Unterstützt teilweise durch NIH R01 CA121258, R01 CA125244, R01 CA154256, NIH / NCATS UCLA CTSI Förderkennzeichen UL1TR000124, USAMRMC W81XWH-08-1-0734 und der Joan S. Holmes Memorial Research Fund. MJH und GCO erhielt von der Joan S. Holmes Memorial Postdoctoral Fellowship an der UCLA unterstützt. Die CSM-Gerät wurde von Creative Wissenschaftliche Methoden erhalten: www.creative-sci.com. Die lentiviralen Vektor wurde von der UCLA Vector Kern, der von CURE / P30 DK041301 unterstützt wird empfangen.

1. Schieben Vorbereitung <ol><li> Legen Zellsedimentation Manifold gleitet in Sterilisationsbeutel und Dichtung mit Autoklav-Band. Vor der Teflon-beschichteten Seite des Schiebers die Papierseite des Beutels an Kunststoff Ablagerungen auf den Vertiefungen zu vermeiden. </li><li> Autoklav Beutel für 15 min bei 121 ° C. </li><li> Objektträger aus Sterilisationsbeutel in einer Biosicherheitswerkbank und in eine sterile 150 x 15 mm sterilen Petrischale. Bis zu vier Dias pro Gericht passen. Legen Sie eine 35 x 10 mm Petrischale neben den Folien. Fügen Sie 2-3 ml sterilem H 2 O, um Befeuchtung zu schaffen. </li><li> Precoat-mit Poly-D-Lysin an 100 ug / ml unter Verwendung von genügend Volumen, um gut decken die gesamte. Nach einer Stunde bei RT absaugen und spülen Sie die Oberfläche der Wanne zweimal durch Pipettieren 1x PBS über die Oberfläche der Vertiefungen. </li><li> Fügen Sie optional Fibronektin oder andere ECM-Komponenten zu einer stärkeren Tumorzellhaftung zu gewährleisten. Hinzufügen Fibronektin bei 5 ug / ml in genügend Volumen That den Vertiefungen wird nicht trocken in einem kurzen Zeitraum bei Raumtemperatur. <ol><li> Nach 1 Stunde, saugt den Restlösung und waschen zweimal durch Auf- und Abpipettieren mit 1x PBS. </li></ol></li><li> Halten PBS auf den Brunnen, bis Tumor ist bereit für die Beschichtung. Verwendung gleitet am selben Tag. </li><li> Ernte einen konfluenten Flasche des gewünschten adhärenten Tumorzelltyp. Zählen lebensfähiger Zellen mit Trypan-Blau-Farbstoffausschluss durch Lichtmikroskopie und Resuspension in 5 x 10 6 Zellen / ml in ausreichend gepuffert Wachstumsmedium, beispielsweise Dulbeccos minimal essential medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), L- Glutamin und Natriumpyruvat. </li><li> Wenn Fluoreszenzabbildung der adhärenten Zellpopulation gewünscht ist, kennzeichnen die adhärente Zellpopulation mit einem Vitalfluoreszenzfarbstoff oder ein Zellproliferations Farbstoff nach den Protokollen des Herstellers. </li><li> Sanft Pipette 10 ul Vollmedium in jede Vertiefung des Objektträgers kümmert, damit Sie keine Blasen in der wells, da diese einheitliche Tumorzellhaftung zu verhindern. </li><li> Hinzufügen 2,5-5,0 x 10 4 Zellen (5-10 ul Zellsuspension) zu dem Medium in jeder Vertiefung (1A). Stellen Sie die optimale Anzahl in Abhängigkeit von Tumorzelltyp und der Anzahl von Tagen Wachstum erwünscht. Größere Tumorzellen oder schnell wachsende Zellen weniger Zellen erfordern zunächst. Bringen Sie auch Volumen von bis zu 40 &amp; mgr; l durch Zugabe von Medium und Pipette auf und ab, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten. </li><li> Nachdem alle Vertiefungen ausgesät, damit die Tumorzellen bei RT auf dem 150 x 15 mm Petrischale haften, dann setzen Sie den Deckel vorsichtig bewegen Sie den Spiegel auf eine 37 ° C / 5% CO 2 befeuchteten Inkubator für mindestens 24 Stunden. </li><li> Ändern Sie das Kulturmedium täglich. Einen Teil des verbrauchten Mediums aus der Monolage vorsichtig pipettieren und ersetzen mit frischem Vollmedium. Hinweis: Wegen der Verdampfung, mehr Volumen benötigen als entnommen wurde hinzugefügt. Wells ist bereit für Test, wenn eine gleichmäßige, confließend Schicht von Zellen vorhanden ist. Dieser ist in der Regel 1-3 Tage nach der ersten Aussaat. </li><li> Sanft einmal waschen Monolayer mit PBS, wie in Schritt 1.4 beschrieben und entweder zu Schritt 2, wenn Monoschichten erwünscht sind, oder mit Schritt 1.13 ECM-Proteine ​​aus der Monoschicht zu extrahieren. </li><li> Einen 0,5% Triton-X (v / v) Lösung in komplettem Medium und