Wir möchten Kerstin Thim (Astrazeneca, Lund, Schweden), Benita Dahlberg und Dr. Anders Eklund (Karolinska Institutet, Stockholm, Schweden) sowie Dr. Martin Stampfli (McMaster University, Hamilton, ON, Kanada) für geschickte Unterstützung danken und kompetente Beratung.

Die tierexperimentellen Studien wurden von der Nord Stockholm Tierschutz Ethikkommission genehmigt. Die experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit schwedischen Rechts durchgeführt. 1. Erstellen eines LPS Aerosol <ol><li> Man löst 0,5 g gereinigtes P. aeruginosa LPS in 50 ml steriler Kochsalzlösung unter leichtem Schütteln und überprüfen Sie die Auflösung. Gebrauchslösung: 1 ml LPS gelöst in 9 ml steriler Salzlösung bis zu einer Endkonzentration von 1 mg / ml. Vor Licht mit Aluminiumfolie und bei -20 ° C. </li><li> Auftauen solubilisierten LPS im Dunkeln bei Raumtemperatur und gut mischen unmittelbar vor der Verwendung. </li><li> An einem gut belüfteten Ebene II Biohazard Haube, legen Sie eine rote Einlass in einem Zerstäuber, und verbinden Sie den Vernebler unter Druck Raumluft über den Schlauch durch den Hersteller (Überprüfung Schema präsentiert die experimentellen Geräten in Abbildung 1) zur Verfügung gestellt. ACHTUNG: Geeignete Schutzausrüstung einschließlich eines Halbgesichtsmaske wiederverwendbaren respiratoder mit Partikelfilter, Schutzbrille, Handschuhe und Schutzkleidung sollte im Verlauf der Exposition verwendet werden. </li></ol><img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/51470/51470fig1highres.jpg" /> Fig. 1: Schematische Darstellung der Versuchsvorrichtungen zum Erzeugen eines Aerosols verwendet Der Einlass des Zerstäubers ist mit einer Luftversorgung verbunden ist. Der Auslass des Zerstäubers wird zunächst auf einen Strömungsmesser über einen 15,9-mm-Rohr und einem Luftfilter und Luftzufuhr verbunden ist, um 5,0 l / min bei 2 kbar Druck eingestellt. Der Auslaß ist an einen nächsten verbundenen Plexiglasbox mit abnehmbarem Deckel und 5 mm Löcher um einen Druckaufbau zu verhindern ausgestattet. <ol start="4"><li> Verbinden des Auslasses des Zerstäubers an einen Massendurchflussmesser über einen Luftfilter. Verbinden Sie den Massedurchflussmesser mit einer elektrischen Versorgung. </li><li> Stellen Sie die Luftzufuhr zu 5 l / min, mit 1,0 bis 2,0 bar Restdruck. </li><li> Entfernen Sie die Massedurchflussmesser undTrennen Sie die Luftzufuhr. </li><li> Verbinden den Auslaß der Zerstäuber auf eine 15,9-mm-Rohr, die sich gabelt und verbindet zwei Plexiglasboxen mit den Abmessungen: 150 x 163 x 205 mm, mit abnehmbaren Deckeln versehen. Jede Box ist ein 5 mm Loch in der Seite gegenüber der Einlass, um Druckaufbau zu verhindern. </li><li> Platzieren Sie bis zu 5 Mäusen in jeder Plexiglas-Box, und schließen Sie den Deckel. </li><li> Öffnen des Zerstäubers und Füllen des Einsatzes mit mindestens 4 ml LPS in sterile Kochsalzlösung oder Vehikel gelöst allein (sterile Kochsalzlösung; sollte das Volumen 8 ml nicht überschreiten). Schließen Sie den Einlass zum Luftzufuhr. </li><li> Lassen Sie das Aerosol in die geschlossene Plexiglasboxen für 10 min fließen. Überwachen Sie die Tiere kontinuierlich. Sicherstellen, dass die Luftzufuhr bleibt fest mit dem Einlass des Zerstäubers gesichert. </li><li> Trennen Sie die Luftzufuhr. Bei geschlossenen Lidern, lassen Sie die Tiere bleiben in den Plexiglas-Boxen für 2 min. </li><li> Öffnen Sie den Deckel und lassen für das Aerosol zu zerstreuen, und kehren die Tiere auf ter Käfigen. Wenn die Tiere nass erscheinen, legen Sie die Käfige auf einem Heizkissen auf kleiner Flamme eingestellt, um eine Unterkühlung zu verhindern. </li><li> Überwachung der Tiere kontinuierlich für die ersten 30 min und danach alle 2 h während der ersten 6 Stunden. Die Tiere sollten normale Atemmuster und Aktivität während und nach der Vernebelung Verfahren aufweisen. </li></ol> 2. Bronchiallavage (BAL) <ol><li> Bei der experimentellen Endpunkt, tief betäuben die Tiere mit Isofluran wirksam wie tierärztliche Personal Ihrer Einrichtung empfohlen. Pinch der Hinterpfote für einen Rückzug Reflex, um eine ausreichende Narkosetiefe