Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die Generierung von zufällig mutagenisierten RNA-Bibliotheken in voller Länge von einzelsträngigen positiven RNA-Virusgenomen mit einer Länge von bis zu 10 Kilobyte und die Auswahl von Phänotypen von Interesse unter gewünschten experimentellen Bedingungen. Mit dieser Technik können in kurzer Zeit virale RNA-Bibliotheken in voller Länge mit unterschiedlicher genetischer Vielfalt erstellt werden, wobei ein klonierungsfreier Ansatz verwendet wird. Die Technik verwendet kostengünstige und weit verbreitete Reagenzien für die Synthese von Bibliotheken.
Shaheen Khan, Doktorand der Abteilung für Virologie am Department of Life Sciences der Shiv Nadar University, wird das Verfahren demonstrieren. Führen Sie zunächst die ep-PCR durch, indem Sie den Mastermix für vier Versuchssätze mit Vorwärts- und Rückwärtsprimern zusammen mit den Reaktionskomponenten ohne das pJFH1-Template vorbereiten, wie im Textmanuskript beschrieben. Aliquotieren Sie den Mastermix in vier Röhrchen.
Geben Sie 100 Nanogramm, 50 Nanogramm, 25 Nanogramm und 10 Nanogramm der Matrize in die einzelnen Röhrchen und stellen Sie das Gesamtvolumen der Reaktion auf 50 Mikroliter ein. Wenden Sie die Zyklusbedingungen an, um ein 97 36-Basenpaar-Fragment zu amplifizieren. Schätzung des amplifizierten ep-PCR-Produkts, indem fünf Mikroliter der PCR-Produkte geladen und mit bekannten Mengen einer Kilobasen-DNA-Leiter verglichen werden, indem eine 0,8%TAE-basierte Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt wird.
Reinigen Sie das Produkt mit einem Säulenreinigungskit. Schätzen Sie die Konzentration des gereinigten Produkts, indem Sie die Absorption bei 260 Nanometern messen. Das ep-PCR-Produkt wird im Vakuum konzentriert, um eine Produktkonzentration von mindestens 100 Nanogramm pro Mikroliter zu erhalten.
Richten Sie eine In-vitro-RNA-Synthesereaktion ein und platzieren Sie sie für die Inkubation bei 37 Grad Celsius. Anschließend wird das synthetisierte Produkt mit einem Säulenreinigungskit gereinigt. Richten Sie eine 20-Mikroliter-cDNA-Synthesereaktion ein, indem Sie gemäß den Empfehlungen des Herstellers etwa ein Mikrogramm der viralen RNA, fünf mikromolare Reverse-Primer und 200 Einheiten Reverse-Transkriptase hinzufügen.
Stellen Sie unter Verwendung der cDNA ein Reaktionsgemisch her, wie im Textmanuskript beschrieben, und führen Sie einen Amplifikationszyklus durch. Führen Sie das Produkt auf einem Agarose-Gel auf 0,8 % TAE-Basis aus, um die Produktgröße von 25 71-Basenpaaren zu bestätigen, und reinigen Sie das Produkt dann mit einem Säulenreinigungskit, wie zuvor gezeigt. In 40 Mikroliter sterilem Wasser eluieren.
Um einen Überhang von drei Primzahlen A hinzuzufügen, fügen Sie 0,5 mikromolare DATP und eine Einheit Low-Fidelity-Taq-DNA-Polymerase hinzu und inkubieren Sie das gesamte PCR-Produkt bei 70 Grad Celsius für 30 Minuten zusammen mit 1X PCR-Puffer und 1,5 Millimolar Magnesiumchlorid. Reinigen Sie dann die Mischung mit einem Säulenreinigungskit. Stellen Sie die Ligationsreaktion ein und inkubieren Sie sie drei Stunden lang bei Raumtemperatur.
Geben Sie dann 100 Mikroliter Escherichia coli DH5-Alpha zur ligierten DNA und schocken Sie die Zellen 35 Sekunden lang bei 42 Grad Celsius. Der Zellsuspension wird ein Milliliter LB-Medium zugegeben und unter leichtem Schütteln eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubiert. Zentrifuge bei 13, 800 RCF.
Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie ihn in 200 Mikrolitern frischem LB-Medium. 100 Mikroliter der transformierten E.coli DH5-Alpha-Zellen auf eine LB-Platte mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin geben und 16 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Richten Sie Mini-Preps von 25 bis 30 Kolonien in fünf Millilitern LB-Medium mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin ein und lassen Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius wachsen.
