Diese Arbeit wurde von einer H &amp; H Lee Surgical Resident Research Scholars Program (JAN), unterstützt ein AO Foundation Gründungszuschuss S-12-03M (LSM) und ein National Institutes of Health Zuschuss R01-AI078910 (LSM) .

Ethik Aussage: Alle Tiere wurden in strikter Übereinstimmung mit der guten Tierpraxis in den Bundesvorschriften, wie in der Tierschutzgesetzes (AWA) eingestellt definiert behandelt, 1996 Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und dem PHS Politik für die Humane Pflege und Verwendung von Labortieren und allen tierischen Arbeit wurde von der Johns-Hopkins-Animal Care und Use Committee (Protokoll #: MO12M465) zugelassen. 1. Vorbereitung des Inokulums von Mid-logarithmischen Biolumineszenz Bakterien <ol><li> Streak Biolumineszenz S. aureus-Stamm Xen29 (oder einem anderen Stamm, wie bioluminscent Xen36) auf CASO-Agar-Platten (CASO-Bouillon in Agar [1,5%]). HINWEIS: S. aureus Xen29 21 ist eine gentechnisch S. aureus-Stamm, der eine modifizierte lux-Operon aus Photorhabdus luminescens, die in einem stabilen nativen Plasmid in dieser Bakterienstamm gefunden integrierte abgeleitet sind. Diese MotorEred Bakterien konstitutiv emittieren Licht von Live-und stoffwechselaktiven Zellen. </li><li> Wachsen der Kolonien auf den Platten durch Inkubation bei 37 ° C für etwa 16 h (O / N). </li><li> Wählen Sie einzelne bakterielle CFU und Kultur in ca. 16 Stunden (O / N) Schütteln Flüssigkeit TSB (240 UpM). </li><li> Durchführen einer Subkultur mit 1:50-Verdünnung des O / N-Kultur bis mittleren logarithmischen Wachstumsphase Bakterien (ca. 2 h Laufzeit) zu erhalten. </li><li> Pellet resuspendieren und waschen die Bakterien 3x in PBS. </li><li> Schätzung der bakteriellen Inokula (1 × 10 3 CFU in 2 ul PBS) durch Bestimmung der optischen Dichte bei 600 nm Absorption. </li><li> Überprüfen Sie die CFU in der Impfstoff nach Kultivierung der Bakterien O / N auf Platten. </li></ol> 2. Maus Chirurgische Verfahren HINWEIS: Für diese Experiment, mit einem zwölf Wochen alte männliche Mäuse LysEGFP. Diese Mäuse besitzen verstärkt grün fluoreszierende Protein (EGFP) exprimieren myeloiden Zellen (die von m bestehenostly Neutrophile) 20. Pflegen sterilen Bedingungen während der Operation und nach der chirurgischen Vorbereitung mit betadine und 70% Alkohol, indem jede Maus auf einem sterilen Tuch auf einem harten Untergrund zirkulierende Wasser Heizkissen. Verwenden Kleid, sterile Handschuhe, Maske und sterilisieren Instrumente. <ol><li> Betäuben die Maus mit einer 2% Inhalation von Isofluran. Verwenden Tierarzt Salbe auf die Augen zu Trockenheit während der Narkose zu verhindern. Bewerten Sie die angemessene Höhe der Anästhesie durch die Beobachtung der Atemfrequenz, Muskeltonus, toe Prise, Hornhautreflex und die Farbe der Schleimhäute. Decken den Mäusen, die mit einem sterilen chirurgischen Abdeckung mit einer Öffnung an der Operationsstelle am rechten Knie. Die Maus sollte stützHeizung Maßnahmen, die Körpertemperatur während der Narkose zu halten bekommen. Warme 37 ° C zirkulierende Wasser in einem warmen Wassermantel Decke oder einem Wasserkreishartplastik beheizten Arbeitsplatz (ProStation, Patterson, Scientific) sind gute Möglichkeiten, um eine Unterkühlung zu verhindern. </li><li> Injizieren buprenorphine (Retard-Formulierung) (2,5 mg / kg) subkutan kurz vor der Operation. Zusätzliche Dosen mit verzögerter Freisetzung von Buprenorphin kann in 3 Tage-Intervallen für Analgesie benötigt, verabreicht werden. </li><li> Rasieren Sie die Knie und operative prep mit drei Wechsel Peelings mit betadine und 70% Alkohol. </li><li> Durchführen einer Mittellinieneinschnitt in der Haut, die über der rechten Kniegelenks. Verlängern Sie die Hautschnitt, so dass der Streckapparat kann auch definiert werden. </li><li> Führen Sie eine mediale Arthrotomie parapatellare und sublux die Quadrizeps-Patellasehne Streckapparat seitlich mit einem Adson Pinzette. HINWEIS: Dies bringt die Inzisur des Oberschenkelknochens in der normalen Ansicht. </li><li> Manuell Ries der Markkanal mit einer 