zu gewährleisten, um eine größere Operation durchführen zu überprüfen. Sprühen Sie den Pelz der Tiere mit 70% Ethanol. </li><li> Öffnen Sie den Unterleib mit einer Schere und durchtrennen die Aorta, das Tier exsanguinate. Legen Sie ein Stück Gewebe über den Bauch, um das Blut aufzusaugen. </li><li> Follwing Euthanasie, eine einzige anterior-posterioren Schnitt der SchereSetzen Sie den Brustkorb. Heben Sie den Brustkorb von der vorderen Spitze des Brustbeins und die Schere, um die Membran am meisten Bauchpunkt durchstoßen, ohne Schneiden in alle Lungenlappen. Öffnen Sie den Brustkorb, indem zwei Schnitte in der Vorwärts-Rückwärts-Richtung (Sitzung unter dem Kiefer). </li><li> Ziehen Sie vorsichtig neben den Brustkorb mit einer Pinzette und schneiden Sie die Luftröhre unterhalb des Kehlkopfes. </li><li> Heben Sie die Luftröhre mit der Zange und entfernen Sie die Lunge, die durch Schneiden der Bänder, welche die Lappen in die Brusthöhle und leichtes Ziehen vom Fett- und Herzgewebe. </li><li> Legen Sie eine Polyethylenschlauch (Innendurchmesser: 0,58 mm; Außendurchmesser: 0,965 mm) in die Luftröhre und sichern Sie den Schlauch mit einer Reihe von Seidenfaden. </li><li> Binden Sie die multilobe (die vier Lappen der rechten Lunge) mit Seidenfaden. </li><li> Legen Sie eine 23-Gauge-Nadel in die Polyethylen-Rohr und langsam injizieren 250 ul eiskaltem sterilem PBS in den einzelnen Lappen mit einer 1 ml Spritze. </li><li> Tippen Sie vorsichtig die Lunge30mal und sammeln die Flüssigkeit durch die Spritze. Wiederholen Sie den Vorgang mit 200 ul PBS (etwa 300 ul PBS von der Betriebslappen aus der gesamten injizierten Volumen von 450 ul wiederhergestellt werden). </li><li> Halten Sie den bronchoalveolären Lavage (BAL) auf Eis oder Aufzählung der BAL-Zellen sofort. Zähle die Zellen mit einem heamocytometer mit Turk-Lösung, um die Zellen 11 zu färben. Berechnen der Gesamtzellzahl durch Multiplikation der Anzahl der Zellen, die mit dem Verdünnungsfaktor der Färbelösung und das Volumen innerhalb der gezählten Feld des heamocytometer. </li><li> Bereiten Differentialzellzählungen von zytozentrifugierten Zellen wie anderswo 11 beschrieben. </li></ol> 3. Formalin-Fixierung von Lungengewebe für die histologische Bewertung <ol><li> Entfernen Sie die multilobe und Snap-freeze auf Trockeneis. Bei -80 ° C. </li><li> Montieren Sie einen 60-ml-Spritze mit dem Kolben auf einem Metallträger Stand entfernt. Füllen Sie die Spritze mit 10% Formalin zudie Höhe von 20 cm über dem Labortisch, was 20 cm konstanter Druck. </li><li> Verbinden den 23-Gauge-Nadel zur Luftröhre zu dem 60 ml Spritze über ein Kunststoffrohr mit einem Ventil, um den Fluss von Formalin steuern gesichert. </li><li> Insufflate die Lungenflügel mit Formalin für 5 min. Ziehen Sie die Nadel heraus und entfernen Sie sie zusammen mit der Polyethylenschlauch aus der Luftröhre beim Ziehen an der Seidenfaden, um die Luftröhre zu schließen und den Druck in der Lunge zu erhalten. </li><li> Tauchen Sie den Lungenlappen in Formalin und beheben 24 Stunden lang bei 4 ° C. </li><li> Dreimal für mindestens 20 min mit 70% Ethanol waschen das fixierte Gewebe und zu entwässern, um die folgenden Schema (jeweils 1 Stunde) Xylol: <ul><li> 3x 70% Ethanol </li><li> 3x 95% Ethanol </li><li> 3x 100% Ethanol </li><li> 3x Xylol </li><li> 1x (flüssig) Paraffin </li></ul></li><li> Betten Sie dehydriert Gewebe in Paraffin in 4-5 &amp; mgr; m Schnitte geschnitten, und Fleck mit Hämatoxylin und Eosin zur histologischen Beurteilung ermöglichen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>King, J. D., Kocincova, D., Westman, E. L., Lam, J. 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Abraham Roos hat ein Dozent Gebühr von Boehringer Ingelheim, Reisestipendien von Astrazeneca R &amp; D und ein Forschungsstipendium von Astrazeneca R &amp; D erhalten. Magnus Nord ist ein Vollzeit-Mitarbeiter von Astrazeneca R &amp; D und hat ein Forschungsstipendium von Astrazeneca R &amp; D erhalten. Johan Grunewald und Tove Berg sind Co-Ermittler auf einem nicht verwandten Forschungsprojekt von Astrazeneca R &amp; D gefördert.