füge 30 ul in jede Vertiefung. Lassen Mono verdauen Kapuze für 2 Minuten, dann waschen zweimal mit komplettem Medium mit einer Pipette wie oben beschrieben. HINWEIS: Die ECM-Schicht kann durch Lichtmikroskopie (Figur 2) angezeigt werden. Verwenden Sie Folien sofort, oder halten Sie in vollständigem Medium in der befeuchteten CO 2 Inkubator für 1-2 Tage. Lassen Sie die Vertiefungen zu trocknen. </li></ol> 2. Sedimentation Nicht anhaftende T-Zellen auf Slide <ol><li> Wenn Fluoreszenzabbildung des nicht-adhärenten Zellpopulation gewünscht ist, kennzeichnen die nicht-adhärenten Zellpopulationen mit einem Vital fluoreszierenden Farbstoff wie CFSE, Cell Tracker Red CMPTX oder eFluor670 durch Befolgen der Protokolle des Herstellers mindestens 1 Stunde vor dem Test zur Verfügung gestellt. Alternativ zu manipulieren Zellen fluoreszierende Proteine ​​durch virale Vektoren kodiert wird. </li><li> Autoklavieren den Zellsedimentation vielfältig in einem Autoklav Beutel wie oben in 1.2 beschrieben. </li><li> Entfernen Sie den befeuchteten Kammer mit Teflon beschichtete Objektträger aus dem Inkubator und in biologischen Sicherheitsschrank. </li><li> Waschen Vertiefungen mit 1x PBS durch Auf- und Abpipettieren, dann fügen Sie 45 ul Vollmedium mindestens 10% Serum mit. </li><li> Entfernen des Verteilers aus der Sterilisationsumschlag bilden und vorsichtig in den Vertiefungen bis &#39;Haken&#39; am Ende des Verteilers berührt den unteren Rand der Folie (1B). </li><li> Sicherstellen, dass das Kulturmedium in jedem der Kanäle sichtbar ist. Wenn keine zu sehen ist, nehmen Sie die vielfältigen und noch mehr auf das entsprechende Medium gut, dann ersetzen und erneut prüfen. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.5 für jede channel des Verteilers oder für so viele Vertiefungen nach Wunsch. </li><li> Zählen nicht-adhärenten Zellen und Resuspension bei mindestens 1,0-2,0 x 10 5 / &amp; mgr; l. Auszuarbeiten 1 ul Zellen und langsam pipettiert sie in den Kanal (Abbildung 1C). Tun Sie dies für jede Vertiefung gewünscht. </li><li> Lassen Sie die gesamte Zelle geladenen Gerät, also vielfältig und Rutsche, in der Bio-Haube für 20-30 Minuten, damit sich die Zellen in den Kanal zu begleichen. </li><li> Entfernen Sie die vielfältigen, indem Sie beide Enden und leichtes Anheben sie gerade nach oben von der Folie, um die Zellen fokal in der Mitte der Brunnen (1D) ausgesät nicht stören. </li><li> Untersuchen jeder Vertiefung, um sicherzustellen, daß die nicht-adhärenten Zellen wurden erfolgreich in der Mitte des Bohrlochs innerhalb des Umfangs des Verteilerkanals bleiben ausgesät. Die nichthaftenden Zellen werden in idealer leicht auf der Monoschicht oder ECM und aneinander haften daher sanft bewegt den Schieber herum wird die Zelle nicht Pelle verursachent zu zerstreuen. Drängen Sie nicht die Folie. </li></ol> 3. Fluoreszenzmikroskopie <ol><li> Bei entsprechender experimentelle Ausstattung, führen Sie die Bild nach Sedimentation wird bestätigt. Idealerweise mit einem Mikroskop, das mit einem CO 2 und Luftfeuchtigkeit Kammer ausgestattet ist. Bild mit geringer Leistung, das heißt, 4X oder 10X, um mehrere Bilder zu ermöglichen, von einer größeren Fläche aufgenommen, so dass die Gesamtheit der gut eingesehen werden kann. </li><li> Erwerben Sie digitale Bilder mit Aufnahmesoftware. Führen Hellfeld und / oder der Mehrkanal-Fluoreszenz-Imaging. </li><li> Falls gewünscht, kann ein Zeitraffer-Bilder in verschiedenen Kanälen über einen bestimmten Bereich aufzunehmen, oder halten Sie den Schiebe befeuchtet und in einem 37 ° C / 5% CO 2 Inkubator und von Hand nehmen, um Bild zu den gewünschten Zeitpunkten (Bild gesetzt 1E &amp; F, für längere Zeitpunkten empfohlen). </li></ol> 4. Analyse und Anzeige <ol><li> Mit Bildbearbeitungssoftware, verschmelzen Licht und fluorescent Bilder in eine Schicht, so dass mehrere Zelltypen und Marken können in der gleichen Bildes gesehen werden. Ziehen Sie die Bilddateien für jede einzelne Farbe in das Programm und, wenn Sie gefragt werden, wählen Sie die &quot;Ebene hinzufügen&quot; Option, um eine