Wir danken der StemCore-Einrichtung an der Monash University für die Bereitstellung von hESC-Linien und der FlowCore-Anlage an der Monash University für FACS-Dienstleistungen. Diese Arbeit wurde durch Forschungsstipendien des Australian Stem Cell Centre, des New South Wales and Victorian Government Stem Cell Research Grant Program to ALL unterstützt. ALL ist Partner Investigator der Australian Research Council (ARC) Special Research Initiative in Stem Cell Science, Stem Cells Australia.

Das folgende Protokoll wurde mit hESC-MEL111 Standard-Massenkulturen durchgeführt, die von der StemCore-Anlage an der Monash University (Melbourne) bereitgestellt wurden. Diese Zelllinie wird routinemäßig auf einer Schicht von mitotisch inaktivierten Maus-Embryonal-Fibroblasten (MEFs) in bFGF-ergänztem hESC/KOSR-Medium7 kultiviert und mit enzymatischer Dissoziation (Collagenase) alle 5-7 Tage8aufrechterhalten. hESC-Kulturen, die in 75 cm2 (T75) Kolben auf 80 % Konfluenz angebaut werden, werden als Eingangspopulationen für dieses Protokoll verwendet. Alle unten beschriebenen Zellmanipulationsverfahren sollten unter aseptischen Bedingungen in einem HEPA-gefilterten Biosicherheitsschrank der Klasse II durchgeführt werden.
Bereiten Sie zwei Tage vor der Durchführung eines TG30/GCTM-2 FACS-Assays die T75-Kulturplatten (beschrieben in Abschnitt 1) vor, die für die Rekultur von Nach FACS zurückgewonnenen Zellen verwendet werden sollen (siehe Abschnitt 4).
1. Aussaat von MEFs und Vorbereitung von MEF-konditioniertem Medium
1.1 TAG -2: Beschichtung von MEFs in T75-Flaschen
<ol><li>Pipette 10 ml 0,1% w/v Gelatine in jeden T75 Kolben und neigung zur gleichmäßigen Beschichtung oberfläche.</li>
	<li>30 min bei Raumtemperatur in einem Biosicherheitsschrank inkubieren.</li>
	<li>Aspirieren Gelatinelösung.</li>
	<li>20 ml MEF-Medium in den Kolben geben und in einem Zellkultur-Inkubator 30 min auf 37 °C/5%CO2 voraussetzen.</li>
	<li>Platte mitotisch inaktivierte MEFs auf vorbereiteten Kolben in den folgenden Dichten. Für 1/3 MEF Dichtesamen 1,4 x 104 Zellen/cm2 (T75= 1 x 106 MEFs). Für MEF-Saatgut mit voller Dichte 5,3 x 104 Zellen/cm2 (T75 = 4 x 106 MEFs).</li>
</ol>Hinweis: Wir verwenden routinemäßig MEFs, die durch γ-Bestrahlung mitotisch inaktiviert wurden. Ein Protokoll zur Herstellung γ bestrahlter MEFs finden Sie in Michalska12.
<ol start="6"><li>Inkubationsbestrahlte MEF-Kulturen bei 37 °C/5%CO2 über Nacht. Die 1/3-Flaschen können 1-4 Tage ohne MEF-Medium-Wechsel inkubiert werden. Diese Kolben werden zum Replatieren von Post-FACS-Zellen verwendet (wie in Protokoll 4). Volle MEF-Flaschen werden über Nacht inkubiert, um CM gemäß unten in Schritt 1.2 zu erzeugen.</li>
</ol>1.2 TAG -1: Vorbereitung des MEF-bedingten Mediums (CM)
<ol><li>Aspirieren MEF-medium aus VollmeF T75-Flaschen.</li>
	<li>Vorverwertte 25 ml hESC/KOSR-Medium mit 5 ng/ml HumanfGF-2 pro T75-Kolben ergänzen. Bei 37 °C/5% CO2 für 24 Stunden inkubieren.</li>
	<li>MEF-konditioniertes Medium (CM) in ein steriles Gewebekulturrohr zu sammeln, CM mit 10 ng/ml Human FGF-2 frisch zu ergänzen und mit einem 0,22 m Polyethersulfonfilter zu filtern.</li>
	<li>Um zusätzliche CM zu produzieren, wiederholen Sie die Schritte 1.2.2 und 1.2.3 täglich auf derselben MEF-Kultur für eine Woche.</li>
</ol>Ersetzen Sie am Tag der Durchführung eines TG30/GCTM-2-Assays MEF-medium in 1/3 MEF T75-Flaschen durch CM und vordem Ausgleich für mindestens 30 min, bevor Sie hESCs oder hESC-derivat-Derivatezellen aus dem verfahren wie unten beschrieben ensaatieren. CM wird entweder frisch verwendet oder bei 4 °C für bis zu 2 Wochen gelagert. CM wird in diesem Protokoll verwendet, da es in unseren Händen die Lebensfähigkeit der Zellen nach FACS im Vergleich zu nicht konditionierten Medien erhöht (Ergebnisse nicht gezeigt).
2. Durchführung eines TG30/GCTM-2 FACS-Assays: Dissoziation von hESC-Massenkulturen in Einzelzellen
Hinweis: Prechill 20% FBS/DMEM-F12 medium bei 4 °C.
<ol><li>Aspirieren Sie die hESC/KOSR-Medien aus zwei T75-Flaschen mit einer kultivierten hESC-Linie.</li>
	<li>Spülen Sie die Zellen in jedem T75 mit 10 ml DPBS und aspirieren zu entfernen.</li>
	<li>Fügen Sie 3 ml TrypLE Express Dissoziationslösung in jeden T75-Kolben ein. Bei 37 °C/5%CO2 für 5 min inkubieren.</li>
	<li>Bump die Seite der Kolben, um eine vollständige Auflösung der Zellen zu erhalten. Unter dem Mikroskop überprüfen. Wenn sich die Zellen nicht leicht lösen, brüten Sie weitere 2-3 min bei 37 °C/5%CO2.</li>
	<li>10 ml 20% FBS/DMEM-F12 (bei 4 °C gehalten) zu jedem T75-Kolben geben. Mit einer sterilen 10 ml Pipette trituieren die dissoziierten Zellen mehrmals gegen die Kolbenwand, um eine überwiegend einzellige Suspension zu erreichen.</li>
	<li>Legen Sie ein 70-m-Zellsieb auf ein 50 ml steriles Polypropylen-Rohr. Verwenden Sie eine sterile 10 ml Pipette, um die hESC Einzelzellensuspensionen zu erzwingen, die aus den beiden T75-Flaschen durch das Sieb gepoolt werden.</li>
	<li>Zellesieb entsorgen, den Rohrdeckel ersetzen und die gepoolte hESC-Aufhängung bei 1.000 x g für 2 min zentrieren.</li>
	<li>Überstand entsorgen und die Zellen waschen, indem Sie das Pellet in 10 ml 20% FBS/DMEM-F12 (bei 4 °C vorgechillt) sanft aufhängen.</li>
	<li>Führen Sie eine zweite Zentrifugation bei 1.000 x g für 2 min durch.</li>
	<li>Überstand entsorgen, 10 ml 20% FBS/DMEM-F12 (bei 4 °C vorgechillt) hinzufügen und sanft trituieren, um Zellen wieder aufzusetzen. Die 50 ml Tube auf Eis legen. Dieses Rohr wird für das unten beschriebene Sortierproben-Immunostaining-Verfahren verwendet. </li>
