Die Endozytose von Vesikeln in Zytoplasie führt zur Bildung intrazellulärer Vesikel. Die Permeabilisierung der Vesikel aktiviert verschiedene Signalwege. Die chromophorgestützte Laserinaktivierung wird verwendet, um die Folgen einer intrazellulären Vesikelruptur zu untersuchen.
Eine räumliche und zeitliche Kontrolle der subzellulären Schädigung intrazellulärer Vesikel kann durch die Anpassung des Stehzustands und der Lichtbeleuchtung erreicht werden. Pflegen Sie zunächst die HeLa-Zellkultur in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS. Nachdem Sie die Zellen mit PBS gewaschen haben, trypsinisieren Sie die Zellen.
Anschließend resuspendieren Sie die Zellen in DMEM ergänzt mit 10%FBS. Verdünnen Sie 300 Nanogramm Gal3-GFP-Plasmid in 25 Mikrolitern reduziertem Serummedium. Fügen Sie dann 0,6 Mikroliter P3000-Reagenz hinzu.
Und vorsichtig mischen, gefolgt von Vortexing der Lösung. 0,45 Mikroliter Lipofectamine 3000 Reagenz in 25 Mikrolitern reduziertem Serummedium verdünnen und vorsichtig mischen. Fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Dann verdünnte DNA und verdünntes Lipofectamin 3000 mischen und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach dem Mischen des DNA-Lipofectamin-Gemischs werden die Zellen mit 300.000 suspendierten HeLa-Zellen und 200 Mikrolitern DMEM mit 10 % FBS auf dem zentralen Glasbereich einer 35-Millimeter-Glasknopfschale ausgesät. Um die Zellanheftung zu ermöglichen, inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius im mit 5 % Kohlendioxid versorgten Inkubator für mindestens vier Stunden.
Verdünnen Sie AlPcS2a in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, um eine einmikromolare AlPcS2a-Lösung herzustellen. Das AlPcS2a-haltige Medium in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad vorwärmen und das Nährmedium durch das AlPcS2a-haltige Medium ersetzen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius im Inkubator, der über Nacht mit 5 % Kohlendioxid versorgt wird.
Waschen Sie die Zellen am nächsten Tag zweimal mit PBS, um extrazelluläres AlPcS2a zu entfernen, nachdem Sie das Medium durch frisches Medium ersetzt haben. Vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren, damit sich Farbstoffreste entlang des endozytären Weges in den Lysosomen ansammeln können. Um einzelne Zellen durch Schädigung der Lysosomen zu manipulieren, stellen Sie die Kulturschale auf den Tisch eines konfokalen Mikroskops.
Verwenden Sie die 488-Nanometer- und 561-Nanometer-Laser für die Anregung von GFP bzw. AlPcS2a. Kreisen Sie eine fünf mal fünf Mikrometer große quadratische Region von Interesse auf den AlPcS2a-markierten Vesikeln ein, die zur Schädigung ausgewählt werden. Beleuchten Sie dann den interessierenden Bereich mit einem 633-Nanometer-Laser von 0,21 Milliwatt oder 70 Wiederholungen.
Beobachtung der Bildung von Gal3 puncta als Indikator für die Permeabilisierung der lysosomalen Membran. Die lysosomale Färbung mit AlPcS2a in HeLa-Zellen wurde mit kommerziell erhältlichen Markern durchgeführt und mit grünem Fluoreszenzfarbstoff positiv gefärbt. Lysosomen in TagRFP-Galectin3-exprimierten HeLa-Zellen wurden mit AlPcS2a gefärbt.
Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die AlPcS2a-basierte chromophorgestützte Laserinaktivierung in der Lage war, die lokale lysosomale Ruptur innerhalb der interessierenden Region zu kontrollieren, während der Rest der Lysosomen intakt blieb. Dieser Schritt ist wichtig, da die Inkubationszeit stehende Endosomen oder Lysosomen bestimmt. Zum Beispiel kann man die Größe von durch die Freisetzung von membranundurchlässigem Farbstoff bestimmen.
Es können auch pH-empfindliche Farbstoffe wie FITC-Dextran verwendet werden, um Endosomen und Lysosomen zu unterscheiden. Diese Technik ist nützlich, um die nachgelagerten Auswirkungen der intrazellulären Bläschenmembranruptur zu beginnen. Und es gibt nachgelagerte Effekte in verschiedenen Situationen.