Image-Datei mit mehreren Ebenen erstellen. <ol><li> Bei höherer Vergrößerung nehmen, ausrichten und zusammenfügen von Bildern über das auch digital. Richten Sie Dateien, indem du konservierten Regionen zwischen zwei Bildern und Überlagerung eines Bildes auf dem anderen, bis ein vollständiges Bild erzeugt. </li></ol></li><li> Fügen Mikron Bars um Bilder bei der Aufnahme mit Hilfe der Capture-Software zur Entfernung einzelner Zellen gewandert sind zu bestimmen. </li><li> Zur Bestimmung der Zellmigration zu verschiedenen Zeiten, stellen Oberfläche Intensität Fluoreszenz-Karten mit Software-Image, dh ImageJ, um fluoreszierende T-Zell-Aggregation oder über die Zeit verteilt zu quantifizieren. <ol><li> Um Oberflächendarstellung zu erzeugen, nehmen Sie ein Bild mit Ebenen in Schritt 4.1 und unter dem Fenster Ebenen erzeugt,Deaktivieren Sie alle Ebenen außer die, die entsprechend dem gewünschten Kanal. Zum Beispiel, wenn eine Oberflächendarstellung gewünscht ist, EMD Ausdrucks sichtbar zu machen, nur die &quot;grüne&quot; Schichten entsprechend dem für diesen Marker verwendete Filter sollte sichtbar sein. </li><li> Glätten Sie das Bild und speichern Sie sie in einem Dateiformat erkannt (zB PNG) und laden Sie das Bild in das Programm. Um die Oberfläche des Grundstückes zu erzeugen, ändern Sie den Bildtyp auf 8-bit, ändern Sie die Helligkeit / Kontrast wie notwendig, um den Hintergrund zu reduzieren, und wählen Sie die &quot;Analyze / Surface Plot &#39;Option. Die Bilder in Abbildung 5 wurden, indem Sie die &quot;Schatten&quot;, &quot;Draw-Achse&quot;, &quot;Ein Polygon pro Zeile&quot; und &quot;Smooth&quot; Checkboxen generiert. </li><li> Alternativ nehmen Messungen mit dem Radius oder Durchmesser von der Brennzelle Ablagerung zum Zeitpunkt Null und im Vergleich zu den Zellen im äußersten Punkt zu unterschiedlichen Zeiten. Der Durchmesser der Teflon Vertiefungen beträgt 6,0 mm. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hwang, J. H., Smith, C. A., Salhia, B., Rutka, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+fascin+in+the+migration+and+invasiveness+of+malignant+glioma+cells.">The role of fascin in the migration and invasiveness of malignant glioma cells.</a> Neoplasia. 10 (2), 149-159 (2008).</li><li>Valster, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+and+invasion+assays.">Cell migration and invasion assays.</a> Methods. 37 (2), 208-215 (2005).</li><li>Berens, M. E., Rief, M. D., Loo, M. A., Giese, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+extracellular+matrix+in+human+astrocytoma+migration+and+proliferation+studied+in+a+microliter+scale+assay.">The role of extracellular matrix in human astrocytoma migration and proliferation studied in a microliter scale assay.</a> Clin Exp Metastasis. 12 (6), 405-415 (1994).</li><li>Osawa, H., Smith, C. A., Ra, Y. S., Kongkham, P., Rutka, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+membrane+cytoskeleton+cross-linker+ezrin+in+medulloblastoma+cells.">The role of the membrane cytoskeleton cross-linker ezrin in medulloblastoma cells.</a> Neuro-oncology. 11 (4), 381-393 (2009).</li><li>Berens, M. E., Beaudry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+monolayer+cell+migration+assay.">Radial monolayer cell migration assay.</a> Methods Mol Med. 88, 219-224 (2004).</li><li>Giese, A., Rief, M. D., Loo, M. A., Berens, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+human+astrocytoma+migration.">Determinants of human astrocytoma migration.</a> Cancer Res. 54 (14), 3897-3904 (1994).</li><li>Vlodavsky, I., Levi, A., Lax, I., Fuks, Z., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cell+attachment+and+morphological+differentiation+in+a+pheochromocytoma+cell+line+and+embryonal+sensory+cells+by+the+extracellular+matrix.">Induction of cell attachment and morphological differentiation in a pheochromocytoma cell line and embryonal sensory cells by the extracellular matrix.</a> Dev Biol. 93 (2), 285-300 (1982).</li><li>Hulkower, K. I., Herber, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+and+invasion+assays+as+tools+for+drug+discovery.">Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery.</a> Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).</li><li>Hickey, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementing+preclinical+study+findings+to+protocol+design:+translational+studies+with+alloreactive+CTL+for+gliomas.">Implementing preclinical study findings to protocol design: translational studies with alloreactive CTL for gliomas.</a> Am J Transl Res. 4 (1), 114-126 (2012).</li><li>Tai, C. K., Wang, W. J., Chen, T. C., Kasahara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-shot,+multicycle+suicide+gene+therapy+by+replication-competent+retrovirus+vectors+achieves+long-term+survival+benefit+in+experimental+glioma.">Single-shot, multicycle suicide gene therapy by replication-competent retrovirus vectors achieves long-term survival benefit in experimental glioma.</a> Mol Ther. 12, 842-851 (2005).</li><li>Logg, C. R., Baranick, B. T., Lemp, N. A., Kasahara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+evolution+of+a+tagged+chimeric+gammaretrovirus:+identification+of+novel+cis-acting+elements+that+modulate+splicing.">Adaptive evolution of a tagged chimeric gammaretrovirus: identification of novel cis-acting elements that modulate splicing.</a> J Mol Biol. 369 (5), 1214-1229 (2007).</li><li>Koya, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+phases+of+distribution+and+tumor+targeting+by+T+cell+receptor+engineered+lymphocytes+inducing+robust+antitumor+responses.">Kinetic phases of distribution and tumor targeting by T cell receptor engineered lymphocytes inducing robust antitumor responses.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 107 (32), 14286-14291 (2010).</li><li>Zumwalde, N. A., Domae, E., Mescher, M. F., Shimizu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-1-dependent+homotypic+aggregates+regulate+CD8+T+cell+effector+function+and+differentiation+during+T+cell+activation.">ICAM-1-dependent homotypic aggregates regulate CD8 T cell effector function and differentiation during T cell activation.</a> J Immunol. 191 (7), 3681-3693 (2013).</li><li>Campbell, C. B., Cukierman, E., Artym, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+extracellular+matrix+from+sectioned+human+tissues.">3-D extracellular matrix from sectioned human tissues.</a> Curr Protocol Cell Biol. 62 (Unit 19), 11-20 (2014).</li><li>Prevention, C. f. D. C. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , (2009).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors.">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> J Cell Biol. 75 (2 Pt 1), 606-616 (1977).</li><li>Alstergren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+and+directed+migration+of+murine+neutrophils+is+dependent+on+cell+surface+expression+of+CD44.">Polarization and directed migration of murine neutrophils is dependent on cell surface expression of CD44.</a> Cell Immunol. 231 (1-2), 146-257 (2004).</li><li>Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+under+agarose:+a+new+and+simple+method+for+measuring+chemotaxis+and+spontaneous+migration+of+human+polymorphonuclear+leukocytes+and+monocytes.">Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes.</a> J Immunol. 115 (6), 1650-1656 (1975).</li><li>Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metallothionein+mediates+leukocyte+chemotaxis.">Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis.</a> BMC Immunol. 6 (12), 21 (2005).</li><li>Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+real-time+measurement+of+chemotactic+cell+motility.">Automated real-time measurement of chemotactic cell motility.</a> Biotechniques. 31 (5), 1130-1138 (2001).</li><li>Zhang, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+antigen+precursor+protein+profiles+of+adult+and+pediatric+brain+tumors+identify+potential+targets+for+immunotherapy.">Tumor antigen precursor protein profiles of adult and pediatric brain tumors identify potential targets for immunotherapy.</a> J Neuro-oncol. 88, 65-76 (2008).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