	<li>Nehmen Sie 20 l der hESC Einzelzellsuspension (Schritt 2.10) für die Zellzahlzählung mit einem Hemotozytometer. Sie sollten eine Ausbeute von 10-15 Millionen Zellen pro T75-Kolben erwarten.</li>
</ol>Hinweis: FBS wird in diesem Teil des Protokolls verwendet, um die Zelllebensfähigkeit nach FACS zu erhöhen.
3. ImmunfluoreszenzFärbung der Zelloberflächenantigene TG30 und GCTM-2
<ol><li>Aliquot 150 l (ca. 100.000 Zellen) einer hESC Einzelzellsuspension (ab Schritt 2.11) in jeweils sechs Mikrozentrifugenröhrchen von 1,5 ml. Diese sechs Aliquots werden für die Färbekontrollen verwendet, die erforderlich sind, um den Test auf der FACS-Maschine zu kalibrieren. Die verbleibende Zellsuspension mit 9 ml wird Ihre Sortierprobe sein, in der die dissoziierte Kultur für den Nachweis von TG30 und GCTM-2 gemäß den Tabellen 1 und 2gecostainiert wird.</li>
	<li>Führen Sie Bindungsreaktionen von primärantikörpern in 20% FBS/DMEM-F12 durch. Die Endreaktionsvolumina sollten für die Sortierprobe 9 ml und für die Kontrollen 200 ml betragen. Isotypsteuerelemente als primäre Antikörper einschließen. Rohre horizontal auf Eis legen und 30 min auf einer Schaukelplattform sanft mischen.</li>
	<li>Zentrifugen-Primärantikörperreaktionen bei 1.000 x g für 2 min.</li>
	<li>Überstand entsorgen und die Zellen waschen, indem Sie das Pellet in 20 ml 20% FBS/DMEM-F12 (bei 4 °C) für die Sortierprobe und 200 l für die Kontrollen wieder aufhängen.</li>
	<li>Führen Sie eine zweite Drehung bei 1.000 x g für 2 min.</li>
	<li>Führen Sie Bindungsreaktionen von sekundären Antikörpern in 20% FBS/DMEM-F12 durch. Die Endreaktionsvolumina sollten 2,5 ml für die Sortierprobe und 200 ml für die Kontrollen betragen. Bereiten Sie die PE-Anti-Maus CD90.2 Reaktionsröhre in diesem Stadium vor. Rohre horizontal auf Eis legen und 30 min auf einer Schaukelplattform sanft mischen.</li>
</ol>Hinweis: Während dieser Inkubationszeit ist es praktisch, CM zu sammeln und 1/3 MEF T75-Flaschen mit CM wie in Abschnitt 1.2 vorzubereiten.
<ol start="7"><li>Zentrifugen-Sekundärantikörperreaktionen bei 1.000 x g für 2 min.</li>
	<li>Überstand entsorgen und die Zellen TWICE waschen, indem Sie das Pellet in 20 ml 20% FBS/DMEM-F12 (bei 4 °C vorgechillt) für die Sortierprobe und 200 l für die Kontrollen wieder aufhängen.</li>
	<li>Führen Sie eine Drehung bei 1.000 x g für 2 min nach jedem Waschen und legen Sie Rohre auf Eis.</li>
	<li>Überstand entsorgen und Zellpellets in 20% FBS/DMEM-F12, ergänzt mit Propidiumjodid (PI) bei 0,3 g/ml, wieder aufsetzen. Verwenden Sie 2-3 ml für die Sortierprobe und 300 l für die Kontrollen.</li>
</ol>Hinweis: Fügen Sie dem Steuerrohr MIT unbefleckten Zellen NICHT PI hinzu.
<ol start="11"><li>Verwenden Sie eine P1000-Mikropipette, um jede einzelne Zellsuspension durch ein 35-m-Deckelzellsieb zu erzwingen, das an 5 ml Tube Polystyrol-Rundboden-Reagenzgläser gekoppelt ist.</li>
	<li>Zentrifuge bei 50 g/min, um durch die Restzellsuspension auf den Siebdeckeln zu erzwingen.</li>
	<li>Setzen Sie jede einzelne Zellsuspension durch Antippen der Seiten der Rohre aus und legen Sie sie auf Eis. Ihre Zellen sind jetzt bereit für FACS. Bitte fahren Sie sofort fort.</li>
</ol>4. Post-FACS-Kultur von TG30/GCTM-2 Unterbrechungszellen in 75 cm2 (T75) Flaschen
<ol><li>Wir haben bereits berichtet, wie man eine FACS-Maschine für TG30/GCTM-2 Immunprofiling7einrichtet. Das Verfahren ermöglicht die Wiederherstellung lebensfähiger einzeler HESCs, frei von MEFs, und innerhalb der Tore von P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg), P5 (TG30Low-GCTM-2Low), P6 (TG30Mid-GCTM-2Mid) und P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) - siehe Abbildung 1E. Richten Sie die FACS-Maschine für TG30/GCTM-2 FACS ein, wie in unserem vorherigen Bericht, um die als nächstes zu verwendenden Zellunterfraktionen wiederherzustellen.</li>
	<li>1 ml CM, wie in Schritt 1.2 zubereitet, zu je zwei 5 ml Polystyrol-Rundboden-Reagenzgläsern geben, bevor Zellen von der FACS-Maschine gesammelt werden. Auf Eis legen.</li>
	<li>Stellen Sie jeweils 400.000 Zellen aus differenzierten P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg) und pluripotenten P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) Zellsubfraktionen mit TG30/GCTM-2 FACS wieder her.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Sammelrohre bei 1.000 x g für 5 min.</li>
	<li>Aspirieren Sie die Überstand. Fügen Sie 1 ml vorgläsige 37 °C/5% CO2 CM hinzu, um jedes Zellpellet mit einem P1000-Mikropipettor wieder aufzuhängen. Säen Sie die Zellen für jede Fraktion auf einen vorausgeglichenen 1/3 MEF T75 Kolben mit CM (vorbereitet nach Schritt 1.2)</li>
	<li>Kultur bei 37 °C/5%CO2 für 24 Stunden in einem Zellkultur-Inkubator.</li>
	<li>ASpirieren Sie CM täglich und ersetzen Sie durch frisch zubereitete CM (wie in Schritt 1.2) für etwa zwei Wochen. Kulturen pluripotenter P7-Zellen (TG30Hi-GCTM-2Hi) zeigen nach einer Woche menschliche stammähnliche Kolonien und erreichen nach 9-11 Tagen eine Konfluenz von 80 %. Kulturen von P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg) Zellen wachsen meist als Rasen von fibroblastenähnlichen Zellen, die nach 11-13 Tagen die Konfluenz erreicht. In diesem Stadium können bei Bedarf P4- und P7-Zellkulturen für TG30/GCTM-2 FACS-vermittelte konsekutive Rekulturalon von P4- oder P7-Unterfraktionen verwendet werden (siehe Abbildungen 2 und 3).</li>
</ol>