25 G-Nadel, gefolgt von einer 23 G-Nadel. Hinweis: Um Schäden zu vermeiden, um Femur, kann eine stabilisierende Plattform verwendet werden. Dies wichtig, die Technik sein, um eine versehentliche Bruch des Oberschenkelknochens zu minimieren. </li><li> Legen Sie eine medizinischem Titan Kirschner-Draht (0,8 mm Durchmesser) unter Verwendung einer Press-fit-Technik, die von Hand schieben bringt es mit einem Stifthalter, in einer rückläufigen Richtung in den Markkanal. HINWEIS: Titan K-Drähte wurden verwendet, da es weniger Artefakte auf den μCT Bilder mit Titan K-Drähte im Vergleich zu Edelstahl K-Drähte 16 zu sehen. </li><li> Schneiden Sie das Ende des Kirschner-Drahtes mit Stiftschneider, so daß das abgeschnittene Ende des K-Drahtes etwa 1 mm in das Kniegelenk Raum erstreckt. </li><li> Mit einer Mikropipette, Pipetten 2 ul 1 x 10 3 CFU biolumineszenter S. aureus Xen29 auf die Spitze des Implantats im Kniegelenk Raum. HINWEIS: Mehr Volumen führt zu größeren Gewebekontamination und weniger diskrete Bildgebung. HINWEIS: In nicht-infizierten Kontrollmäusen, fügen Sie 2 ul steriler Kochsalzlösung ohne Bakterien. </li><li> Reduzieren Sie die Quadrizeps-Patella-Komplex zurück zur Mittellinie mit einer Pinzette, und schließen Sie die darüber liegende subkutane Gewebe und die Haut mit resorbierbarensubkutikuläre Nähten. HINWEIS: ein Tier nicht unbeaufsichtigt lassen, bis er das Bewusstsein wiedererlangt, um ausreichend Brustlage zu halten. Sie ein Tier, das Operation, um der Gesellschaft von anderen Tieren unterzogen wurde, bis vollständig erholt nicht zurück. </li><li> Am Ende der Versuche, alle Tiere euthanasiert mit Kohlendioxidinhalation nach der Johns Hopkins Animal Care und Use Committee Richtlinien. Überprüfen Sie, ob der Tod durch die Beobachtung der Tier nicht innerhalb von 10 Minuten nach der Kohlendioxid-Exposition endet und Genickbruch zu erholen. </li></ol> 3. 2D-Optical Imaging (In-vivo-Biolumineszenz und Fluoreszenz-Imaging) <ol><li> Betäuben LysEGFP Mäusen (zB 2% Isofluran Inhalation) und legen Sie sie mit Bauchseite nach oben in einem bildgebenden Kammer. </li><li> Führen Sie in vivo Biolumineszenz-Bildgebung mit dem IVIS Spectrum optische ganze Tier in vivo-Bildgebungssystem. Prüfen Sie zunächst, Leucht und bestätigen Sie die Wahl einer offenen fILTER Auswahl, Sichtfeld (FOV) C - 13 cm, und blättern Sie die Belichtungszeit, um den Auto (Belichtungsautomatik-Einstellung). Belichtungsautomatik wird Akquisitionszeit (Verschlusszeit), Binning (digital Binning) und Blende (Apertur) des Instruments an Signalintensität zu optimieren bei gleichzeitiger Vermeidung der Sättigung automatisch einzustellen. Dann klicken Sie erwerben, um das Biolumineszenz-Bild aufzunehmen. HINWEIS: Für die in vivo Biolumineszenz-Bildgebung, Bild Mäuse von 1 - 5 min. </li><li> Sequentielle in vivo Fluoreszenz-Bildgebung, indem Sie das Kontrollkästchen neben Leuchtstoff. Wählen Sie die 465 nm Anregungsfilter und 520 nm Emissionsfilter. Blättern Sie Belichtungszeit, um den Auto und wählen FOV C (Schritt 3.2.1). Erwerben Sie dann auf, um die Fluoreszenz Bild aufzunehmen. HINWEIS: Für die in vivo Fluoreszenz-Bildgebung, Bild Mäuse zwischen 0,5 sek. </li><li> Quantifizierung der in vivo Biolumineszenz-Signale als Gesamtfluss (Photonen / sec) in einer Region of Interest (ROI) mit Wohnzimmer-Image Software, indem Sie zuerst den Ausbau derROI-Tools Abschnitt der Tool-Palette. <ol><li> Wählen Sie das Kreis-Symbol und die Anzahl der ROIs, die auf die Anzahl der Tiere in der Betreff FOV entsprechen. Die Größe der ROI, die Region von Interesse, dh umfassen, die Biolumineszenz-Diffusionsmuster gesammelt. </li><li> Wählen Sie Messen ROIs in ROI-Tools in der Tool-Palette und der ROI Messfenster wird angezeigt. Radiance (Photonen / sec) Werte insgesamt stellen die Summe der Biolumineszenz Pixel innerhalb der ROI generiert. </li><li> Wählen Sie die SELECT ALL und kopieren Registerkarten in der unteren rechten Ecke des Fensters werden die Informationen in die Zwischenablage Einfügen in nachfolgenden