Dieses Protokoll kann verwendet werden, um patientenabgeleitete Xenografts zu erstellen, die die Histopathologie venöser Fehlbildungen rekapitulieren. Dies wurde weiterhin erlaubt, unsere präklinischen therapeutischen Tests durchzuführen. Diese Technik bietet ein schnelles und zuverlässiges NVivo-System, das eine tägliche Überwachung des Wachstums der direkten Endothelzellen des Patienten und die Reaktion auf die experimentelle Therapie ermöglicht.
Diese Methode könnte leicht angepasst werden, um andere Arten von vaskulären oder lymphatischen Anomalien zu untersuchen. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Zellsuspension für die Injektion. Trypsinisieren Sie die Endothelzellen mit fünf Millilitern vorgewärmt0000 bei 37 Grad Celsius für zwei Minuten.
Neutralisieren Sie die Tripsin und durch Zugabe von fünf Milliliter EGM und sammeln Sie die Zellen in 150 Milliliter konische Röhre. Zentrifugieren Sie es auf 400 mal G für fünf Minuten, dann aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in drei Milliliter EGM. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
Wagen Sie das Volumen mit der gewünschten Zellzahl in ein neues 50 Milliliter konisches Rohr und pellet die Zellen durch Zentrifugation wieder. Aspirieren Sie den Überstand und lassen Sie ein kleines Volumen zurück, um das Zellpellet zu lösen. Setzen Sie das Zellpellet mit 220 Mikroliter BMEM pro Injektion wieder auf.
Mischen Sie die Zellsuspension gründlich auf Eis und stellen Sie sicher, dass Blasen vermieden werden. Die BMEM-Zellkultur in eine ein Milliliter Spritze mischen, indem Sie den Kolben ziehen. Sie verriegeln eine 26 Gauge sterile Nadel an der Spritze und halten die vorbereiteten Spritzen vor der Injektion flach auf Eis.
Nachdem Sie sichergestellt haben, dass die Maus richtig anästhesisiert hat, legen Sie sie auf ihren Magen und desinfizieren Sie den Injektionsbereich mit 70% Ethanol. Rollen Sie die vorbereitete Spritze vorsichtig, um alle abgesetzten Zellen wieder auszusetzen. Flake Blasen bis zum Ende der Spritze und vertreiben ein kleines Volumen der Zellsuspension.
Kneifen Sie die Haut an der Injektionsstelle, um eine Zelt-ähnliche Struktur zu schaffen. Dann setzen Sie die Nadel direkt unter die Haut und stellen Sie sicher, dass die Nadel nur Haut tief ist, indem Sie Pinch Haut, um Injektion in Muskelgewebe zu verhindern. Halten Sie die Nadel kontinuierlich sorgfältig injizieren 200 Mikroliter der Zellsuspension, um eine kleine kugelförmige Masse zu schaffen.
Achten Sie darauf, die Zellsuspension nicht in den Muskel zu injizieren. Messen Sie die Länge und Breite jedes Steckers mit einem Bremssattel. Richten Sie die sezierten Xenograft-Stecker auf einem Schneidebrett neben einem Lineal aus und zeichnen Sie ein Bild aus, um die grobe Vaskularität der Läsionen aufzuzeichnen.
Dann befestigen Sie die Stecker, indem Sie sie in 10%formalin über Nacht bei Raumtemperatur. Nach der Zerlegung werden die Läsionsstopfen für die histologische Analyse verarbeitet und für UEA-1 gebeizt, um menschliche abgeleitete Endothelzellen innerhalb des Steckers zu erkennen. Nehmen Sie fünf HPF-Bilder pro Läsionsabschnitt mit einem hellen Feldmikroskop bei einer Vergrößerung von 20 X in einem X-Ebenenmuster innerhalb des Läsionsabschnitts auf, um Überlappungen zu vermeiden.
Stellen Sie sicher, dass Sie eine Maßstabsleiste auf den aufgenommenen Bildern enthalten. Öffnen Sie die HPF-Bilder im Bild J.To die Pixel der Maßstabsleiste kalibrieren, verwenden Sie das gerade Linienwerkzeug und gehen Sie über die Maßstabsleiste. Konvertieren Sie dann die gemessenen Pixel in Millimeter, indem Sie auf Analysieren und Skalieren festlegen klicken.
Klicken Sie dann auf Messen Sie Messungen analysieren und wählen Sie den Bereich aus und fügen Sie sie zur Überlagerung hinzu. Messen Sie die gesamte Feldfläche des HPF mithilfe von Analyse und Messung, indem Sie diese Messung für die Quantifizierung speichern. Mit dem Werkzeug zur Freien Handauswahl skizzieren Sie den UEA-1-positiven Gefäßkanal manuell.
Klicken Sie auf Analysieren und Messen, um den umrissenen Bereich zu quantifizieren. Messen Sie alle Gefäßkanäle innerhalb des HPF. Wiederholen Sie den Vorgang für die fünf HPF, die in jedem Abschnitt aufgenommen wurden, und übertragen Sie die Werte zur weiteren Analyse nach Excel.
Berechnen Sie dann den Prozentsatz der Gefäßfläche und Gefäßdichte nach Manuskriptrichtungen. Mit diesem Protokoll werden die Läsionsstopfen mit TIE2 oder PIK3CA hyperaktiven mutierten Endothelzellen sichtbar vaskularisiert und innerhalb von sieben bis neun Tagen nach der Injektion durchsetzt. Die Läsionsstecker ähneln den histopathologischen Merkmalen des menschlichen VM-Gewebes und große Gefäßkanäle, die durch eine dünne Schicht von Endothelzellen ausgerichtet sind, sind sichtbar.
Diese Gefäßstrukturen enthalten typischerweise Erythrozyten, die eine funktionelle Anastomose mit der Wirtsmausvaskulatur bestätigen. Immunhistochemische Färbung mit dem menschlichen spezifischen Lektin UEA-1 bestätigt, dass die Zellen, die Gefäßregionen austragen, von menschlichen implantierten Zellen und nicht von Mausvaskulatur abgeleitet werden. Nach diesem Verfahren können zusätzliche Färbung von Läsionsabschnitten für Marker der Proliferation oder Apoptose durchgeführt werden, um spezifische Auswirkungen von experimentellen Behandlungen zu analysieren.
Dieses szenografische Modell wurde für präklinische Studien neuer Therapien zur venösen Fehlbildung verwendet, wie z. B. dem mTOR-Hemmer Rapamycin, der in mehreren klinischen Studien für VM-Patienten Wirksamkeit gezeigt hat.