<ol>
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Nichts zu verraten.

Im klinischen Kontext sind differenzierte somatische Zelltypen das endgewünschte Produkt für Transplantations- und Therapieanwendungen, und hPSC ist eine sich selbst erneuernde und skalierbare Quelle, um diese somatischen Zellen oder ihre Vorfahren im Labor zu erzeugen. Das Vorhandensein von verbleibenden undifferenzierten hESCs mit einem inhärenten Potenzial für die Teratombildung stellt ein Sicherheitsrisiko dar, wenn man hESC-abgeleitete somatische Zellen für die Transplantation bei Patienten in Betracht zieht. Eine Überprüfung dieser und anderer Risiken im Zusammenhang mit der Zelltherapie finden Sie unter Sharpe et al. 16 Um solche Anwendungen zu realisieren, ist es daher unerlässlich, dass die Forscher Zielzellpopulationen erzeugen wollen, die auch pluripotente Stammzellfrei sind. Zu diesem Zweck zeigen wir hier, dass es mit unserer TG30/GCTM-2 FACS-Methodik möglich ist, das Vorhandensein von pluripotenten Zellen (TG30Hi-GCTM-2Hi) in einer differenzierenden Zellpopulation zu überwachen und tragfähige hESC-differenzierte Derivate zu erhalten, die nach FACS angereichert und rekultiviert werden können. Obwohl es nicht möglich ist, 100% pluripotente Stammzellfreie Proben mit einem einzigen Durchlauf unseres Protokolls zu erhalten, können angereicherte hESC-Derivate rekultiviert werden und nach aufeinanderfolgender Passierung wird 100% somatische Zellreinheit erreicht. Die nachgewiesene Lebensfähigkeit somatischer Zellen für die Expansion nach FACS ermöglicht möglicherweise auch die Produktion einer ausreichenden Anzahl von Zellen, die für potenzielle Transplantationstherapien geeignet sind.
Die ermutigenden Ergebnisse dieser Pilotstudie veranlassten uns, eine umfassendere Untersuchung mit unserem TG30/GCTM-2-Protokoll in einer vergleichenden Studie mit mehreren humaninduzierten pluripotenten Stammzelllinien (hiPSC)15durchzuführen. In dieser Studie fanden wir heraus, dass pluripotente Stammzellfreie Proben, die mit unserem TG30/GCTM-2 FACS-Protokoll gewonnen wurden, bei der Transplantation in immunbenachteiligte Mäuse keine Teratome erzeugten. Daher können wir getrost feststellen, dass mit der Verwendung dieses In-vitro-Protokolls, Frühstadium Differenzierung Zellkulturen bestimmt frei von pluripotenten TG30Hi-GCTM-2Hi-Zellen entwickeln teratomas in vivo. Dies unterstützt nachdrücklich die Robustheit unseres Assays und bietet einen potenziellen Ansatz, um das Risiko einer Teratombildung vor der Verwendung von hPSC-abgeleiteten Zellen in klinischen Anwendungen zu eliminieren.
Umgekehrt zeigen wir auch, dass der TG30/GCTM-2 FACS-Assay verwendet werden kann, um eine pluripotente Zellpopulation mit hohem Expressioniergrad dieser beiden Oberflächenantigene (TG30Hi-GCTM-2Hi) abzurufen. Frühere Studien haben gezeigt, dass TG30Hi-GCTM-2Hi-Zellen die höchste Korrelation mit OCT4hi Expression aufweisen und die höchste Anzahl von hESC-ähnlichen Kolonien5,6,13,15bilden. Wir gehen daher davon aus, dass das Pluripotenznetzwerk in TG30Hi-GCTM-2 Hi-Exemittenzellen auf seinen Höchstwerten aktiviert ist. Wir sind der Ansicht, dass die Verwendung unserer TG30/GCTM-2 FACS-Protokolle und das Abrufen von P7-Zellen (TG30Hi-GCTM-2Hi) eine großflächige Reinigung von angereicherten lebenden hESC-Kulturen als Inputs für Differenzierungstests ermöglichen könnte.
Zusammenfassend zeigen wir hier die Potenzialität unserer FACS-Assays basierend auf der kombinierten Expression der Oberflächenantigene TG30 und GCTM-2 sowohl für die Reinigung als auch für die Anreicherung von hESCs. Zukünftige Studien mit Protokollen zur gezielten Differenzierung von hPSCs dürften auch in Bezug auf diese Potenzialität informativ sein. Wir sind uns bewusst, dass in einigen Assays, in denen differenzierte hESC-Derivate vorübergehend TG30 (CD9) oder GCTM-2 ausdrücken, diese beiden Antikörper möglicherweise nicht geeignet oder ausreichend sind, um pluripotente Zellen zu einem bestimmten Zeitpunkt im Test6aus einer differenzierten Population zu säubern. Daher besteht die ständige Notwendigkeit, neuartige Antikörper zu finden, die lebende hESCs spezifisch erkennen, um die mögliche Begrenzung der Kreuzreaktion mit einigen differenzierten Zelltypen zu überwinden.