Extrahieren Sie am nächsten Tag die Plasmide mit einem handelsüblichen Kit und führen Sie einen Restriktionsenzymverdau in einem Volumen von 10 Mikrolitern mit 200 Nanogramm der isolierten Plasmide, zwei Einheiten EcoR1 und 1X-Restriktionspuffer für alle Kolonien durch. Nachdem Sie die Aufschlussmischungen drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubiert haben, laden Sie die Produkte auf ein Agarose-Gel auf 0,8%TAE-Basis, um die Plasmid-DNA-Insertion zu bestätigen. Führen Sie eine Sanger-Sequenzierung der Plasmide von 25 positiven Klonen mit den empfohlenen Primern durch.
Einen Tag vor der Transfektion teilen Sie die Zellen und zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen mit einem Hämozytometer. Dann wird das menschliche Hepatom 7,5 Zellen in 35-Millimeter-Schalen in zwei Milliliter vollständigem DMEM ausgesät und die Zellen bei 37 Grad Celsius 16 Stunden lang in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid inkubiert. Am nächsten Tag wird der Transkriptlipidkomplex hergestellt, indem 10 Mikroliter Transfektionsreagenz in 50 Mikroliter des minimalen essentiellen Mediums verdünnt und fünf Mikrogramm virale Transkripte separat in 50 Mikrolitern des minimalen essentiellen Mediums verdünnt werden.
Beide Mischungen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Mischen Sie sie dann in einem einzigen sterilen Mikrozentrifugenröhrchen und inkubieren Sie die Mischung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie nach der Zellinkubation das Kulturmedium, waschen Sie die Zellen zweimal mit vorgewärmtem 1X PBS und fügen Sie 1,5 Milliliter des minimalen essentiellen Mediums hinzu.
Fügen Sie den Komplex langsam hinzu und schwenken Sie die Schale vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung zu erzielen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5%igem Kohlendioxid für 10 Stunden. Entfernen Sie dann das Medium.
Waschen Sie die transfizierten Zellen zweimal mit einem Milliliter vorgewärmtem 1X PBS und fügen Sie zwei Milliliter vollständiges DMEM hinzu. Isolieren Sie virale RNA aus 140 Mikrolitern Kulturüberständen mit einem viralen RNA-Isolierungskit. Richten Sie eine 10-Mikroliter-qRT-PCR-Reaktion mit einem handelsüblichen qRT-PCR-Kit ein.
Verwenden Sie die Vorwärts- und Rückwärts-Primer und Sonden für die HCV-RNA-Quantifizierung. Stellen Sie den Reaktionszyklus auf 48 Grad Celsius für 20 Minuten, 95 Grad Celsius für 10 Minuten und 45 Zyklen von 95 Grad Celsius für 15 Sekunden und 60 Grad Celsius für eine Minute ein. Führen Sie die Reaktionen aus, und richten Sie negative Kontrollen ein.
Parallel dazu wird eine Standardkurve mit einer zehnfach verdünnten seriell verdünnten bekannten Kopienzahl von HCV-Transkripten erstellt, um virale RNA zu quantifizieren. In dreifacher Ausführung ausführen. Platte mit 7,5 Zellen des menschlichen Hepatoms in einer 96-Well-Platte und Inkubation der Zellen bei 37 Grad Celsius in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator etwa 16 Stunden vor der Zugabe des Virus.
In einem Schrank der Biosicherheitsklasse II wird das Virus in Serie zehnfach verdünnt. Fügen Sie 100 Mikroliter des verdünnten Virus pro Vertiefung hinzu, um die Zellen zu infizieren, und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Nach drei Tagen werden die infizierten Zellen dreimal mit 0,1 Millilitern PBS gewaschen und mit 0,1 Millilitern eiskaltem Methanol bei minus 20 Grad Celsius für 20 Minuten fixiert und permeabilisiert.
Waschen Sie die Vertiefungen dreimal mit 1X PBS und dann 1X mit PBST. Nachdem Sie das PBST entfernt haben, blockieren Sie die Zellen für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 0,1 Millilitern 1 % BSA, die 0,2 % Magermilch in PBST enthalten. Entfernen Sie die blockierende Lösung und behandeln Sie die Zellen fünf Minuten lang mit 0,1 Millilitern 3%igem Wasserstoffperoxid, das in 1X PBS hergestellt wurde.