Aerosolierte LPS erzeugt eine Entzündungsreaktion in den Atemwegen von Neutrophilen im epithelialen submucosa gekennzeichnet, umgebenden Räumen die leitenden Atemwege, sowie die Alveolen. Dies ist zusammen mit der erhöhten Gesamtproteingehalt in BALF anzeigt Plasmaleckage, repräsentativ für die Pathologie von akuter Lungenverletzung. LPS induziert eine sterile Entzündung ist die Reaktion unabhängig von der adaptiven Immunantwort, und es gibt Grenzen für die Relevanz für bakterielle Infektionen. Die Technik kann...

Lipopolysaccharid (LPS) ist ein Zellwandkomponente von Gram-negativen Bakterien 1. Herausforderung LPS ist ein gut dokumentiertes Modell des akuten Lungenversagens, ein Syndrom, das durch eine akute neutrophile Entzündung und Ödem 2. Zusätzlich ist Lungen Neutrophilie auch ein Markenzeichen von chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) 3 und LPS bei Menschen verwendet wurde, um COPDExazerbationen 4 modellieren. So sind experimentellen Modellen der LPS Exposition klinisch relevante und wertvolle Werkzeuge für die menschliche Pathologie zu verstehen. Das Ziel der pulmonalen Verabreichung von hier beschriebenen aerosolized LPS ist es, eine neutrophile Entzündungsreaktion in den leitenden und den Atemwegen, ohne systemische Beteiligung erzeugen. Verschiedene Techniken von LPS wurden bereits beschrieben. Intravenöse Injektion von LPS ist die am häufigsten verwendete Art der Verabreichung. Obwohl diese Technik ist leicht zugänglich, ter Primärschaden ist an das Endothel, mit sekundären Zerstörung der Lungenepithel folgenden neutrophilen Migration in die Lunge. Intravenöse Verabreichung induziert auch systemische Entzündung 2, die das klinische Bild in Tiermodellen erschweren kann. Systemische Entzündung ist hingegen nicht durch intratracheale Verabreichung beobachtet. Diese Technik ist jedoch arbeitsintensiv und erfordert Anästhetika sowie erhebliche Trainings 5, 6. Darüber hinaus ist Lung dieses Verabreichungsweg abhängig von Atem 7. Somit wird Lungenablagerung durch die Narkosetiefe für die intra tracheale Verabreichung und variable Abscheidung in den Atemwegen beobachtet werden benötigt betroffen. Im Gegensatz dazu pulmonalen Verabreichung mit aerosoli LPS erfordert minimales Training, und kann leicht zu einer großen Anzahl von Tieren, die mit wenig oder gar keine Variation zwischen Individuen 5, 8 durchgeführt werden.Eine aktuelle Studie bestätigt, dass die Aerosolabgabe ist besser als die intratracheal im Hinblick auf die Abscheidung und relevanter Dosen von LPS induziert neutrophilen Entzündung mit diesem Modell 8. Frühere Studien haben gezeigt, dass diese Herausforderung vernebelt Pseudomonas aeruginosa LPS erzeugt eine deutliche Entzündungsreaktion in den Atemwegen Lumen und Lungenparenchym, einschließlich der Alveolarräumen 9, 10. Die Entzündung wird durch ein Vorherrschen der Neutrophilen und die Anwesenheit von Lungenödem gekennzeichnet und können daher verwendet werden, um die Pathogenese von akuter Lungenverletzung Adresse weiter und gewinnt die Kenntnis der Mechanismen Beitrag zur Krankheitspathologie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:931px;" width="929">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:307px;">Name of the material/equipment&#160;</td>
			<td style="width:244px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog number</td>
			<td style="width:235px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:307px;">Purified Pseudomonas aeruginosa LPS&#160;</td>
			<td style="width:244px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:235px;">Harmful. Recomended purification. LPS purified from other bactria may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Pari LC sprint star nebulizer</td>
			<td style="width:244px;">PARI Respiratory Equipment Inc.&#160;</td>
			<td style="width:145px;">023G1250</td>
			<td style="width:235px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">TSI mass flowmeter 4040</td>
			<td style="width:244px;">TSI</td>
			<td style="width:145px;">4040</td>