HPSC (hPSC) umfassen menschliche embryonale Stammzellen (hESC) und humaninduzierte pluripotente Stammzellen (hIPSC). HPSC kann sich unter geeigneten Kulturbedingungen auf unbestimmte Zeit erneuern, ohne seine Fähigkeit zu verlieren, die als "Pluripotenz" bekannt ist. Pluripotenz ist definiert als das Potenzial für eine Zelle, sich in im Wesentlichen jede somatische Zelllinie zu unterscheiden, einschließlich Zellen, die für jede der drei embryonalen Keimzellschichten repräsentativ sind. Das bemerkenswerte Potenzial von hPSC bietet ein Mittel für eine Vielzahl von zellbasierten Anwendungen, einschließlich therapeutischer Optionen. Zum Beispiel gibt es Erkrankungen mit Zelltod und Degeneration, bei denen die normale Funktionsfähigkeit von Zellen im menschlichen Körper beeinträchtigt ist, wie bei Herzinsuffizienz, Wirbelsäulenverletzungen, Diabetes, Parkinson-Krankheit, einigen Krebsarten und anderen klinischen Pathologien. Patienten, die unter diesen Erkrankungen leiden, könnten möglicherweise durch Transplantation gesunder und funktioneller somatischer Zellen behandelt werden, die aus hPSC im Labor abgeleitet wurden. Die aktuellen hPSC-Differenzierungsprotokolle sind jedoch nicht 100% effizient und ergeben eine Mischung aus differenzierten Ziel- und Off-Target-Zelltypen sowie Rest-hPSCs, die keiner Differenzierung unterzogen wurden, sondern erneuern sich weiterselbst 1-3. Das Vorhandensein einer kleinen Anzahl von hPSC in einer Probe von hPSC-abgeleiteten somatischen Zellen, die für die Transplantation in Patienten bestimmt sind, stellt ein ernstes klinisches Risiko dar, da diese Zellen aufgrund ihrer inhärenten Natur Gewebe aller drei embryonalen Keimschichten bilden könnten, potenziell in vivo eine Art von Tumor bilden könnten, der als Teratom bekannt ist. Daher können nur Zielzellpopulationen, die als frei von pluripotenten Stammzellen bestimmt sind, als sicher für die Transplantation bei Patienten angesehen werden. Es gibt mehrere Ansätze, um möglicherweise die Reinigung von Rest-HPSCs nach Differenzierung zu erreichen (zur Überprüfung siehe Polanco und Laslett4). Wir haben bereits über die Verwendung der monoklonalen Antikörper TG30 (CD9) und GCTM-2 gekoppelt an fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) berichtet, um pluripotente Stammzellen zu identifizieren und sie von Zellen zu unterscheiden, die sich einem frühen Stadium der Differenzierung in Kulturen derhESC-Linien 5-7unterziehen.
Ein Vorteil der Verwendung von Antikörpern zum Nachweis von Zelloberflächenantigenen besteht darin, dass die Zielzellen nach der Antikörperbindung und/oder Etikettierung in der Regel lebensfähig sind. Daher können Zielzellen nach der Antikörperkennzeichnung gesammelt und für Erweiterungen und weitere Anwendungen vor der Transplantation rekultiviert werden. Eine Einschränkung für Zelloberflächenantigene, die auf hPSC exprimiert werden, ist, dass sie nicht ausschließlich für das pluripotente Stadium gelten und in vielen Fällen während der Entwicklung zeitlich neu ausgedrückt werden und daher in einigen differenzierten Zelltypen nachgewiesen werden. Wenn es daher darum geht, Antikörper zu verwenden, um menschliche pluripotente Zellen zu erkennen und sie aus einer Probe von hPSC-abgeleiteten Zellen zu säubern, sollten ausgewählte Antikörper nicht auch mit Antigenen auf die spezifischen differenzierten Zelltypen reagieren, die für die Transplantation bestimmt sind. Leider gibt es eine begrenzte Anzahl von Antikörpern, die Zelloberflächenmarker auf Live-hPSCs 4erkennen, wodurch die Auswahlmöglichkeiten eingeschränkt sind. Darüber hinaus haben einige Studien darauf hingewiesen, dass der Nachweis eines einzelnen Zell-Oberflächen-Markers nicht ausreicht, um alle hPSC zu eliminieren, was darauf hindeutet, dass jeder Versuch, alle pluripotenten Subpopulationen von hPSC zu beseitigen, sich auf Methoden stützen sollte, die zwei oder mehr Antikörper verwenden, die verschiedene Epitope erkennen, die durch hPSCs 9-10ausgedrückt werden. Wie bereits erwähnt, sind nur hPSC-abgeleitete Zellen, die als pluripotente Stammzellfreie Zellpopulationen bestimmt werden könnten, für eine menschliche Transplantation geeignet. Das Erreichen dieses Stringenzniveaus kann nicht mit einem einzigen Durchgang durch eine antikörpervermittelte Zellsortiertechnologie erreicht werden. Eine Rekulturierung der angereicherten Population differenzierter Zielzellen und nachfolgende Zellsortierungsrunden können erforderlich sein, um endgültig pluripotente stammzellfreie Proben zu erhalten.
In unserem Labor haben wir zwei hES-Zell-Oberflächen-Antikörper, TG30 (CD9) und GCTM-2, für den Nachweis lebender pluripotenter Zellen extensiv charakterisiert. Unsere Studien haben gezeigt, dass der kombinierte Nachweis von TG30 und GCTM-2 stark mit der Expression kanonischer Pluripotenzassoziierter Gene in den hESC-Linien 5-7korreliert. TG30/GCTM-2 FACS Immunprofiling hat immer wieder gezeigt, dass hESC-Kulturen einen quantitativen kontinuierlichen Gradienten des TG30/GCTM-2-Expressions 5-7darstellen. Wir haben willkürlich vier Populationen (P) von Zellen innerhalb dieses TG30/GCTM-2 Gradienten etabliert: P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg), P5 (TG30Low-GCTM-2Low), P6 (TG30Mid-GCTM-2Mid) und P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) 5-7. Unsere Charakterisierung dieser P4-, P5-, P6- und P7-Zellpopulationen hat gezeigt, dass die P6- und P7-Unterfraktionen eine große Anzahl von pluripotenzassoziierten Genen ausdrücken und effizient stammähnliche Kolonien bilden, wenn sie nach FACS 2-3rekultiviert werden. Andererseits exprimieren P4-Zellen (TG30Neg-GCTM-2Neg) eine große Anzahl von Differenzierungsmarkern und bilden die spontan differenzierten Zelltypen, die typischerweise in expandierenden Kulturen der hESC-Linien 5-6vorkommen. Wir haben beschlossen, die Potenzialität unserer TG30/GCTM-2 FACS für die selektive Eliminierung von ResthPSC nach früherdischer Differenzierung und auch für die Anreicherung pluripotenter Stammzellpopulationen zu testen. Das unten beschriebene Protokoll zeigt, wie man differenzierte P4 -Zellen (TG30Neg-GCTM-2Neg) nach FACS sammelt und rekultiviert, um die Reinigung von pluripotentem P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) zu erreichen. Darüber hinaus erklären wir auch die Sammlung und Rekultur von pluripotenten P7-Zellen (TG30Hi-GCTM-2Hi), um eine angereicherte Kultur pluripotenter Zellen zu erhalten, die anschließend als definierte Inputpopulation verwendet werden könnten, um die Effizienz und Konsistenz von Differenzierungstests potenziell zu erhöhen.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Short Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Long Name </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11320082</td>
			<td>Long Name: Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOSR</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10828028</td>
			<td>Long Name: Knockout Serum Replacement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Long Name: GlutaMAX supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonessential Amino Acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Long Name: MEM Nonessential Amino Acids Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985023</td>
			<td>Long Name: 2-Mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190250</td>
			<td>Long Name: Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline, no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12604039</td>
			<td>Long Name: TrypLE Express (1x), no Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF-488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21131</td>
			<td>Long Name: Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF-647</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21238</td>
			<td>Long Name: Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-anti IgG2a</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P21139</td>
			<td>Long Name: R-Phycoerythrin Goat Anti-Mouse IgG2a (&#947;2a) Conjugate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>Long Name: Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium, high glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Long Name: Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15230-089.</td>
			<td>Long Name: Sterile Distilled Water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4864</td>
			<td>Long Name: Propidium iodide solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>12203C</td>
			<td>Long Name: Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G-1890</td>
			<td>Long Name: Gelatin from porcine skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GF003AF-100UG</td>
			<td>Long Name: Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter 0.22 &#956;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU02RE</td>
			<td>Long Name: Stericup-GP, 0.22 &#956;m, polyethersulfone, 250 ml, radio-sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352350</td>
			<td>Long Name: Cell strainer with 70 &#956;m Nylon mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 &#956;m Lid cell strainer, 5 ml tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352235</td>
			<td>Long Name: 5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 &#956;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Polystyrene round bottom test tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352054</td>
			<td>Long Name: 5 ml polystyrene round bottom test tube, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG2a Isotype Control</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>554126</td>
			<td>Long Name: Purified Mouse IgG2a, &#954; Isotype Control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM Isotype Control</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>553472</td>
			<td>Long Name: Purified Mouse IgM, &#954; Isotype Control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CD90.2</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>553014</td>
			<td>Long Name: PE Rat Anti-Mouse CD90.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-peaks calibration</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>559123</td>
			<td>Long Name: Rainbow Calibration Particles (8 peaks)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml sterile Polypropylene tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td>Long Name: 50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>658175</td>
			<td>Long Name: CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TG30</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB4427</td>
			<td>Long Name: TG30 Antibody, clone TG30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCTM-2</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB4346</td>
			<td>Long Name: GCTM-2 is not commercially available but TG343 and equivalent monoclonal antibody is</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 4. List of materials and reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS machine</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>FACSVantage SE with FACSDiva option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>IX71</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 5. List of equipment.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment and purging of human embryonic stem cells by detection of cell surface antigens using the monoclonal antibodies tg30 and gctm-2

