Dieses Protokoll verwendet eine weit verbreitete Technik zusammen mit Reagenzien und Werkzeugen, die kommerziell erworben werden können, um die endogene IRF5-Aktivierung während der frühen Ereignisse der Stimulation zu bewerten. Es kann leicht für die Prüfung der IRF5-Biologie in anderen zellulären Kontext angewendet werden. Obwohl native PAGE eine weit verbreitete Technik ist, kann es technisch schwierig sein, klare, robuste, interpretierbare und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen.
Die Verwendung eines kommerziellen Laufpuffer- und Gelsystems trägt zur Minimierung der Variabilität bei. Und die Aufmerksamkeit auf Details ist unerlässlich, und Erfahrung ist der Schlüssel zum Erfolg, um gute Ergebnisse zu erzielen. Dieses geänderte systemeigene PAGE-Protokoll umfasst viele Schritte mit subtilen Details, die der Schlüssel zum Erfolg sind.
Visuelle Demonstration kann diese Details zeigen, die für Forscher von Vorteil wären. Halten Sie die CAL-1-Zellkultur in einem T75-Kolben bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid bei, mit vollständigem RPMI 1640 medium. Wenn Sie bereit sind, die Zellen zu stimulieren, übertragen Sie sie in ein 50-Milliliter-Konikonund und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 200 x g.
Entfernen Sie den Überstand, und hängen Sie das Pellet im Medium wieder auf, um eine homogene einzellige Suspension zu erhalten. Dann die Zellen mit einem Hämozytometer zu berücksichtigen, und säen sie mit einer Dichte von 1 000 000 Zellen pro Brunnen in einer Sechs-Brunnen-Platte mit vier Milliliter n.Ä.-Medium in jedem Brunnen. Inkubieren Sie die Zellen für 20 bis 24 Stunden, damit die Konfluenz 90 bis 95% am nächsten Tag erreichen kann, stimulieren Sie die Zellen, indem Sie vier Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter R848 pro Brunnen hinzufügen, um sicherzustellen, dass eine Kontrolle gut mit Zellen und keine R848-Behandlung zu verlassen.
Die Platte vorsichtig von Seite zu Seite schaukeln, um den R848 gleichmäßig zu dispergieren, und bebrüten die Zellen dann 2 bis 16 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Nach der Inkubation die Zellsuspensionen von der Platte in 5-Milliliter-Zentrifugenröhren übertragen. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 200 x g, entfernen Sie dann den Überstand und setzen Sie das Pellet in einem Milliliter PBS wieder auf.
Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 1,5-Milliliter-Rohr und drehen Sie sie bei 12.000 x g für 30 bis 60 Sekunden bei 4 Grad Celsius, und entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand. Bereiten Sie den Lysepuffer entsprechend den Manuskriptanweisungen vor und halten Sie ihn auf Eis, bis er einsatzbereit ist. Das Zellpellet in 30 Mikrolitere eiskaltelysePuffer und Pipette nach oben und unten wieder aufhängen, um es zu mischen.
Dann die Röhre für 15 bis 20 Minuten auf Eis bebrüten. Klären Sie das Lysat durch Zentrifugieren bei 12.000 x g für 15 bis 20 Minuten bei 4 Grad Celsius, und übertragen Sie den Überstand auf ein vorgekühltes 1,5-Milliliter-Rohr, um sicherzustellen, dass die Extrakte jederzeit auf Eis bleiben. Messen Sie dann die Proteinkonzentration mit Bradford Reagenz.
Bereiten Sie die Elektrophoresepuffer der oberen und unteren Kammer entsprechend den Manuskriptrichtungen vor und spülen Sie ein 3-12% natives PAGE-Gel gründlich mit Wasser ab, ohne die Brunnen zu verzerren. PSA zum Schutz wie Laborlack, Schutzbrille und Maske sind für den Umgang mit der Chemikalie erforderlich. Dann stellen Sie das Gel in den Mini Gel Tank ein, entfernen Sie den Kamm, fügen Sie die vorbereiteten Elektrophoresepuffer der oberen und unteren Kammer hinzu und führen Sie es in einem 4 Grad Celsius kalten Raum oder auf Eis bei 150 Volt für 30 Minuten vor.