			<td style="width:235px;">Alternative product from supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Saint-Gobain 15.9 mm Tygon tube</td>
			<td style="width:244px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">Z685704</td>
			<td style="width:235px;">Recomended brand.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Plexiglas boxes with removable lids</td>
			<td style="width:244px;">Custom built</td>
			<td style="width:145px;">N/A</td>
			<td style="width:235px;">150 x 163 x 205 mm (a 2 mm hole on the side).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">3M Half Facepiece Reusable Respirator</td>
			<td style="width:244px;">3M</td>
			<td style="width:145px;">7503</td>
			<td style="width:235px;">Recomended brand.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">3M Advanced Particulate Filters (P100)&#160;</td>
			<td style="width:244px;">3M</td>
			<td style="width:145px;">2291</td>
			<td style="width:235px;">Recomended brand.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Sissors</td>
			<td style="width:244px;">VWR</td>
			<td style="width:145px;">233-1104</td>
			<td style="width:235px;">Preferred scissors may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:244px;">VWR</td>
			<td style="width:145px;">232-1313</td>
			<td style="width:235px;">Preferred forceps may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Intramedic PE50 polyethylene tube</td>
			<td style="width:244px;">BD</td>
			<td style="width:145px;">427411</td>
			<td style="width:235px;">Recomended brand.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Ethicon 2-0 Perma-hand silk tread&#160;</td>
			<td style="width:244px;">VWR</td>
			<td style="width:145px;">95056-992</td>
			<td style="width:235px;">Recomended brand.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">26 &#189;&#160; gage needle&#160;</td>
			<td style="width:244px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:235px;">Alternative suppliers exist.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">1 mL BD slip-tip syringe, non-sterile</td>
			<td style="width:244px;">BD</td>
			<td style="width:145px;"><a href="http://catalog.bd.com/bdCat/viewProduct.doCustomer?productNumber=301025">301025</a></td>
			<td style="width:235px;">Alternative suppliers exist.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">60 mL BD Luer-Lok syringe, non-sterile, polypropolene&#160;</td>
			<td style="width:244px;">BD</td>
			<td style="width:145px;">301035</td>
			<td style="width:235px;">Alternative suppliers exist.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Fluka Hematoxylin-Eosin</td>
			<td style="width:244px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">3972</td>
			<td style="width:235px;">Alternative suppliers exist.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">T&#252;rk&#39;s solution</td>
			<td style="width:244px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:145px;">109277</td>
			<td style="width:235px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Table top centrifuge</td>
			<td style="width:244px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:235px;">Alternative manufacturers exist.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Cytospin 4 cytocentrifuge</td>
			<td style="width:244px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:145px;">A78300003</td>
			<td style="width:235px;">Alternative centrifuge can be used.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">HEMA-3 stat pack</td>
			<td style="width:244px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">23-123-869</td>
			<td style="width:235px;">Alternative staining kits exists.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:307px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:244px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">HT501128&#160;</td>
			<td style="width:235px;">Alternative suppliers exist.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for generating pulmonary neutrophilia using aerosolized lipopolysaccharide