Menschliche embryonale Stammzellen (hESC) können sich in vitrounbegrenzt selbst erneuern und mit den entsprechenden Hinweisen induziert werden, um sich in potenziell alle somatischen Zelllinien zu differenzieren. Differenzierte hESC-Derivate können möglicherweise in Transplantationstherapien zur Behandlung einer Vielzahl von zelldegenerativen Erkrankungen eingesetzt werden. HESC-Differenzierungsprotokolle ergeben jedoch in der Regel eine Mischung aus differenzierten Ziel- und Off-Target-Zelltypen sowie verbleibenden undifferenzierten Zellen. Für die Übersetzung differenzierter hESC-Derivate aus dem Labor in die Klinik ist es wichtig, zwischen undifferenzierten (pluripotenten) und differenzierten Zellen unterscheiden zu können und Methoden zur Trennung dieser Populationen zu generieren. Die sichere Anwendung von hESC-abgeleiteten somatischen Zelltypen kann nur mit pluripotenten Stammzellfreien Populationen erreicht werden, da Rest-HESCs nach der Transplantation Tumoren induzieren könnten, die als Teratome bekannt sind. Zu diesem Zweck beschreiben wir hier eine Methodik zum Nachweis von pluripotenten TG30 Hi-GCTM-2 Hi hESCs mit positiver Selektion mit pluripotenten TG30Hi-GCTM-2Hi hESCs. Mit Hilfe der negativen Selektion mit unserer TG30/GCTM-2 FACS-Methodik konnten wir undifferenzierte hESCs in Populationen erkennen und säubern, die sehr früh gedifferenzierung erfahren (TG30Neg-GCTM-2Neg). In einer weiteren Studie bildeten pluripotente StammzellfreieProben von differenzierten TG30 Neg-GCTM-2Neg-Zellen, die mit unserem TG30/GCTM-2 FACS-Protokoll ausgewählt wurden, keine Teratome, sobald sie in immungeschwächte Mäuse transplantiert wurden, was die Robustheit unseres Protokolls unterstützt. Auf der anderen Seite, TG30/ GCTM-2 FACS-vermittelte konsekutige Konsekutive TG30Hi-GCTM-2Hi hESCs beeinträchtigte nicht ihre Fähigkeit, sich in vitro selbst zu erneuern oder ihre intrinsische Pluripotenz. Daher bieten die Eigenschaften unserer TG30/GCTM-2 FACS-Methodik einen empfindlichen Test, um hoch angereicherte HPSC-Populationen als Inputs für Differenzierungstests zu erhalten und potenziell tumorigenic (oder Rest-) hESC von abgeleiteten Zellpopulationen zu befreien.