In der Zwischenzeit bereiten Sie die Proben für die Beladung vor, indem Sie die zellulären Proteine auf Eis mit dem 4X Native Sample Buffer mischen. Sobald der Vorlauf abgeschlossen ist, laden Sie 10 bis 15 Mikrogramm Protein auf jeden Brunnen und führen Sie das Gel 30 Minuten bei 85 Volt, gefolgt von zwei Stunden bei 150 Volt. Dann das Gel in SDS-Laufpuffer für 30 Minuten bei Raumtemperatur einweichen.
Aktivieren Sie die Polyvinyliden-Difluorid-Membran, indem Sie sie etwa fünf Minuten in Methanol einweichen. Machen Sie einen Schnitt an einer Ecke der Membran, um ihre Ausrichtung anzuzeigen, und montieren Sie das Transfer-Sandwich gemäß dem Herstellerprotokoll. Legen Sie die Transferkassette in den Tank und übertragen Sie bei 20 Volt für eine Stunde auf Eis.
Dann entfernen Sie die Membran aus der Kassette mit Kunststoffzangen und blockieren Sie die Membran im Sperrpuffer bei Raumtemperatur für 45 Minuten auf einem Schaukelschüttler. Als nächstes die Membran mit dem Primärantikörper bei 4 Grad Celsius über Nacht oder bei Raumtemperatur für zwei Stunden inkubieren und beim Schaukeln drei Minuten lang mit 1XTBST Waschpuffer waschen. Dann inkubieren Sie die Membran mit dem sekundären Antikörper wieder mit dem 1XTBST Waschpuffer bei Raumtemperatur für 45 Minuten, die Waschen wiederholen.
Scannen Sie dann den Fleck mit einem geeigneten Gel-Dokumentationssystem. Mit diesem Protokoll wurden CAL-1-Zellen, die entweder stimuliert oder mit R848 nicht stimuliert wurden, mit einem Immunoblot analysiert. In nicht stimulierten CAL-1-Zellen wurde IRF5 als einzelnes Band auf der nativen PAGE nachgewiesen, die ihrer monomeren Form entspricht.
Bei den stimulierten Zellen verringerte sich der Gehalt an IRF5-Monomer, während der Dimerspiegel stieg. Ein Immunoblot mit Anti-IRF5-Antikörper wurde an IRF5-Überextierung von 293 T-Zellen durchgeführt, die mit verschiedenen Konstrukten transfiziert wurden. Bei der untransfizierten Kontrolle wurde kein IRF5 nachgewiesen, was die Spezifität des Anti-IRF5-Antikörpers demonstriert.
Ein einzelnes Band, das monomeren IRF5 entspricht, wurde nur in den 293 T-Zellen, die IRF5 überausdrücken, nachgewiesen. Wenn Konstrukte, die IRF5-aktivierende Proteine kodieren, kotransfizieren, mittransfiziert wurden, erschien ein langsam migrierendes Band, das der dimeren Form von IRF5 entsprach. NMDA5, ein verwandtes Protein von RIG-I, induzierte jedoch keine IRF5-Dimerisierung.
Die Verwendung von Bis-Tris Gradientengelen ist entscheidend, wahrscheinlich aufgrund der spezifischen pH-Werts- und chemischen Zusammensetzung dieses gelelektrophoretischen Systems, die die Trennung von monomeren und dimerischen Formen von IRF5 ermöglichten. Auch das Lysing und die Konservierung von Zelllysaten in nicht denaturing nativen Probenpufferbehält native Proteinstrukturen. Hier haben wir eine handelsübliche verwendet, die auf native PAGE Säuren zugeschnitten ist.
Eine zusätzliche Methode, die dies sehr ergänzt, ist die Nutzung des ImageStream-Bildstromzytometriesystems zur Bewertung der IRF5-Kerntranslokation, der Substanz, die bei der IRF5-Aktivierung nach Dimerisierung enthalten ist. In Kombination mit unserem Protokoll dient es als eine andere Art von Test, um die Schritte bei der IRF5-Aktivierung zu validieren. Als ein wichtiger Regulator der Entzündungsreaktion spielt IRF5 eine wichtige Rolle bei Infektionen und Immunität, Autoimmunerkrankungen, Krebs und vielen anderen Krankheiten, die für die menschliche Gesundheit wichtig sind.
Es gibt auch Bemühungen bei der Entwicklung von Therapeutika, um IRF5 und damit verbundene Transkriptionsfaktoren ins Visier zu nehmen. Dieses Protokoll wird es Forschern in verschiedenen Bereichen ermöglichen, die IRF5-Biologie zu verstehen und zu untersuchen.