Akutem Lungenversagen (ALI) ist eine schwere Erkrankung, die alveoläre Neutrophilie, mit begrenzten Behandlungsmöglichkeiten und eine hohe Sterblichkeit. Experimentelle Modelle der ALI sind der Schlüssel bei der Verbesserung unseres Verständnisses der Pathogenese der Erkrankung. Lipopolysaccharid (LPS) aus grampositiven Bakterien stammt induziert neutrophile Entzündung in den Atemwegen und Lungenparenchym von Mäusen. Efficient pulmonalen Verabreichung von Verbindungen, wie LPS ist jedoch schwierig zu erreichen. In der hier beschriebenen Vorgehensweise wird pulmonalen Verabreichung bei Mäusen durch Herausforderung aerosolized Pseudomonas aeruginosa LPS erreicht. Gelöst LPS wurde durch einen Zerstäuber mit Druckluft angeschlossen vernebelt. Die Mäuse wurden in einen kontinuierlichen Strom von LPS Aerosol in einer Plexiglas-Box 10 Minuten lang ausgesetzt, gefolgt von 2 min Konditionierung nach dem Aerosol wurde abgebrochen. Intubation und anschließende Bronchiallavage, gefolgt von Formalin Perfusion wurde als nächstes durchgeführt, die für die Charakterisierung des sterilen p ermöglichtulmonary Entzündung. Aerosolized LPS erzeugt eine Lungenentzündung gekennzeichnet durch alveoläre Neutrophilie, in Bronchiallavage und durch histologische Begutachtung festgestellt. Diese Technik kann gegen eine geringe Gebühr mit wenigen Geräten eingestellt werden, und erfordert nur minimale Schulung und Know-how. Das Belichtungssystem durch eine Routinejeder Labor durchgeführt werden, mit dem Potential, das Verständnis der Lungenpathologie verbessern.

Herausforderung aerosolized P. aeruginosa LPS ergibt in der Regel eine starke entzündliche Reaktion in den Atemwegslumen und Alveolarraum, gekennzeichnet durch ein Vorherrschen der Neutrophilen an beiden frühen und späten Zeitpunkten. Aerosolized LPS induziert Lungen Neutrophilie C57BL / 6by und BALB / c-Mäuse wurden einem Aerosol ausgesetzt P. aeruginosa LPS oder Vehikel und Neutrophile wurden in BALF aufgezählt. Die Gesamtzellzahl in der BAL...

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A Method for Generating Pulmonary Neutrophilia Using Aerosolized Lipopolysaccharide

Wir beschreiben ein Verfahren zur Induktion von neutrophilen Lungenentzündung durch Herausforderung aerosolized Lipopolysaccharid durch Vernebelung, akuter Lungenschädigung-Modell. Darüber hinaus werden grundlegende chirurgische Techniken für Lungen Isolation, Intubation und Bronchiallavage ebenfalls beschrieben.

Verfahren zur Erzeugung von Lungen Neutrophilie Mit aerosolisiertes Lipopolysaccharide

Acute lung injury (ALI) is a severe disease characterized by alveolar neutrophilia, with limited treatment options and high mortality. Experimental models ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.6K Aufrufe.  Karolinska Institutet.  Wir beschreiben ein Verfahren zur Induktion von neutrophilen Lungenentzündung durch Herausforderung aerosolized Lipopolysaccharid durch Vernebelung, akuter Lungenschädigung-Modell. Darüber hinaus werden grundlegende chirurgische Techniken für Lungen Isolation, Intubation und Bronchiallavage ebenfalls beschrieben. 

Serie: A Method for Generating Pulmonary Neutrophilia Using Aerosolized Lipopolysaccharide

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in the thymus proper vasculature formation and patterning is essential for thymocyte entry into the organ and mature T-cell exit to the periphery. The spatial arrangement of blood vessels in the thymus is dependent upon signals from the local microenvironment, namely thymic epithelial cells (TEC). Several recent reports suggest that disruption of these signals results in thymus blood vessel defects 1,2. Previous studies have described techniques used to label the neonatal and adult thymus vasculature 1,2. We demonstrate here a technique for labeling blood vessels in the embryonic thymus. This method combines the use of FITC-dextran or Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I (GSL 1 - isolectin B4) facial vein injections and CD31 antibody staining to identify thymus vascular structures and PDGFR-&beta; to label thymic perivascular mesenchyme 3-5. The option of using cryosections or vibratome sections is also provided. This protocol can be used to identify thymus vascular defects, which is critical for defining the roles of TEC-derived molecules in thymus blood vessel formation. As the method labels the entire vasculature, it can also be used to analyze the vascular networks in multiple organs and tissues throughout the embryo including skin and heart 6-10.

This article describes a method for labeling embryonic skin and thymus blood vessels.