Programmen zur Analyse übertragen und ermöglichen. </li></ol></li><li> Quantifizierung der in vivo Fluoreszenzsignale als Gesamtstrahlungsleistung ([Photonen / sec] / [uW / cm 2]) in einem kreisförmigen Bereich von Interesse (ROI) mit Wohnzimmer-Image Software. <ol><li> Innerhalb der Wohn Bild Software-Fenster, erweitern ROI-Tools in der Tool-Palette. Wählendas Kreissymbol und die Anzahl von ROIs, die der Anzahl der Zieltiere im FOV entspricht. </li><li> Die Größe der ROI, die Region von Interesse entsprechenden eng mit der Biolumineszenz-Signal aus dem vorherigen Bildaufnahme umfassen. </li><li> Wählen Sie Messen ROIs in ROI-Tools in der Tool-Palette und der ROI Messfenster wird angezeigt. HINWEIS: Gesamtstrahlungsleistung ([Photonen / s] / [uW / cm 2]) stellt die Summen der Fluoreszenz Pixel innerhalb der ROI. </li><li> Alle auswählen und kopieren Registerkarten in der unteren rechten Ecke des Fensters werden die Informationen in die Zwischenablage Einfügen in nachfolgenden Programmen zur Analyse übertragen und ermöglichen. </li></ol></li></ol> 4. μCT Image Acquisition <ol><li> Legen Sie die narkotisierten Mäusen LysEGFP in eine Abbildungskammer. HINWEIS: Diese Abbildungskammer wurde entwickelt, um sowohl in der IVIS Spectrum Imaging-System und dem Quantum FX in vivo μCT-Bildgebungssystem, damit passenCo-Registrierung der optischen und μCT Bilder. </li><li> Öffnen Sie die CT-Software und wählen Sie das Menü voreingestellten 60 mm FOV std dynamische aus der Dropdown. </li><li> Legen Sie die große Bohrung Abdeckung und den Adapter Arm für die Abbildung Shuttle in das Instrument. </li><li> Platzieren Sie die Maus Imaging-Shuttle in den Adapter Arm drücken Sie dann den Arm in die Bohrung und die Tür schließen. Schalten Sie den Live-Modus (das Auge Taste auf der Systemsteuerung) und positionieren Sie das Motiv in der 0 ° und 90 ° Gantry Position mit der X-Achse und Y-Achse steuert, um das Tier in der X-Capture-Fenster zu zentrieren. Dann schalten Sie den Live-Modus, indem Sie den Eye Button. </li><li> Erwerben Sie eine dynamische Scan-Bild mit der 60 mm FOV, indem Sie auf den CT-Scan-Taste (neben dem Live-Modus-Taste). Exportieren Sie die erworbene Bild im DICOM-Format und an einem Ort, der später zugegriffen werden kann. Anmerkung: Die ungefähre Dosis 26 mGy pro Scan sein. Eine 30 mm FOV kann verwendet werden, wenn eine höhere Auflösung gewünscht wird. </li></ol> 5.3D Optical Image Acquisition, Formation und μCT Co-Registrierung <ol><li> Platzieren Sie die Maus Imaging-Shuttle-Einsatz in das Spektrum, indem Sie den Shuttle-Bildgebung, die die Maus in diesem Einsatz und sicherzustellen, dass die Maus nicht bewegen. </li><li> Mit Wohnzimmer Bildes wählen Imaging-Assistenten in der Systemsteuerung Nahme, um den Assistenten Setup zu beginnen. Zu starten, wählen Sie Biolumineszenz, dann DLIT, und wählen Sie dann die Reporter &quot;Bakterien&quot; aus dem Dropdown-Menü und die entsprechenden Emissionsfilter für das Modell wird automatisch gewählt werden, in diesem Fall, 500 - 620 nm. <ol><li> Wählen Sie auf Weiter, dann bezeichnen die Erfassungsparameter und unter Informationen im letzten Fenster. Insbesondere wird Imaging Betreff Maus sein, wird Auto-Einstellungen gewählt werden so dass der Belichtungsautomatik, um die Signalqualität zu maximieren bei gleichzeitiger Vermeidung Sättigung und Field of View wird auf C eingestellt werden - 13cm. </li><li> Wählen Sie Fertigstellen der letzten Fenster und das Fenster Reihenfolge der Übernahme-Panel wird einie automatisch mit der Folge DLIT besiedelt. Es wird ein Bild pro gewählt Emissionsfilter und Belichtungsautomatik wird die optimalen Einstellungen wählen bei jeder Wellenlänge nach den Imaging-Assistent Auswahl erworben sein. Die erzeugte Sequenz enthält auch eine strukturierte Leuchte für Thema Flächenerzeugung über die Oberflächentopographie Werkzeug unten beschrieben benötigt. </li></ol></li><li> Wählen Sie Acquire Sequenz, um die Daten zu erfassen DLIT. </li><li> Nach der Bildaufnahme abgeschlossen ist, erzeugt die