hESC-Derivate, die pluripotente Stammzellfrei sind, können durch konsekutives Passieren von Zellen aus der P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg) Subfraktion erhalten werden.
Frühere Berichte haben festgestellt, dass in hESC-Standardkulturen eine Mischung von Subpopulationen koexistiert, die einen Expressionsgradienten von Genen aufweisen, die mit Pluripotenz assoziiert sind5,6,13. Der kombinierte Nachweis von Zelloberflächenantigenen wie TG30 (CD9) und GCTM-2 ermöglicht die Diskriminierung einer Reihe von Teilmengen von Zellen im pluripotenten Stadium und in verschiedenen Stadien der frühen Differenzierung, wie ihre Expression von Stammzellmarkern und linienspezifischen Transkriptionsfaktoren5,6,13anzeigt. In Übereinstimmung mit früheren Berichten konnten wir P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg), P5 (TG30Low-GCTM-2Low), P6 (TG30Mid-GCTM-2Mid) und P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) Zellen in der hESC-MEL1-Linie für diese Studie(Abbildung 1) unterscheiden. Mit diesem Ergebnis sammelten wir differenzierte P4-Zellen (TG30Neg-GCTM-2Neg) und pluripotente P7-Zellen (TG30Hi-GCTM-2Hi) für weitere Kultur in den unten beschriebenen Studien.
Wir untersuchten, ob wir mit einem negativen Selektionsansatz undifferenzierte hESCs von Zellpopulationen säubern könnten, die sehr früh in der Differenzierung unterzogen werden (TG30Neg-GCTM-2Neg). Wir verwendeten eine definierte Anzahl von P4-Zellen (TG30Neg-GCTM-2Neg), die nacheinander nach FACS (Abbildung 2A) für etwa zwei Wochen kultiviert wurden, und analysierten mit TG30/GCTM-2 FACS, bevor sie an jeder Passage replatiert wurden. Die Ergebnisse zeigten, dass die p4-Subfraktion, angereichert für TG30Neg-GCTM-2Neg differenzierte Zelltypen nach aufeinanderfolgenden Passaging, und eine geringfügige Anwesenheit von P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) Zellen in der Ersten Passage (Abbildung 2A, Passage 1) verschwand schließlich nach weiteren Passaging und wurde zu pluripotenten Stammzellen-freien Proben (Abbildung 2A, Passage 3).
Die Anreicherung pluripotenter hESC-Zellen kann durch die Entnahme von Zellen TG30Hi-GCTM-2Hi-Zellen erreicht werden.
Basierend auf früheren Beobachtungen, die diesen Test verwenden, würden wir eine Anreicherung von pluripotenten hESCs erwarten, indem wir P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) Zellen sammeln, die hESC-Kolonien bilden sollten. Daher haben wir auch TG30/GCTM-2 FACS-vermittelte konsekutige Durchblutung von pluripotenten P7 -Zellen (TG30Hi-GCTM-2Hi) untersucht. In diesen P7-Kulturen wurde die TG30/GCTM-2 FACS-Immunoprofilierung vor der Replatierung von Zellen an jedem Durchgang durchgeführt und nur P7-Zellen (TG30Hi-GCTM-2Hi) rekultiviert. Auf diese Weise beobachteten wir, dass die Mehrheit der Zellen in den Subfraktionen im Zusammenhang mit Pluripotenz (P6 und P7) lagen, was auf eine Anreicherung von pluripotenten Zellen hindeutet, die auch die Fähigkeit zur Differenzierung und Generierung eines kleinen Prozentsatzes von P4 -TG30 Neg-GCTM-2Neg)Zellen aufrechterhielten (Abbildung 3A). Darüber hinaus zeigten Kulturen von P7-Zellen eine große Anzahl von hESC-ähnlichen Kolonien während der Passierung (Abbildung 3B), was auch auf die Aufrechterhaltung des Pluripotenzzustands hindeutet.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50856/50856fig1.jpg"> Abbildung 1. Repräsentative Sortierstrategie, um TG30/GCTM-2 FACS-Subfraktionen zu erhalten. (A): Dissoziierte hES-Zellsuspensionen werden als Einzelzellen sortiert und potenzielle Klumpen oder Doublets mit der Vorwärtsstreuung für Höhe und Fläche (FSC-H und FSC-A) abgegrenzt. (B): Potenzielle Trümmer werden mit FSC-A und SSC-A entfernt, und nur intakte Zellen werden weiter sortiert. (C): Nicht lebensfähige Zellen sind aufgrund von Propidiumjodid (PI) Fluoreszenz (FSC-A und FL3-A) ausgeschlossen. (D): MEF-Feederzellen wurden durch negative Selektion basierend auf der Expression von Maus-CD90.2-PE (FL2-A und SSC-A) abgegrenzt. (E): Die isolierte lebensfähige hESC-Fraktion, frei von MEF-Feedern, wird schließlich in P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg), P5 (TG30Low-GCTM-2Low), P6 (TG30Mid-GCTM-2Mid) und P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) Subpopulationen zerlegt. Das negative Gate (TG30Neg-GCTM-2Neg, genannt P4) wurde entsprechend der Hintergrund-Autofluoreszenz für die ungefärbten Zellen und auch für Isotyp-Kontrollen eingestellt. (F): Prozentsätze der verschiedenen Gated-Subpopulationen, die typisch für eine TG30/GCTM-2-Flow-Zytometrie-Analyse sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50856/50856fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5.75in" src="/files/ftp_upload/50856/50856fig2.jpg"> Abbildung 2. Repräsentative aufeinanderfolgende Kulturen spontan differenzierter P4-Zellen (TG30Neg-GCTM-2Neg) aus der hESC-MEL1-Linie. (A): Repräsentative TG30/GCTM-2 FACS-Plots, die gated subsets von Zellen (P4, P5, P6 und P7) zeigen, die durch den Grad der nachgewiesenen Expression von TG30- und GCTM-2-Zelloberflächenmarkern diskriminiert werden. Eine anfängliche Population von 400.000 hESC-Derivaten mit P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg) Immunoprofiling wird aus Massenkulturen der hESC-MEL1-Linie gesammelt. Diese P4 -(TG30Neg-GCTM-2Neg) Zellen werden nacheinander nach FACS unter Bedingungen, die für die hESC-Erneuerung in T75-Flaschen unterstützen, bis zum Erreichen der Konfluenz (11-13 Tage) durchgesieflimmert. Vor jeder Passage wird TG30/GCTM-2 FACS durchgeführt, um nur die p4 (TG30Neg-GCTM-2Neg) differenzierten Zelltypen zu sammeln und zu rekulturieren. (B): Typische Morphologie des Rasens von differenzierten P4 -TG30Neg-GCTM-2Neg) Zellen nach 14 Tagen. (C): Sporadische hESC-ähnliche Kolonien, die nach 14 Tagen gesehen werden, vermischt mit dem Rasen von P4 -TG30Neg-GCTM-2Neg)Zellen nur in Durchgang 1, werden höchstwahrscheinlich durch kontaminierende P7 -Zellen (TG30Hi-GCTM-2Hi) erzeugt. Skalenbalken = 200 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50856/50856fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5.75in" src="/files/ftp_upload/50856/50856fig3.jpg"> Abbildung 3. P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) Zellen, die aus hESC-Linien abgeleitet sind, können nacheinander nach FACS durchgehend durchgehend werden, ohne ihre intrinsischen pluripotenten Eigenschaften zu verlieren. Vertreter TG30/GCTM-2 FACS-Immunoprofilierung der verschiedenen aufeinanderfolgenden Passagen, die die diskriminierten Teilmengen von Zellen (P4, P5, P6 und P7) nach dem Expressionsgrad von TG30 und GCTM-2 zeigen. (A): Eine Startpopulation von 400.000 Zellen mit P7-Eigenschaften (TG30Hi-GCTM-2Hi) wird aus Massenkulturen der hESC-MEL1-Linie abgerufen. Pluripotente P7-Zellen (TG30Hi-GCTM-2Hi) werden nacheinander nach FACS unter Bedingungen durchgesieht, die für die hESC-Erneuerung in T75-Flaschen unterstützen, bis sie eine Konfluenz von 80 % erreichen (9-11 Tage). TG30/GCTM-2 FACS Immunprofilierung wird vor der Replatierung von Zellen an jedem Durchgang durchgeführt und nur die P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) Zellen werden rekultiviert. Die Ergebnisse zeigen, dass P7-Zellen (TG30Hi-GCTM-2Hi) ihre pluripotenten Eigenschaften mit anschließender Passaging erhalten, einschließlich der Konservierung des (TG30Hi-GCTM-2Hi) Ausdrucks, die hESC-ähnliche Kolonien bilden (siehe B) und die Fähigkeit zur Differenzierung beibehalten, wie aus der Rekapitulation eines kleinen Bruchteils des differenzierten P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)in jedem der FACS abgeleitet werden kann. Skalenbalken = 200 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50856/50856fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>Probe (Reaktionsvolumen)</td>
			<td>Primärer Antikörper</td>
			<td>Sekundärer Antikörper</td>
			<td>PE Ratte Anti-Maus CD90.2 b</td>
			<td>Propidium Iodid c</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sortierprobe (ca. 9 ml für primäre ABs, 2,5 ml für sekundäre ABs)</td>
			<td>(TG30 + GCTM-2) a
</td>
			<td>AF 488 Ziege Anti-Maus IgG2a + AF 647 Ziege Anti-Maus IgM</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Steuerung-1: TG30 (200 l)</td>
			<td>TG30</td>
			<td>AF 488 Ziege Anti-Maus IgG2a</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Steuerung-2: GCTM-2 (200 l)</td>
			<td>GCTM-2</td>
			<td>AF 647 Ziege Anti-Maus IgM</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Steuerung-3: Anti-Maus-CD90.2 (200 l)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Steuerung-4: Phycoerythrin (PE) (200 l)</td>
			<td>Maus IgG2a Isotyp</td>
			<td>R-Phycoerythrin Ziege Anti-Maus IgG2a</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Steuerung-5: Maus-Immunglobulin-Isotyp (200 l)</td>
			<td>Maus IgG2a Isotyp + IgM-Isotyp</td>
			<td>AF 488 Ziege Anti-Maus IgG2a + AF 647 Ziege Anti-Maus IgM</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Steuerung-6: Ungefärbte Zellen (200 l)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1. Sortieren Sie Beispiel und Steuerelemente für die FACS-Sortierung. a Die Sortierprobe wird gleichzeitig mit TG30- und GCTM-2-Antikörpern immunstainiert. b PE-anti-mouse CD90.2 wird verwendet, um Mauszellen zu erkennen und MEFs von hESCs während FACS14zu entfernen. c Nicht lebensfähige Zellen sind mit Propidiumjodid in einer Endkonzentration von 0,3 g/ml ausgeschlossen. Reagenz hinzugefügt (+), nicht (-) zu Reaktionsrohr hinzugefügt.
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>Antikörper </td>
			<td>Host</td>
			<td>Isotyp</td>
			<td>Arbeitsverdünnung</td>
		</tr>
<tr>
<td>TG30 (1,4 mg/ml)</td>
			<td>Maus</td>
			<td>IgG2a</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
<tr>
<td>GCTM-2 (Hybridonotant)</td>
			<td>Maus</td>
			<td>Igm</td>
			<td>1:5 bis 1:10 a
</td>
		</tr>
<tr>
<td>AF 488 Ziege Anti-Maus IgG2a</td>
			<td>Ziege</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>AF 647 Ziege Anti-Maus IgM</td>
			<td>Ziege</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Phycoerythrin (PE) Ziege Anti-Maus IgG2a</td>
			<td>Ziege</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-Maus-CD90.2</td>
			<td>Ratte</td>
			<td>IgG2b</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gereinigte Maus IgG2a, Isotype-Steuerung</td>
			<td>Maus</td>
			<td>IgG2a</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gereinigte Maus IgM, Isotype Control</td>
			<td>Maus</td>
			<td>Igm</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2. Antikörperdetails und Verdünnungen für die FACS-Sortierung. a Aufgrund der extrem hohen Expression von GCTM-2 auf der Zelloberfläche von hESCs ist es nicht möglich, mit diesem Antikörper eine Sättigung zu erreichen. Jede Charge des GCTM-2-Hybridom-Überstandes muss mit einer Standardkontrolle oder einer früheren Charge titriert werden, um ähnliche Ergebnisse mit hESCs in der Skala zu erzielen und eine Überfärbung zu vermeiden.
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>Name des Mediums</td>
			<td>Zusammensetzung</td>
		</tr>
<tr>
<td>hESC/KOSR mittel</td>
			<td>Dulbecco es Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) ergänzt durch 20% Knockout Serum Replacement (KOSR), 2 mM GlutaMAX, 1% MEM Nonessential Amino Acids, 0.1 mM 2-Mercaptoethanol, 10 ng/ml humaner Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF-2) und Pen/Strep bei 1x.</td>
		</tr>
<tr>
<td>MEF mittel</td>
			<td>Dulbecco es Modified Eagle Medium, High Glucose (DMEM) ergänzt durch 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 2 mM GlutaMAX und Pen/Strep bei 1x.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 3. Zusammensetzung der Kulturmedien.