Ein Verfahren zur Markierung Gefäßsystem in embryonalen Mäuse

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Diagnosing Pulmonary Tuberculosis with the Xpert MTB/RIF Test

Tuberculosis (TB) due to Mycobacterium tuberculosis (MTB) remains a major public health issue: the infection affects up to one third of the world population1, and almost two million people are killed by TB each year.2 Universal access to high-quality, patient-centered treatment for all TB patients is emphasized by WHO's Stop TB Strategy.3 The rapid detection of MTB in respiratory specimens and drug therapy based on reliable drug resistance testing results are a prerequisite for the successful implementation of this strategy. However, in many areas of the world, TB diagnosis still relies on insensitive, poorly standardized sputum microscopy methods. Ineffective TB detection and the emergence and transmission of drug-resistant MTB strains increasingly jeopardize global TB control activities.2
Effective diagnosis of pulmonary TB requires the availability - on a global scale - of standardized, easy-to-use, and robust diagnostic tools that would allow the direct detection of both the MTB complex and resistance to key antibiotics, such as rifampicin (RIF). The latter result can serve as marker for multidrug-resistant MTB (MDR TB) and has been reported in &gt; 95% of the MDR-TB isolates.4, 5 The rapid availability of reliable test results is likely to directly translate into sound patient management decisions that, ultimately, will cure the individual patient and break the chain of TB transmission in the community.2
Cepheid's (Sunnyvale, CA, U.S.A.) Xpert MTB/RIF assay6, 7 meets the demands outlined above in a remarkable manner. It is a nucleic-acids amplification test for 1) the detection of MTB complex DNA in sputum or concentrated sputum sediments; and 2) the detection of RIF resistance-associated mutations of the rpoB gene.8 It is designed for use with Cepheid's GeneXpert Dx System that integrates and automates sample processing, nucleic acid amplification, and detection of the target sequences using real-time PCR and reverse transcriptase PCR. The system consists of an instrument, personal computer, barcode scanner, and preloaded software for running tests and viewing the results.9 It employs single-use disposable Xpert MTB/RIF cartridges that hold PCR reagents and host the PCR process. Because the cartridges are self-contained, cross-contamination between samples is eliminated.6 Current nucleic acid amplification methods used to detect MTB are complex, labor-intensive, and technically demanding. The Xpert MTB/RIF assay has the potential to bring standardized, sensitive and very specific diagnostic testing for both TB and drug resistance to universal-access point-of-care settings3, provided that they will be able to afford it. In order to facilitate access, the Foundation for Innovative New Diagnostics (FIND) has negotiated significant price reductions. Current FIND-negotiated prices, along with the list of countries eligible for the discounts, are available on the web.10

The Xpert MTB/RIF test integrates sample decontamination, hands-free operation, on-board sample processing, and ultra-sensitive hemi-nested PCR for the simultaneous detection of Mycobacterium tuberculosis and rifampicin resistance, either in expectorated sputum or concentrated sputum sediments, in approximately two hours. Testing is standardized and requires only moderate laboratory infrastructure and training.

Diagnose Lungentuberkulose mit dem Xpert MTB / RIF-Test

Tuberculosis (TB) due to Mycobacterium tuberculosis (MTB) remains a major public health issue: the infection affects up to one third of the world ...

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

A basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an ability to identify T cells based on their T cell antigen receptor (TCR) specificity. Many indirect methods are available in which a bulk population of T cells is stimulated in vitro with a specific antigen and epitope-specific T cells are identified through the measurement of a functional response such as proliferation, cytokine production, or expression of activation markers1. However, these methods only identify epitope-specific T cells exhibiting one of many possible functions, and they are not sensitive enough to detect epitope-specific T cells at naive precursor frequencies. A popular alternative is the TCR transgenic adoptive transfer model, in which monoclonal T cells from a TCR transgenic mouse are seeded into histocompatible hosts to create a large precursor population of epitope-specific T cells that can be easily tracked with the use of a congenic marker antibody2,3. While powerful, this method suffers from experimental artifacts associated with the unphysiological frequency of T cells with specificity for a single epitope4,5. Moreover, this system cannot be used to investigate the functional heterogeneity of epitope-specific T cell clones within a polyclonal population.
	The ideal way to study adaptive immunity should involve the direct detection of epitope-specific T cells from the endogenous T cell repertoire using a method that distinguishes TCR specificity solely by its binding to cognate peptide:MHC (pMHC) complexes. The use of pMHC tetramers and flow cytometry accomplishes this6, but is limited to the detection of high frequency populations of epitope-specific T cells only found following antigen-induced clonal expansion. In this protocol, we describe a method that coordinates the use of pMHC tetramers and magnetic cell enrichment technology to enable detection of extremely low frequency epitope-specific T cells from mouse lymphoid tissues3,7. With this technique, one can comprehensively track entire epitope-specific populations of endogenous T cells in mice at all stages of the immune response.