Tumorzellen in einem Einzelzellsuspension wurden in die Vertiefungen einer Teflon-maskiert Schieber pipettiert. Man ließ die Zellen anhaften und dann in einer befeuchteten 5% CO 2, 37 ° C-Inkubator (1A) gebildete Monoschichten. Etablierte Monoschichten oder ECM-Proteine ​​aus der Monoschicht abgeleitet könnte für diese Assays (1B) geerntet werden. Effektor-T-Lymphozyten mit vitalen Farbstoffen markiert oder mit Vektoren für EMD Codierungs transduziert wurden in der M...

Der Radial Monolayer-Zellmigrationsassay wurde ursprünglich entwickelt, um die Infiltrationseigenschaften von adhärenten Tumorzellen 1-4 auf Objektträger mit der extrazellulären Matrix (ECM) Proteine ​​5-7 oder mit einzelnen ECM-Komponenten, wie Fibronectin oder Laminin 1,2 beschichtet messen. Die Technik involviert Animpfen einer Einzelzellsuspension von Tumorzellen in der Mitte der Vertiefungen unter Verwendung eines Edelstahl Zellsedimentation Verteiler (CSM). Nach Sedimentation würden die Tumorzellen an der Unterseite der Wanne und der Änderung des Durchmessers des anfänglichen Zellpopulation im Laufe der Zeit festhalten wurde verwendet, um eine Rate der horizontalen Beweglichkeit herzustellen. Die Radial Monolayer Zellmigration Test vorgesehen eine visuelle Vorteil gegenüber anderen existierenden Methoden, die Transwell-Platten, die in-vitro-Migrationsfunktionen von Zellen zu untersuchen beschäftigt; diese Tests sind nicht förderlich für die Bildgebung 8. Wie gut, sondern auch bei der Auswahl der vorgesehenen Zeitpunkt eine große Menge an Freiheits, wenn die Migration untersucht, ohne Begrenzung auf die Anzahl der Zeitpunkte ein Forscher könnte nach der Sedimentation zu Bild auszuwählen. Weil die Migrationsfähigkeit ist eine wichtige Funktion für die nicht-anhaftenden Zellen, insbesondere auf dem Gebiet der Immuntherapie oder wo sie als Abgabevehikel für virale Vektoren verwendet werden, geeignet ist der Einsatz der CSM, die Migration von nicht-adhärenten Zellen zu bewerten Typen auf Tumorzellschichten, zusätzlich zu den ECM-Proteine. Der zusätzliche Vorteil der mikroskopisch Visualisierung der Migration von nicht-adhärenten Zellen zu lebensfähigen Tumorzellschichten, auf komplexen ECM aus dem Tumor oder an einzelnen ECM Komponenten isoliert macht dieses Assay vielseitig. Assays, die Vertiefungen, die mit einem einzigen extrazellulären Protein beschichtet beschäftigen nicht genau weiß das ECM-Gewebesubstrat oder Tumor die Zellen würden durch in vivo zu migrieren. Hier haben wir alloreaktiven zytotoxische T-Lymphozyten (alloCTL), zu den wichtigsten histocomp sensibilisiertatibility Komplex (MHC) -Proteinen mit Einweg gemischten Lymphozytentumorzellreaktionen (MLTR) oder gemischten Lymphozytenreaktionen (MLR) 9, wie unsere repräsentative nicht-adhärenten Zelltyp. Wir testeten Zellen der menschlichen und murinen Ursprungs. Bei der Migration wurde auf Tumormonoschichten gemessen, waren die Tumorzellen eingesetzt entweder teilweise relevanten Ziele und zeigt einige der gleichen MHC-Proteinen auf der Zellpopulation verwendet, um die Effektoren oder vollständig relevanten Ziele, mit einem kompletten Satz von MHC-Molekülen zu sensibilisieren gestellt, dass die Effektoren hatte gegen sensibilisiert. In einigen Experimenten wurden fluoreszierende Celltracker Red CMPTX oder Zellproliferation Farbstoff eFluor 670 zwischen Effektor- und Zielzellen zu unterscheiden. Wir haben auch die Transduktion mit viralen Vektoren Codierung für fluoreszierende Proteine ​​als weitere Möglichkeit, um die Zellen zu visualisieren. Für bestimmte Tests, transduziert wir die alloCTL mit retroviralen Vektoren zu replizieren (RRV) für Emerald Green (EMD) fluoreszierendes Protein kodierende 10,11; für othten, wurden Tumorzellen mit lentiviralen Vektoren für mStrawberry Codierungs transduziert. Die alloCTL wurden durch einen Kanal des Verteilers in die Mitte der beiden Tumorzellschichten oder ECM aus Tumorzellmonolayer geerntet ausgesät. Adhärenten und nicht-adhärenten Zell Wechselwirkungen wurden durch Licht und / oder durch Fluoreszenzmikroskopie im Laufe der Zeit sichtbar. Störung in der Tumorzellschicht mit geringer Leistung oder Tumorzellen mit fragmentierten Kernen mit hoher Leistung waren Indikatoren der Zellschädigung durch Lyse und Apoptose auf. Wir digital erstellt Oberfläche Intensität fluoreszierender Karten, auf denen die Migration von nicht-haftenden fluoreszierenden T-Zellen in den Monolayer-Kulturen. Wir haben auch darauf hingewiesen, die Zytotoxizität erzeugt, um die adhärenten Gliom-Zellmonolayer nach Clusterbildung der überlagerten nicht haft alloCTL. Wie gut, horizontal Transduktion RRV-EMD von der alloCTL auf die Gliom Monolage beobachtet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="920">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:203px;">Company</td>
			<td style="width:239px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:312px;">Teflon-masked microscope slides</td>
			<td style="width:203px;">Creative Scientific Methods</td>
			<td style="width:239px;">CSM002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:312px;">Cell Sedimentation Manifold</td>
			<td style="width:203px;">Creative Scientific Methods</td>
			<td style="width:239px;">CSM001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Petri Dish, 150mm</td>
			<td style="width:203px;">Corning</td>
			<td style="width:239px;">430597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Petri Dish, 35mm</td>
			<td style="width:203px;">Corning</td>
			<td style="width:239px;">430588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:203px;">Mediatech</td>
			<td style="width:239px;">21-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">20 &#956;L Pipetman</td>
			<td style="width:203px;">Gilson</td>
			<td style="width:239px;">F123600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">200 &#956;L Pipetman</td>
			<td style="width:203px;">Gilson</td>
			<td style="width:239px;">F123601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">200 &#956;L pipette tips</td>
			<td style="width:203px;">VWR</td>
			<td style="width:239px;">89003-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Distilled, deionized water (sterile)</td>
			<td style="width:203px;">Mediatech</td>
			<td style="width:239px;">25-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Trypsin</td>
			<td style="width:203px;">Mediatech</td>
			<td style="width:239px;">25-054-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Celltracker Red CMPTX</td>
			<td style="width:203px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:239px;">C34552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">TrypLE Express (optional)</td>
			<td style="width:203px;">Gibco</td>
			<td style="width:239px;">12604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Tumor cell culture media (e.g. DMEM)</td>
			<td style="width:203px;">Mediatech</td>
			<td style="width:239px;">10-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">AIM-V serum-free media</td>
			<td style="width:203px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:239px;">12055-083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:203px;">Omega Scientific</td>
			<td style="width:239px;">FB-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">SPOT Advanced</td>
			<td style="width:203px;">Diagnostic Instruments</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:203px;">Millipore</td>
			<td style="width:239px;">A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:203px;">BD</td>
			<td style="width:239px;">354008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:312px;">31/2 x 51/4 Autoclave Pouches</td>
			<td style="width:203px;">Crosstex</td>
			<td style="width:239px;">SCXS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:203px;">Mediatech</td>
			<td style="width:239px;">25-900-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Cell Proliferation eFluor 670</td>
			<td style="width:203px;">eBioscience</td>
			<td style="width:239px;">65-0840-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">ImageJ</td>
			<td style="width:203px;">NIH</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