Oberflächentopographie. Starten Sie durch die Erweiterung der Registerkarte Oberflächentopographie unter der Tool-Palette. <ol><li> Als nächstes wählen Sie die Ausrichtung, die genau spiegelt die Seite des Tieres vor der Kamera oder Oberseite des IVIS Instrument. Dann klicken Sie auf Gene Oberfläche. Zuschneiden der Region des FOV, die das Tier enthält. </li><li> Dann nutzen Sie die lila Maske, um die Grenzen des Tieres zu definieren. HINWEIS: Das Maskenwerkzeug verwendet Farbkontrast so Tiere mit dunklem Fell oder Haut wird nicht richtig von dem s-Masketage. </li><li> Wählen Sie Fertig, und die Oberfläche wird automatisch angezeigt. Speichern Sie das Ergebnis unter dem Reiter Oberflächentopographie schließen Sie dann die Registerkarte als wir nicht mehr brauchen. </li></ol></li><li> Rekonstruktion der optischen 3D-Quellenposition unter Verwendung der in Wohnzimmer Bild 22 durch die Erweiterung der Registerkarte DLIT 3D-Rekonstruktion durchgeführt diffuse optische Rekonstruktionsalgorithmen. <ol><li> Bilder für die DLIT Sequenz aufgenommen werden angezeigt. HINWEIS: Die Software überprüft automatisch die Qualität der erfassten Daten und Bilder deaktivieren als zu schwach oder wo Sättigung vorhanden ist. Wählen Sie Start auf der rechten unteren Seite. </li><li> Bei Bedarf kann man die Schwelle für jede Biolumineszenz-Bild mit einem Doppelklick anpassen und mit Hilfe der Schwellenschieberegler auf der unteren linken Seite. HINWEIS: Dies ist vor allem auf niedrigere Intensitätssignal und Vorsicht gehören sollte, wenn Schwellen höher, da dies Gesamtintensität des letzten rekonstruierten Quelle einstellen geübt werden. </li><li&gt; Wenn mit dem Schwellenwert erfüllt, wählen Sie rekonstruieren die automatische Ausführung der Rekonstruktionsalgorithmen, die in einer 3D-Darstellung der optischen Quelle führt. </li></ol></li><li> Öffnen Sie die DICOM-Browser durch Klicken auf die 3D-Symbol in der Werkzeugleiste am oberen Rand der Software (Dritter von links) und die Suche nach dem Quantum FX Bild zuvor erworben. <ol><li> Laden Sie dieses Bild in den Wohn Registerkarte Bild 3D-Ansicht mit einem Doppelklick auf die Datei für den Import. HINWEIS: Die Bezugs sollte automatisch erkannt und führen zur μCT Bild werden, die mit dem optischen 3D-Bild registriert. </li></ol></li><li> Deaktivieren Sie die Oberflächentopographie Visualisierung Karte erweitert 3D optische Werkzeuge in der Tool-Palette und deaktivieren Sie das Kontrollkästchen Anzeige Betreff Oberfläche in der Registerkarte Oberfläche. </li><li> Eine Lookup-Tabelle, um das Skelett und die K-Draht-Implantat, das in der μCT Bild mit dem Histogramm unter der Registerkarte Lautstärke des 3D-Multi-Modali sichtbar visualisieren manuell erstellenty Abschnitt Tools der Tool-Palette. <ol><li> Das Histogramm zeigt die Verteilung der Voxel-Intensitäten in den 3D-Messdaten und der Farbtrübung. Um festzustellen, wo das jeweilige Gewebe von Interesse ist im Histogramm, verwenden Sie den Schieberegler, Werkzeug, um die Rendering-Schwelle, bis das Gewebe oder die Struktur sichtbar ist. </li><li> Klicken Sie dann rechts im Histogramm, um Punkte zu generieren und bilden eine Kurve, um diesen Bereich des Histogramms zu isolieren. Dies wird für jede Struktur wiederholt werden - Skelett gefolgt von der K-Draht-Implantats und kann gespeichert werden als eine Nachschlagetabelle für zukünftige Analysen. </li><li> Komponenten können farbcodiert, wenn so mit einem Doppelklick gewünschten jede erzeugte Punkt im Histogramm und die gewünschte Farbe aus der Pop-up-Fenster. </li></ol></li></ol> 6. μCT Bild Visualisierung und Analyse <ol><li> Mit Hilfe des Quantum FX-Software, wählen Sie das Bild von Interesse und Viewer starten. Wählen Sie das Drehen-Werkzeug und das Bild neu zu orientieren Visualize der Längsachse des Oberschenkelknochens. Wählen Sie das Messwerkzeug und messen Sie die Länge des Oberschenkelknochens. </li><li> Starten Sie die 3D-Viewer, um 3D-Renderings zu erzeugen. Stellen Sie die Schwelle, um die Änderungen in der Knochenanatomie mit