This protocol describes the use of peptide:MHC tetramers and magnetic microbeads to isolate low frequency populations of epitope-specific T cells and analyze them by flow cytometry. This method enables the direct study of endogenous T cell populations of interest from in vivo experimental systems.

Peptid: MHC-Tetramer-basierte Anreicherung von Epitop-spezifischer T-Zellen

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is provided to induce sepsis of varying severity in mice using the CLP technique. Autophagy is a fundamental tissue response to stress and pathogen invasion. Two current protocols to assess autophagy in vivo in the context of experimental sepsis are also presented here. (I) Transgenic mice expressing green fluorescence protein (GFP)-LC3 fusion protein are subjected to CLP. Localized enhancement of GFP signal (puncta), as assayed either by immunohistochemical or confocal assays, can be used to detect enhanced autophagosome formation and, thus, altered activation of the autophagy pathway. (II) Enhanced autophagic vacuole (autophagosome) formation per unit tissue area (as a marker of autophagy stimulation) can be quantified using electron microscopy. The study of autophagic responses to sepsis is a critical component of understanding the mechanisms by which tissues respond to infection. Research findings in this area may ultimately contribute towards understanding the pathogenesis of sepsis, which represents a major problem in critical care medicine.

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method. Current protocols to assess autophagy in vivo in the context of CLP-induced sepsis are presented here: A protocol for measuring autophagy using (GFP)-LC3 mice, and a protocol for measuring autophagosome formation by electron microscopy.

Blinddarm-Ligation und Punktion-induzierten Sepsis als Modell zur Autophagie in Mäusen untersucht

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Eine effiziente und High-Yield-Methode zur Isolierung von Maus über dendritische Zellen Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are extremely high, no direct treatment or organ-related mechanism has been examined in detail in real time. The liver is the key organ that manages toxins and infections in the human body. Herein, we aimed to perform intravital imaging of mouse liver after induction of endotoxemia in order to track the motility of immune cells, such as neutrophils and liver capsular macrophages (LCMs). Accordingly, we designed a novel surgical method for exposure of the liver with minimally invasive surgery. Mice were intraperitoneally injected with lipopolysaccharide (LPS), a common endotoxin. Using our novel surgical approach for exposure and intravital imaging of the mouse liver, we found that neutrophil recruitment in LPS-treated LysM-green fluorescent protein (GFP) mouse liver was increased compared with that in phosphate-buffered saline-treated liver. After LPS treatment, the number of neutrophils increased significantly with time. Additionally, using CX3Cr1-GFP mice, we successfully visualized liver resident macrophages called LCMs. Therefore, to investigate the efficacy of new reagents to control immune mobility in vivo, determining the motility and morphology of neutrophils and LCMs in the liver may allow us to identify therapeutic effect in organ failure and tissue damage caused by leukocytes activation in sepsis.

We established a novel surgical protocol for two-photon imaging of live mice liver with minimal invasion. With this technique, we identified the detailed structure of the liver during lipopolysaccharide-induced endotoxemia. We anticipate that this method may be utilized to determine the effectiveness of various reagents treatment to hepatic leukocyte migration.

Zwei-Photon intravitalen Bildgebung der Leukozyten im Rahmen der Immunantwort in Lipopolysaccharid behandelt Maus Leber

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with cytoplasmic tails of the receptors. The interactions often occur through specific protein domains and result in activation of the enzymes. There are several methods to study interactions between proteins. While co-immunoprecipitation is commonly used to study domains that are required for protein-protein interactions, there are no assays that document the contribution of specific domains to activity of the recruited enzymes at the same time. Accordingly, the method described here combines co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay for simultaneous evaluation of interactions between proteins and associated enzymatic activation. The goal of this protocol is to identify the domains that are critical for physical interactions between a protein and enzyme and the domains that are obligatory for complete activation of the enzyme. The importance of this assay is demonstrated, as certain receptor protein domains contribute to the binding of the enzyme to the cytoplasmic tail of the receptor, while other domains are necessary to regulate the function of the same enzyme.

Here, we present a protocol for co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay to simultaneously study the contribution of specific protein domains of plasma membrane receptors to both enzyme recruitment and enzyme activity.