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Enrichment and Purging of Human Embryonic Stem Cells by Detection of Cell Surface Antigens Using the Monoclonal Antibodies TG30 and GCTM-2

Wir beschreiben die Verwendung der monoklonalen Antikörper TG30 (CD9) und GCTM-2 zum kombinierten Nachweis von Zelloberflächenantigenen mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) zur Identifizierung und Anreicherung lebender menschlicher embryonaler Stammzellen (hESC) mit positiver Selektion und auch zur Verwendung negativer Selektion zur Reinigung von hESCs aus einer gemischten Zellpopulation.

Anreicherung und Reinigung menschlicher embryonaler Stammzellen durch Nachweis von Zelloberflächenantigenen unter Verwendung der monoklonalen Antikörper TG30 und GCTM-2

Human embryonic stem cells (hESC) can self-renew indefinitely in vitro, and with the appropriate cues can be induced to differentiate into potentially all ...

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Unit 1

Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

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7.7K Aufrufe.  CSIRO. Wir beschreiben die Verwendung der monoklonalen Antikörper TG30 (CD9) und GCTM-2 zum kombinierten Nachweis von Zelloberflächenantigenen mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) zur Identifizierung und Anreicherung lebender menschlicher embryonaler Stammzellen (hESC) mit positiver Selektion und auch zur Verwendung negativer Selektion zur Reinigung von hESCs aus einer gemischten Zellpopulation.

Serie: Enrichment and Purging of Human Embryonic Stem Cells by Detection of Cell Surface Antigens Using the Monoclonal Antibodies TG30 and GCTM-2

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Vermehrung von humanen embryonalen Stammzellen (ES-Zellen)

Forschung

Biologie

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Ableitung von hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Patterning of Embryonic Stem Cells Using the Bio Flip Chip

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such as tumor growth, stem cell differentiation, and stem cell self-renewal. A number of methods currently exist to modulate cell signaling in vitro. One method of modulating the total amount of diffusible signaling is to vary the cell seeding density during culture. Due to the random nature of cell seeding, this results in considerable variation in the actual cell-cell spacing and amount of cell-cell contact, and cannot prescribe the local environment. A more specific approach for modulating cell signaling is to use molecular inhibitors or genetic approaches to knock down specific signaling proteins, but both of these methods are best suited to manipulating small numbers of molecules. Here, we demonstrate a new approach to modulating cell-cell signaling that modulates the local environment of a cluster of cells by placing different numbers of cells at desired locations on a substrate. This method provides a complementary way to control the local diffusible and juxtacrine signaling between cells. Our method makes use of the Bio Flip Chip (BFC), a microfabricated silicone chip containing hundreds-to-thousands of microwells, each sized to hold either a single cell or small numbers of cells. We load the chip with cells simply by pipetting them onto the array of wells and washing unloaded cells off the array. The chip is then flipped onto a substrate, whereby the cells fall out of the wells and onto the substrate, maintaining their patterning. After the cells have attached, the chip can be removed (or left on). This approach to cell patterning is unique in that it: 1) doesn't alter the chemistry of the substrate, thus allowing cells to proliferate and migrate; 2) allows patterning onto any substrate, including tissue-culture polystyrene, glass, matrigel, and even feeder cell layers; and 3) is compatible with traditional microcontact printing, allowing the creation of extracellular matrix islands with cells placed inside those islands. In this video, we demonstrate the patterning of mouse embryonic stem cells onto tissue-culture polystyrene using the BFC.

We demonstrate a simple method for placing cells at desired locations on a substrate. This method patterns cells by flipping a silicone chip containing microwells filled with cells onto the substrate. This method provides a new way to modulate diffusible and juxtacrine signaling between cells.

Strukturierung von embryonalen Stammzellen mit dem Bio Flip Chip

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Gewinnung menschlicher embryonaler Stammzellen durch Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

Kultur und Wartung von humanen embryonalen Stammzellen

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Einfrieren und Auftauen humanen embryonalen Stammzellen

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

Isolation und Ableitung von embryonalen Maus-Keimzellen

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

Video bioinformatischen Analyse von humanen embryonalen Stammzellen Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

Differenzierung von embryonalen Stammzellen in Oligodendrozyten Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.