Implantat-Infektion zeigen. </li><li> Schnittebenen gelten, so dass das 3D-Rendering wird auf das gewünschte Querschnittsabschnitt des Bereichs von Interesse in dem distalen Femur. </li><li> Starten Sie das Analysieren 11.0 Software-Paket. Laden Sie die Datei * .vox, die verwendet wurde, um die 3D-Rendering zu erstellen. </li><li> Starten Sie das Bild Rechner-Tool. Verwenden Sie das Werkzeug des &quot;Region Pad &#39;, um das Bild zu beschneiden (Flugzeuge, die keine den Oberschenkelknochen entfernen). </li><li> Starten Sie die Schrägschnitte Werkzeug. Mit der Option 3 Punkte, Punkte in der Mitte des Femurs Trochanter major und dem Ende des Stifts zu finden. Stellen Sie diese Punkte eine schiefe Ebene und erzeugen ein Bild mit neuen Scheiben. </li><li> Starten Sie die Region of Interest-Tool. Zeigen Sie die transaxialen Scheiben schneiden. Stellen Sie die min und max-Einstellungs zu den kortikalen Knochen anzuzeigen. Erstellen Konturen für die entsprechenden Scheiben für ein paar Scheiben (mit einem ungefähren Intervall von 5 Scheiben) für die Scheiben entsprechend der distalen 25% des Femurs. Verwenden Sie das Tool &quot;Propagieren Regionen, zwischen diesen Konturen zu interpolieren, und erstellen Sie eine 3D-Bereich von Interesse. Speichern Sie diese Region von Interesse als ein Objekt Karte. </li><li> Starten Sie die &quot;Sample Optionen&quot;-Tool. Wählen Sie das Kontrollkästchen für die Objektkarte, die gerade erstellt wurde, und wählen Sie die Optionsfelder für die entsprechenden Optionen. Klicken Sie auf &quot;Konfigurieren Anmelden Stats&quot;-Taste, um zu bestätigen, dass die &#39;Lautstärke&#39; Kontrollkästchen aktiviert ist. Klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Beispielbilder&quot;, um die tatsächlichen Messungen. </li><li> Exportieren Sie die Volumenmessungen in ein Datenanalyseprogramm. Normalisieren die äußeren Knochenmengen aus späteren Zeitpunkten auf die erste abgebildet Zeitpunkt nach der Formel: Δ Volumen (%) = ([Volume (Tag X) - Volume (Tag 2)] / [Volume (Tag 2)]) x 100 . HINWEIS: In dieser Formel ist die Variable &quot;X&quot; steht für die Zeit in der Umgebung. Die resultierende Zahl wird die Änderung in der Größe der äußeren Knochenvolumen des distalen Oberschenkelknochens mit der Zeit darzustellen. </li><li> Um den 3D-Bereich von Interesse auf der Oberseite der Knochen sichtbar zu machen, laden Sie das CT-Bild in der &quot;Volume Render&quot;-Tool. Legen Sie das Objekt, das die 3D-Karte Region von Interesse. Gehen Sie zu &#39;View&#39;&#39;Objects&#39; und stellen Sie die &quot;Original&quot; auf &quot;On&quot; zu sein. Öffnen Sie das Fenster &quot;Vorschau&quot;. Starten Sie das Menü &quot;Rendertypen&quot; und wählen Sie &quot;Objekt Compositing&quot;. </li><li> Klicken Sie auf den &quot;Threshold&quot;-Taste und Werkzeug und stellen Sie die Schwellenwerte, um den Knochen und Objekt Karte anzuzeigen. Verwenden Sie den gleichen festen Schwellenbereich für alle Zeitpunkte. Klicken Sie auf die &#39;Rotation&#39; Taste, und stellen Sie die Ausrichtung auf eine wahre anterolateralen Ansicht sein. Klicken Sie auf &quot;Rendern&quot;, um das finale Rendering zu erzeugen. Speichern Sie das Rendering von der Haupt &#39;VolumeRender &quot;Fenster. </li></ol>

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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+in+vivo+bioluminescent+sources+based+on+multispectral+imaging.">Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging.</a> J Biomed Opt. 12, 024007 (2007).</li><li>Kim, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+survival+and+c-kit+-progenitor+proliferation+in+Staphylococcus+aureus-infected+skin+wounds+promote+resolution.">Neutrophil survival and c-kit+-progenitor proliferation in Staphylococcus aureus-infected skin wounds promote resolution.</a> Blood. 117, 3343-3352 (2011).</li><li>Deirmengian, C. A., Lonner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What's+new+in+adult+reconstructive+knee+surgery.">What's new in adult reconstructive knee surgery.