Co-Immunopräzipitation Test zur Untersuchung funktionalen Wechselwirkungen zwischen Rezeptoren und Enzymen

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells

Extracorporeal photochemotherapy (ECP) is a widely used cancer immunotherapy for cutaneous T cell lymphoma (CTCL), operative in over 350 university centers worldwide. While ECP&#8217;s clinical efficacy and exemplary safety profile have driven its widespread use, elucidation of the underlying mechanisms has remained a challenge, partly owing to lack of a laboratory ECP model. To overcome this obstacle and create a simple, user-friendly platform for ECP research, we developed a scaled-down version of the clinical ECP leukocyte-processing device, suitable for work with both mouse models, and small human blood samples. This device is termed the Transimmunization (TI) chamber, or plate. In a series of landmark experiments, the miniaturized device was used to produce a cellular vaccine that regularly initiated therapeutic anti-cancer immunity in several syngeneic mouse tumor models. By removing individual factors from the experimental system and ascertaining their contribution to the in vivo anti-tumor response, we then elucidated key mechanistic drivers of ECP immunizing potential. Collectively, our results revealed that anti-tumor effects of ECP are initiated by dendritic cells (DC), physiologically generated through blood monocyte interaction with platelets in the TI plate, and loaded with antigens from tumor cells whose apoptotic cell death is finely titrated by exposure to the photoactivatable DNA cross-linking agent 8-methoxypsoralen and UVA light (8-MOPA). When returned to the mouse, this cellular vaccine leads to specific and transferable anti-tumor T cell immunity. We verified that the TI chamber is also suitable for human blood processing, producing human DCs fully comparable in activation state and profile to those derived from the clinical ECP chamber. The protocols presented here are intended for ECP studies in mouse and man, controlled generation of apoptotic tumor cells with 8-MOPA, and rapid production of physiologic human and mouse monocyte-derived DCs for a variety of applications.

The transimmunization (TI) device or plate and related protocols have been developed to replicate the key features of extracorporeal photochemotherapy (ECP), in an experimental setting, allowing for production of physiologically activated, tunable dendritic cells (DCs) for cancer immunotherapy.

Neuartiges Protokoll zur Generierung physiologischer immunogener Dendritischer Zellen

Extracorporeal photochemotherapy (ECP) is a widely used cancer immunotherapy for cutaneous T cell lymphoma (CTCL), operative in over 350 university ...

Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant advantage over other methods. To prepare these probes, azide derivatives of antibiotics are synthesized, then coupled with alkyne-fluorophores using azide-alkyne dipolar cycloaddition by click chemistry. Following purification, the antibiotic activity of the fluorescent antibiotic is tested by minimum inhibitory concentration assessment. In order to study bacterial accumulation, either spectrophotometry or flow cytometry may be used, allowing for much simpler analysis than methods relying on radioactive antibiotic derivatives. Furthermore, confocal microscopy can be used to examine localization within the bacteria, affording valuable information about mode of action and changes that occur in resistant species. The use of fluorescent antibiotic probes in the study of antimicrobial resistance is a powerful method with much potential for future expansion.

Fluorescently tagged antibiotics are powerful tools that can be used to study multiple aspects of antimicrobial resistance. This article describes the preparation of fluorescently tagged antibiotics and their application to studying antibiotic resistance in bacteria. Probes can be used to study mechanisms of bacterial resistance (e.g., efflux) by spectrophotometry, flow cytometry, and microscopy.

Visualisierung der bakteriellen Resistenz mit fluoreszierenden Antibiotikasonden

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant ...

Cigarette Smoke Exposure in Mice using a Whole-Body Inhalation System

Close to 14% of adults in the United States were reported to smoke cigarettes in 2018. The effects of cigarette smoke (CS) on lungs and cardiovascular diseases have been widely studied, however, the impact of CS in other tissues and organs such as blood and bone marrow remain incompletely defined. Finding the appropriate system to study the effects of CS in rodents can be prohibitively expensive and require the purchase of commercially available systems. Thus, we set out to build an affordable, reliable, and versatile system to study the pathologic effects of CS in mice. This whole-body inhalation exposure system (WBIS) set-up mimics the breathing and puffing of cigarettes by alternating exposure to CS and clean air. Here we show that this do-it-yourself (DIY) system induces airway inflammation and lung emphysema in mice after 4-months of cigarette smoke exposure. The effects of whole-body inhalation (WBI) of CS on hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) in the bone marrow using this apparatus are also shown.

This protocol demonstrates the study of the pathophysiologic effects of cigarette smoke (CS) with a whole-body inhalation (WBI) exposure system (WBIS) built in-house. This system can expose animals to CS under controlled repeatable conditions for research of CS-mediated effects on lung emphysema and hematopoiesis.

Zigarettenrauchexposition bei Mäusen mit einem Ganzkörper-Inhalationssystem

Close to 14% of adults in the United States were reported to smoke cigarettes in 2018. The effects of cigarette smoke (CS) on lungs and cardiovascular ...