Dieses Protokoll bietet eine Methode, um die molekularen Kräfte abzubilden, die von Zellen und insbesondere von Immunzellen erzeugt werden. Das Protokoll ist von entscheidender Bedeutung für Labore, die an der Untersuchung der Mechanotransduktion in der Mechanobiologie interessiert sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie sehr einfach ist und es ermöglicht, die konventionelle Fluoreszenzmikroskopie zu verwenden, um die Kraftübertragung in immortalisierten und primären Zellen zu quantifizieren.
Legen Sie zunächst 25-Millimeter-Deckgläser in ein Polytetrafluorethylen-Gestell in einem 50-Milliliter-Becherglas und spülen Sie die Deckgläser dreimal ab, indem Sie sie in Wasser tauchen. Mischen Sie Ethanol und Wasser zu gleichen Teilen und geben Sie 40 Milliliter dieser Lösung in das Becherglas mit dem Gestell und den Deckgläsern. Verschließen Sie dann das Becherglas mit Parafilmband.
Reinigen Sie die Deckgläser, indem Sie das Becherglas 15 Minuten lang in einem Ultraschallreiniger beschallen und die Flüssigkeit nach der Beschallung entsorgen. Spülen Sie dann das Becherglas mit dem Rost und den Deckgläsern mindestens sechsmal mit Wasser aus, um verbleibende organische Lösungsmittel zu entfernen. Um eine frische Piranha-Lösung zuzubereiten, geben Sie 30 Milliliter Schwefelsäure in ein 50-Milliliter-Becherglas und fügen Sie langsam 10 Milliliter Wasserstoffperoxid hinzu.
Mischen Sie die Piranha-Lösung vorsichtig mit dem Ende einer Glaspipette. Um mit dem Ätzen zu beginnen, geben Sie das Gestell mit den Deckgläsern in das Becherglas mit der Piranha-Lösung und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Deckgläser zu reinigen und zu hydroxylieren. Übertragen Sie dann das Gestell mit einer Pinzette aus Stahl oder Polytetrafluorethylen in ein sauberes 50-Milliliter-Becherglas und spülen Sie es sechsmal mit Wasser ab.
Um das Wasser vollständig zu entfernen, tauchen Sie das Gestell mit den Deckgläsern in ein 50-Milliliter-Becherglas mit 40 Milliliter Ethanol. Entsorgen Sie dann das Ethanol. Tauchen Sie das Gestell anschließend eine Stunde lang bei Raumtemperatur in 40 Milliliter Ethanol mit 3 % Aminopropyltriethoxysilan, um die Reaktion mit der Hydroxylgruppe auf den Deckgläsern einzuleiten.
Spülen Sie die Oberfläche der Deckgläser sechsmal ab, indem Sie sie in 40 Milliliter Ethanol tauchen, und trocknen Sie sie 20 Minuten lang in einem Ofen bei 80 Grad Celsius. Decken Sie den inneren Boden der Petrischale mit einem Parafilmband ab, um zu verhindern, dass die Deckgläser in die Petrischale rutschen. Legen Sie dann die aminbedeckten Deckgläser mit der zu funktionalisierenden Seite mit DNA-Zugsonden nach oben.
Decken Sie die Deckgläser für die spätere Verwendung bei 20 Grad Celsius ab. Um die Amingruppen auf den Deckgläsern zu modifizieren, fügen Sie Liponsäure PEG NHS und mPEG NHS hinzu und inkubieren Sie die Petrischale eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Spülen Sie die Oberfläche am Ende der Inkubation dreimal mit Wasser ab.
Danach werden 100 Mikroliter 0,1 molaren Natriumbicarbonat, das ein Milligramm pro Milliliter Sulfo-NHS-Acetat enthält, in einen Satz Sandwichdeckgläser gegeben und 30 Minuten lang inkubiert, damit die Passivierung stattfinden kann. Geben Sie 0,5 Milliliter Goldnanopartikel in jedes Deckglas und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Spülen Sie die Deckgläser nach der Inkubation dreimal mit Wasser ab.
Nachdem Sie Black Hole Quencher 2-Strang im Verhältnis zehn zu eins in die getemperte DNA-Zugsonde gegeben haben, fügen Sie 100 Mikroliter der Mischung pro zwei Deckgläser hinzu, um das Sandwich herzustellen. Legen Sie vorsichtig eine nasse Labortaschentuchkugel in die Petrischale, weg von den Deckgläsern, und verschließen Sie die Schale mit Parafilmklebeband, um ein Austrocknen der Lösung zu verhindern. Danach die Schüssel mit einer Folie abdecken und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren.
Montieren Sie am nächsten Tag die Bildgebungskammer und achten Sie darauf, dass beim Festziehen der Kammer keine Oberflächenrisse entstehen. Geben Sie dann 0,5 bis einen Milliliter Hank's Balanced Salt Solution in die Bildgebungskammer. Verwenden Sie den Cy3B-Kanal mit einem 100-fachen Objektiv, um Fluoreszenzsignale von Zellen zu erfassen, die auf die DNA-Haarnadel-Spannungssonden aufgetragen werden, wenn sie sich auszubreiten beginnen.
Nach der Herstellung von 100 nicht fluoreszierenden microMolaren Locking-Strang-Material wird es zum gewünschten Zeitpunkt in einer Endkonzentration von einem microMolar in der Bildgebungskammer zu den Zellen gegeben, um das Spannungssignal zu speichern, und es durch Pipettieren mit den Zellen mischen. Nach etwa 10 Minuten Sperre können Sie Zeitrafferfilme oder Endpunktbilder in Epifluoreszenz sowohl für die qualitative Spannungskartierung als auch für die quantitative Analyse aufnehmen. Eine gelungene Oberfläche hatte eine blassrosa Farbe.
Die hohe Qualität der Oberfläche wurde mit einem sauberen Untergrund und der Reflexionsinterferenzkontrastmikroskopie bzw. dem RICM-Kanal und einer gleichmäßigen Fluoreszenzintensität im Cy3B-Kanal demonstriert. Zeitrafferbilder der Spannungsverriegelung zeigten, dass sowohl TCR-Anti-CD3-Epsilon- als auch TCR-Peptid-MHC-Spannungssignale aufgrund von Hairpin-Locking und Signalakkumulation verstärkt wurden. Der Verriegelungsstrang zeichnete kurzlebige mechanische Zugereignisse des TCR-Peptids MHCN4 ab null Minuten auf, was die quantitative Analyse erleichterte und das eindeutige Muster der TCR-Peptid-MHC-Kraft aufdeckte, das dem Bullseye-Muster von Immunsynapsen ähnelte.
Jeder Schritt bei der Vorbereitung des Substrats erfordert Liebe zum Detail und einen sorgfältigen Umgang mit den Materialien. Diese Technologie ermöglicht die Visualisierung von transienten molekularen Kräften, die an der Zelloberfläche auftreten, wenn sie mit der Umgebung interagiert, insbesondere in den Immunzellen auf der Suche nach Antigene.