</a> J Bone Joint Surg Am. 94, 182-188 (2012).</li><li>Ning, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maltodextrin-based+imaging+probes+detect+bacteria+in+vivo+with+high+sensitivity+and+specificity.">Maltodextrin-based imaging probes detect bacteria in vivo with high sensitivity and specificity.</a> Nat Mater. 10, 602-607 (2011).</li><li>Panizzi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+detection+of+Staphylococcus+aureus+endocarditis+by+targeting+pathogen-specific+prothrombin+activation.">In vivo detection of Staphylococcus aureus endocarditis by targeting pathogen-specific prothrombin activation.</a> Nat Med. 17, 1142-1146 (2011).</li><li>van Oosten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Realtime+in+vivo+imaging+of+invasive+and+biomaterial+associated+bacterial+infections+using+fluorescently+labelled+vancomycin.">Realtime in vivo imaging of invasive and biomaterial associated bacterial infections using fluorescently labelled vancomycin.</a> Nat Commun. 4, 2584 (2013).</li><li>Kong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tuberculosis+with+endogenous+beta+lactamase+reporter+enzyme+fluorescence+in+live+mice.">Imaging tuberculosis with endogenous beta lactamase reporter enzyme fluorescence in live mice.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107, 12239-12244 (2010).</li></ol>

JAM, BNT, EL, NZ, KPF sind bezahlte Mitarbeiter von PerkinElmer, die die Bildgebung Instrumente produziert, sofern die Xen29 Biolumineszenz S. aureus-Stamm, und für die Kosten der Veröffentlichung dieses Videos-Artikel bezahlt. Die übrigen Autoren haben nichts zu offenbaren.

Multimodalität Bildgebung, wie bildgebende Verfahren, die in vivo optische Bildgebung in Verbindung mit μCT Bildgebung nutzen eine neue technologische Ansatz, der die 3D-Visualisierung, Quantifizierung und Überwachung der Längs biologischen Prozesse in einem anatomischen Zusammenhang 1-4 erlaubt. Die Protokolle in der vorliegenden Studie bieten detaillierte Informationen, wie in vivo Biolumineszenz-und Fluoreszenz-Imaging mit μCT Bildgebung in einer orthopädischen Prothesenimplantat Infektionsmodell in Mäusen kombiniert, um die bakterielle Belastung, neutrophile Entzündung und anatomische Veränderungen im Knochen nicht-invasiv und in Längsrichtung über überwachen Zeit. Zusammen, die durch die Kombination von optischen und strukturellen Bildgebung gewonnenen Informationen stellt einen großen technologischen Fortschritt, die sein können, besonders gut geeignet, um biologische Prozesse und pathologischen Bedingungen, die den Bewegungsapparat beeinflussen zu studieren. Ein Interesseing Feststellung, dass darauf hingewiesen werden sollte, ist, dass wir beobachtet, dass die EGFP-Neutrophilen Fluoreszenzsignale verringert wird, um Hintergrundwerte von 14-21 Tagen und blieb auf Hintergrundwerte für die Dauer des Experiments, obwohl die Anwesenheit von biolumineszenten Bakterien. Es ist unwahrscheinlich, dass die Röntgenstrahlung beeinflusst Neutrophilen Überleben beobachteten wir ähnliche Kinetik der Neutrophilen-Signale in nicht-bestrahlten Mäusen 19. In unseren früheren Arbeiten, bei denen ein Modell von S. aureus infizierten Wunden, beteiligt neutrophile Infiltration eine Kombination aus robusten Neutrophilenrekrutierung aus dem Kreislauf, verlängert das Überleben von Neutrophilen an den Ort der Infektion und dem Homing von KIT + Vorläuferzellen an der Abszess, wo sie vor Ort führen zu Neutrophilen 23 reifen. Es ist wahrscheinlich, dass ähnliche Prozesse beigetragen Neutrophilen-Infiltration in der orthopädischen Implantat S. aureus-Infektionsmodell. Obwohl es nicht bekannt ist, warum die Neutrophilen Signale im Orthop verringerteaedic Infektionsmodell könnte es sein, dass die Immunantwort über die Zeit verändert, wie dies voran Infektion von einer akuten zu einer chronischen Infektion und dies ist ein Gegenstand zukünftiger Untersuchungen. Es gibt Einschränkungen mit diesem Mausmodell der orthopädischen Gelenkprothese Infektion und der In-vivo-Bildgebung, die Multimodalität