Waschen Sie die Zellen wieder zweimal mit 1X PBS und 1X mit PBST. Geben Sie 50 Mikroliter monoklonalen Anti-NS5A 9E10-Antikörper pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Vertiefungen dreimal mit 1X PBS und einmal mit PBST.
Geben Sie 50 Mikroliter HRP-konjugiertes sekundäres Ziegen-Anti-Maus-IgG pro Vertiefung hinzu, inkubieren Sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur und entfernen Sie dann den ungebundenen Antikörper, indem Sie die Vertiefungen mit 0,1 Millilitern 1X PBS waschen. Fügen Sie 30 Mikroliter DAB hinzu und inkubieren Sie die Platte mit leichtem Schaukeln 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die DAB-Lösung und waschen Sie die Vertiefungen zweimal mit 1X PBS und einmal mit destilliertem Wasser.
Fügen Sie 100 Mikroliter PBS mit 0,03% Natriumazid hinzu. Untersuchen Sie jede Vertiefung unter einem inversen Lichtmikroskop mit einem 10X-Objektiv. Zählen Sie die Anzahl der positiven Vertiefungen.
Verwenden Sie einen Reed- und Muench-Rechner, um die Endpunktverdünnung zu schätzen, die 50 % der Bohrlöcher infiziert. Lösen Sie Pibrentasvir, einen NS5A-Inhibitor, in 100%DMSO auf eine Konzentration von einem Millimolar auf und verdünnen Sie es weiter in vollständigem DMEM auf eine Konzentration von 10 Nanomolaren. Dann infizieren Sie naive Huh-7,5-Zellen bei 70%iger Konfluenz mit einer ML50-Virusdosis, um 50% der Zellen für 12 Stunden zu infizieren, und transferieren Sie die infizierten Zellen dann 24 Stunden nach der Infektion auf Sechs-Well-Platten.
1X EC50 PIB nach 16 Stunden Zellteilung zu den infizierten Zellen geben. Tun Sie dies nach jeder Zellteilung für sechs aufeinanderfolgende Passagen, gefolgt von drei medikamentenfreien Passagezyklen, und überwachen Sie die Virusausbreitung mit einem fokusbildenden Assay. Entnehmen Sie bei jeder Passage virale Überstände und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius.
Extrahieren Sie die virale RNA aus dem Überstand an Tag 18 und die synthetisierte cDNA. Amplifikation des NS5A-Gens mit fünf Mikrolitern verdünnter cDNA. Bestimmen Sie dann NS5A-Resistenzmutationen in sechs bis acht positiven bakteriellen Plasmiden mit den NS5A-Sequenzierungsprimern.
Vollständige Genommutantenbibliotheken wurden unter Verwendung von klonalem pJFH1 in abnehmenden Mengen von 100 bis 10 Nanogramm synthetisiert. Die durchschnittlichen Ausbeuten von ep-PCR-Produkten lagen zwischen 3,8 und 12,5 Nanogramm pro Mikroliter. Der Anteil der Mutationen in den Mutantenbibliotheken nahm mit abnehmendem Input von pJFH1 in der ep-PCR-Reaktion zu.
ML50, das mit 50 Nanogramm des Templates synthetisiert wurde, hatte vier Substitutionen pro 10.000 kopiertem Basenpaar, während ML25, das mit 25 Nanogramm Template synthetisiert wurde, neun Substitutionen enthielt. Es wurden keine Substitutionen innerhalb der Anzahl der sequenzierten Nukleotide in klonalem pJFH1 gefunden. ML50-Virusvarianten waren im Vergleich zum klonalen JFH1-Virus weniger anfällig für Pibrentasvir.
Von den acht NS5A-Klonen wiesen vier eine Kombination aus D7V+F28C auf, während V8A+F28C und F36L jeweils in einem Klon auftraten. Diese Mutationen befanden sich in der N-Terminus-Region von NS5A, von der bekannt ist, dass sie klinisch relevante NS5A-Resistenzmutationen beherbergt. Die Endkonzentration der einzelnen Komponenten der ep-PCR ist entscheidend, insbesondere die Template-Menge.
Das Fehlen von KB Extender reduziert die Ausbeute des ep-PCR-Produkts erheblich.