radial mobility and cytotoxic function of retroviral replicating vector transduced, non-adherent alloresponsive t lymphocytes

Wir berichten über einen neuartigen Anpassung des Radialmonolayer-Zellmigrationsassay ersten gemeldet, um die radiale Migration von adhärenten Tumorzellen an extrazellulären Matrixproteinen zu messen, zur Messung der Beweglichkeit der fluoreszierend markierten, nicht-adhärente humane oder murine Effektor Immunzellen. Diese Technik verwendet ein nichtrostender Stahl und vielfältigen 10-Well-Teflon-Folie, um fokal einzahlen nicht haftende T-Zellen in die Vertiefungen entweder konfluent Tumorzellmonoschichten oder extrazellulären Matrixproteinen vorbereitet. Licht und / oder Mehrkanal-Fluoreszenz-Mikroskopie verwendet wird, um die Bewegung und das Verhalten der Effektorzellen über die Zeit verfolgen. Fluoreszenzfarbstoffe und / oder virale Vektoren, die Code für fluoreszierende Transgenen verwendet werden, um differentiell zu markieren, die Zelltypen für die Bildgebung. Diese Methode unterscheidet sich von ähnlichen Typs in-vitro-Tests, die horizontale oder vertikale Migration / Invasion Verwendung Schiebekammern, Agar oder Transwell-Platten zu verfolgen. Der Test ermöglicht die detaillierte Bilddaten zu be mit verschiedenen Zelltypen mit spezifischen Fluoreszenzmarkern unterschieden gesammelt; sogar spezifische Subpopulationen von Zellen (dh transduziert / transduzierten) überwacht werden kann. Oberflächen Intensität Fluoreszenz Grundstücke werden mit speziellen Fluoreszenzkanälen, die zu migrierenden Zelltyp entsprechen generiert. Dies ermöglicht eine bessere Visualisierung der nichthaftImmunZellMobilität zu bestimmten Zeiten. Es ist auch möglich, Belege für andere Effektorzelle Funktionen wie Zytotoxizität oder der Übertragung von viralen Vektoren, die von Effektorzellen zu Zielzellen zu sammeln, als auch. Somit ermöglicht das Verfahren die Forscher mikroskopisch dokumentieren Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen von differentiell markierten, nicht-haftend mit adhärenten Zellen verschiedener Typen. Solche Informationen können besonders relevant bei der Beurteilung von biologisch manipuliert oder aktivierten Immunzelltypen, wo visuelle Nachweis der Funktionsfähigkeit mit Tumorzielzellen vor ihrer Verwendung zur Krebstherapie erwünscht.