beachtet werden sollte. Erstens ist dies eine zu starke Vereinfachung Maus-Modell der aktuellen Verfahren und Materialien in der orthopädischen Chirurgie bei Menschen 24 verwendet. Dennoch tut dies Modell rekapitulieren die chronische Infektion und die daraus resultierenden Entzündung im Knochen-und Gelenkgewebe, das in der menschlichen orthopädischen Implantatinfektionen 8,9 zu sehen ist. Zusätzlich zu den μCT Bilder zu erhalten, wurden relativ niedrige Dosen von Röntgenstrahlung verwendet, um negative Auswirkungen auf die Gesundheit der Tiere im Verlauf der Infektion zu minimieren. Für eine bessere Auflösung von Knochen, höhere Dosen von Röntgenstrahlung könnte für μCT Bildgebung verwendet werden eingeschläfert auf einnimals. Dies würde jedoch die Möglichkeit zu beseitigen, um die Knochenveränderungen über die Dauer der Experimente nicht-invasiv und in Längsrichtung überwacht. Im Ergebnis hat die multimodale Bildgebung, die die Kombination von In-vivo-Tier ganze optische Bildgebung mit anatomischen Bildgebung μCT umfassendere Informationen über die Infektion und entzündliche Reaktion erlaubt. Außerdem haben diese Techniken die Auswertung der Folgen der Infektion und Entzündung an der Knochen-und Gelenksgewebe erlaubt. Zukünftige Arbeiten könnten sich die Vorteile der Multimodalität Bildgebung zu ergreifen, um die Wirksamkeit von antimikrobiellen Therapien, Immunreaktionen, Pathogenese der Krankheit und den reaktiven Veränderungen im Knochen zu bewerten, wie wir begonnen haben, 14-18 zu untersuchen. Darüber hinaus könnte die multimodale Bildgebungssonden und Tracer zu evaluieren, das Vorliegen einer Infektion zu diagnostizieren, wie zuvor in Tiermodellen eine Oberschenkel-Infektion, Endocarditis, Lungen InfectIonen und Biomaterial-Infektionen 25-28. Schließlich könnte der Einsatz der multimodalen Bildgebung über Infektionskrankheiten erweitert und zwischen den Disziplinen, einschließlich Orthopädie, Rheumatologie und Onkologie verwendet werden, um andere Bedingungen zu untersuchen, die auf das Muskel-Skelett-System, wie Skelett Krebs, Metastasen, Frakturen und Arthritis 5-7 .

Multimodalität Präklinische Bildgebung Techniken, die die Kombination von optischen und anatomischen Informationen beinhalten ermöglichen die Visualisierung und Überwachung von biologischen Phänomene in 3D 1-4. Seit μCT-Bildgebung ermöglicht die exquisite Visualisierung von Knochenanatomie, mit μCT Bildgebung in Verbindung mit der optischen Abbildung stellt eine einzigartige Kombination, die besonders nützlich für die Untersuchung von Prozessen, die Knochenbiologie 5-7 einzubeziehen sein könnten. Ein Beispiel wäre, diese Techniken verwenden, um orthopädische Implantatinfektionen, die eine verheerende Komplikation nach orthopädischen chirurgischen Verfahren repräsentieren 8,9 studieren. Bakterien Biofilme auf den implantierten Fremdkörper, die das Überleben der Bakterien zu fördern, indem sie als physikalische Barriere, die Immunzellen aus Erfassen der Infektion und blockiert den Zugriff auf Antibiotika die Bakterien verhindert 10,11 dient. Die chronische und persistierende Infektion der Gelenkgewebe (septische Arthritis) eined Knochen (Osteomyelitis) induziert Knochenresorption, die zur Lockerung der Prothese und letztendlich zum Scheitern 8,9 führt. Diese resultierende periprothetischer Osteolyse mit einer erhöhten Morbidität und Mortalität 12,13 verbunden. In unserer früheren Arbeit, in vivo biolumineszenten und Fluoreszenz-Bildgebung wurde mit Röntgen-und Mikro-Computertomographie-Bildgebung (μCT) in einer orthopädischen Gelenkprotheseninfektionsmodell in Mäusen 14-19 verwendet. Dieses Modell beinhaltete, daß eine Titan-Kirschner-Draht (K-Leitung) in der Weise, daß das abgeschnittene Ende des Implantates im Kniegelenk aus den Oberschenkelknochen von Mäusen 14-19 erweitert. Ein Inokulum von Staphylococcus aureus (Stamm Xen29 biolumineszierende oder Xen36) wurde dann auf die Oberfläche des Implantates im Kniegelenk pipettiert, bevor der Operationsstelle wurde 14-19 geschlossen. In vivo