungen gehören zu messen. Single-cell-Tracking wird verwendet, um das Schicksal der Zelle Karten für die Messung der einzelnen Zelle Lebensdauer und Untersuchung der Zellteilung Muster zu erzeugen. Quantitative Daten werden statistisch ausgewertet, um auf signifikante Unterschiede im Verhalten mit spezifischen genetischen Läsionen korreliert beurteilen.

Epitheliale und Fibroblasten-Zellen können durch Zellmorphologie unterscheiden. Epithelialen Zellen eine Quaderform (1A-B) und Form Zellkolonien (1A). Fibroblasten, eine Art von Stromazellen, eine längliche Morphologie (Abbildung 1C). Zellen wurden gerundet und schweben zu Beginn der Bildgebung (2A-D). Nach der Befestigung an der Platte wurden sie flach und zeigte eine quaderförmige-Typ Aussehen (2E, H). ...

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Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Zeitraffer-Bildgebung verwendet wird, um das Verhalten von primären präneoplastischen Brustepithelzellen aus gentechnisch veränderten Mausmodellen Brustkrebsrisiko abgeleitet, um zu bestimmen, ob es Korrelationen zwischen spezifischen Verhaltensparametern und unterschiedlichen genetischen Läsionen sind beurteilen.

Zeitraffer-Imaging of Primary Präkanzeröse Brustepithelzellen aus gentechnisch veränderten Mausmodellen der Breast Cancer Abgeleitet

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

11.7K Aufrufe.  Georgetown University. Zeitraffer-Bildgebung verwendet wird, um das Verhalten von primären präneoplastischen Brustepithelzellen aus gentechnisch veränderten Mausmodellen Brustkrebsrisiko abgeleitet, um zu bestimmen, ob es Korrelationen zwischen spezifischen Verhaltensparametern und unterschiedlichen genetischen Läsionen sind beurteilen.