Virale Vektoren kodierend für fluoreszierende Proteine ​​können zusätzlich zu oder anstelle der Fluoreszenzfarbstoff verwendet werden. Virale Transduktion sollte vor der Motilität Assay durchgeführt werden. Sowohl adhärenten und nicht-adhärenten Zelltypen kann differentiell markiert. Das Protokoll für die Weiterleitung von der Art des verwendeten Vektors abhängen. Hier transduziert wir alloCTL in den 3, 5 und 6 mit RRV-EMD mindestens zwei Tage vor dem Test unter Verwendung ...

Watch this Scientific Journal Video about Radial Mobility and Cytotoxic Function of Retroviral Replicating Vector Transduced, Non-adherent Alloresponsive T Lymphocytes at JoVE.com

Radial Mobility and Cytotoxic Function of Retroviral Replicating Vector Transduced, Non-adherent Alloresponsive T Lymphocytes

We describe a protocol to monitor radial mobility of non-adherent immune cells in vitro using a cell sedimentation manifold/slide apparatus. Cell migration is tracked on monolayers of tumor cells or on extracellular matrix proteins. Examination by light and fluorescence microscopy allows for observation of cell mobility and cytotoxic functionality.

Radial Mobilität und zytotoxische Funktion der retroviralen Replikation von Vektor transduziert, Nichthaft Alloresponsive T-Lymphozyten

We report a novel adaptation of the Radial Monolayer Cell Migration assay, first reported to measure the radial migration of adherent tumor cells on ...

radial-mobility-cytotoxic-function-retroviral-replicating-vector

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.7K Aufrufe.  UCLA David Geffen School of Medicine. We describe a protocol to monitor radial mobility of non-adherent immune cells in vitro using a cell sedimentation manifold/slide apparatus. Cell migration is tracked on monolayers of tumor cells or on extracellular matrix proteins. Examination by light and fluorescence microscopy allows for observation of cell mobility and cytotoxic functionality. 

Serie: Radial Mobility and Cytotoxic Function of Retroviral Replicating Vector Transduced, Non-adherent Alloresponsive T Lymphocytes

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

Herstellung und Verwendung von HIV-1 infizierten primären CD4 + T-Zellen als Zielzellen in der natürlichen Killerzellen Zytotoxische Assays

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease. During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin production is lost, presumably this results from the destruction of pancreatic beta cells by T cells. Understanding the mechanisms of beta cell death during 
the development of T1D will provide insights to generate an effective cure for this disease. Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays have historically used the 
radionuclide Chromium 51 (51Cr) to label target cells. These targets are then exposed to effector cells and the release of 51Cr from target 
cells is read as an indication of lymphocyte-mediated cell death. Inhibitors of cell death result in decreased release of 51Cr.
 As effector cells, we used an activated autoreactive clonal population of CD8+ Cytotoxic T lymphocytes (CTL) isolated from a mouse stock transgenic for both the alpha and beta chains of the AI4 T cell receptor (TCR). Activated AI4 T cells were co-cultured with 51Cr labeled target NIT cells for 16 hours, release of 51Cr was recorded to calculate specific lysis 
Mitochondria participate in many important physiological events, such as energy production, regulation of signaling transduction, and apoptosis. The study of beta cell mitochondrial functional changes during the development of T1D is a novel area of research. Using the mitochondrial membrane potential dye Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) and confocal microscopic live cell imaging, we monitored mitochondrial membrane potential over time in the beta cell line NIT-1. For imaging studies, effector AI4 T cells were labeled with the fluorescent nuclear staining dye Picogreen. NIT-1 cells and T cells were co-cultured in chambered coverglass and mounted on the microscope stage equipped with a live cell chamber, controlled at 37&deg;C, with 5% CO2, and humidified. During these experiments images were taken of each cluster every 3 minutes for 400 minutes.
Over a course of 400 minutes, we observed the dissipation of mitochondrial membrane potential in NIT-1 cell clusters where AI4 T cells were attached. In the simultaneous control experiment where NIT-1 cells were co-cultured with MHC mis-matched human lymphocyte Jurkat cells, mitochondrial membrane potential remained intact. This technique can be used to observe real-time changes in mitochondrial membrane potential in cells under attack of cytotoxic lymphocytes, cytokines, or other cytotoxic reagents.

Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays can be used to test autoreactive responses and study mechanisms of cell death in vitro. However, using live-cell confocal microscopic imaging techniques with fluorescent dyes, the type and kinetics of cell death as well as the pathways utilized can be studied in greater detail.

Methoden zur Beta Cell Death vermittelt durch zytotoxische T-Lymphozyten Beurteilung

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

Ausbau zytotoxische T-Lymphozyten aus Nabelschnurblut, dass Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr-Virus und Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of malignancies 1. CTLs can recognize malignant cells by interacting tumor antigens with the T cell receptors (TCR), and release cytotoxins as well as cytokines to kill malignant cells. It is known that less-differentiated and central-memory-like (termed highly reactive) CTLs are the optimal population for ACT-based immunotherapy, because these CTLs have a high proliferative potential, are less prone to apoptosis than more differentiated cells and have a higher ability to respond to homeostatic cytokines 2-7. However, due to difficulties in obtaining a high number of such CTLs from patients, there is an urgent need to find a new approach to generate highly reactive Ag-specific CTLs for successful ACT-based therapies.
TCR transduction of the self-renewable stem cells for immune reconstitution has a therapeutic potential for the treatment of diseases 8-10. However, the approach to obtain embryonic stem cells (ESCs) from patients is not feasible. Although the use of hematopoietic stem cells (HSCs) for therapeutic purposes has been widely applied in clinic 11-13, HSCs have reduced differentiation and proliferative capacities, and HSCs are difficult to expand in in vitro cell culture 14-16. Recent iPS cell technology and the development of an in vitro system for gene delivery are capable of generating iPS cells from patients without any surgical approach. In addition, like ESCs, iPS cells possess indefinite proliferative capacity in vitro, and have been shown to differentiate into hematopoietic cells. Thus, iPS cells have greater potential to be used in ACT-based immunotherapy compared to ESCs or HSCs.
Here, we present methods for the generation of T lymphocytes from iPS cells in vitro, and in vivo programming of antigen-specific CTLs from iPS cells for promoting cancer immune surveillance. Stimulation in vitro with a Notch ligand drives T cell differentiation from iPS cells, and TCR gene transduction results in iPS cells differentiating into antigen-specific T cells in vivo, which prevents tumor growth. Thus, we demonstrate antigen-specific T cell differentiation from iPS cells. Our studies provide a potentially more efficient approach for generating antigen-specific CTLs for ACT-based therapies and facilitate the development of therapeutic strategies for diseases.

Generation of T lymphocytes from induced pluripotent stem (iPS) cells gives an alternative approach of using embryonic stem cells for T cell-based immunotherapy. The method shows that by utilizing either in vitro or in vivo induction system, iPS cells are able to differentiate into both conventional and antigen-specific T lymphocytes.

Gerichtete Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen in Richtung T-Lymphozyten

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&amp;#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

Isolierung und Differenzierung von Th17 Naive CD4-T-Lymphozyten

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

Statische Haftung Assay für das Studium der Integrin-Aktivierung in T-Lymphozyten

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to the palatine tonsils situated at the lateral walls of the oral part of the pharynx. Surgically removed palatine tonsils provide a convenient accessible source of B and T lymphocytes to study the interplay between foreign pathogens and the host immune system. This video protocol describes the dissection and processing of surgically removed human palatine tonsils, followed by the isolation of the individual B and T cell populations from the same tissue sample. We present a method, which efficiently separates tonsillar B and T lymphocytes using an antibody-dependent affinity protocol. Further, we use the method to demonstrate that human adenovirus infects specifically the tonsillar T cell fraction. The established protocol is generally applicable to efficiently and rapidly isolate tonsillar B and T cell populations to study the role of different types of pathogens in tonsillar immune responses.

Palatine tonsils are a rich source of B and T lymphocytes. Here we provide an easy, efficient and rapid protocol to isolate B and T lymphocytes from human palatine tonsils. The method described has been specifically adapted for studies of the viral etiology of tonsil inflammation known as tonsillitis.

Effiziente Isolation Protokoll für die B- und T-Lymphozyten von Menschengaumenmandeln

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

Retrovirale Transduktion von Knochenmark-Progenitorzellen zu generieren T-Zell-Rezeptor Retrogenic Mäuse

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

Generieren<em&gt; De Novo</em&gt; Antigen-spezifische Zellrezeptoren humanen T von Retrovirale Transduktion von Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...