Abbildungsoptik verwendet, um zu detektieren und zu quantifizieren, die Biolumineszenz-Signale, die entsprach der nummer von Bakterien im infizierten Gelenk-und Knochengewebe 14-19. Zusätzlich wird in vivo Fluoreszenzmikroskopie der LysEGFP Mäusen, die Fluoreszenz Neutrophile 20 besitzen, verwendet, um die Anzahl von Neutrophilen, die mit den infizierten Kniegelenke mit den K-Draht Implantate 14,19 wandert quantifizieren. Schließlich anatomischen Bildgebungsmodalitäten, einschließlich hochauflösender Röntgenbildgebung und μCT Bildgebung erlaubt jeweiligen 2D und 3D anatomischen Bildgebung des betroffenen Knochens über die gesamte Dauer der chronischen Infektion, die wir willkürlich in der Regel am Ende zwischen 2 und 6 Wochen nach der Operation 16 , 18. Mit diesem Modell könnte die Wirksamkeit von lokalen und systemischen antimikrobiellen Therapie, schützende Immunantworten und pathologischen anatomischen Veränderungen der Knochen ausgewertet 14-18 werden. In diesem Manuskript wurden die detaillierten Protokolle für die optischen und μCT bildgebenden Modalitäten in diesem orthopädischen Gelenkprothese Infektionsmodell als Vertre bereitgestelltve System, um biologische Prozesse in der anatomischen Zusammenhang der Knochen studieren. Diese schließen die chirurgischen Verfahren, die eine orthopädische Gelenkprothesen-Infektion in Mäusen zu modellieren, 2D und 3D in vivo optischen Bildgebungsverfahren (für bakterielle Biolumineszenz-Signale und Fluoreszenzsignale zu detektieren Neutrophilen) μCT Abbildungserfassung und Analyse und Co-Registrierung von optischen 3D-Bilder mit der μCT Bilder.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Xen36 bioluminescent Staphylococcus aureus strain</td>
			<td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td>
			<td></td>
			<td>Bioluminescent Staphylococcus aureus strain derived from ATCC 49525 (Wright), a clinical isolate from a bacteremia patient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy broth</td>
			<td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>211825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Soy Agar</td>
			<td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysEGFP knockin mouse strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Not commercially available. This strain contains a knockin of enhanced green fluorescence protein (EGFP) into the lysozyme M gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Purdue Products, Stamford, CT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kirschner-wire (titanium, 0.8 mm diameter)</td>
			<td>Synthes, West Chester, PA</td>
			<td>492.08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire Cutter - Duracut T.C.</td>
			<td>H&#38;H Company, Ontario, Canada</td>
			<td>83-7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter, Deerfield, IL</td>
			<td>118718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl 5-0 sutures (P-3 Reverse cutting)</td>
			<td>Ethicon, Summerville, NJ. Purchased through VWR International.</td>
			<td>95056-936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sustained-release Buprenorphine (5 ml - 1 mg/ml)</td>
			<td>Zoopharm, Windsor, CO</td>
			<td></td>
			<td>analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Product/ID/IVISSPE?utm_source=JoVE&amp;utm_medium=display&amp;utm_content=LST-IDT2014-GLO-Q414-JoVE&amp;utm_campaign=LST-IDT2014-GLO">IVIS Spectrum Imaging System</a></td>
			<td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td>
			<td></td>
			<td>optical in vivo imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Category/ID/Quantum%20FX%20%20microCT?utm_source=JoVE&amp;utm_medium=display&amp;utm_content=LST-IDT2014-GLO-Q414-JoVE&amp;utm_campaign=LST-IDT2014-GLO">Quantum FX in vivo &#956;CT system</a></td>
			<td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td>
			<td></td>
			<td>&#956;CT in vivo imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Category/ID/Living%20Image%20Software?utm_source=JoVE&amp;utm_medium=display&amp;utm_content=LST-IDT2014-GLO-Q414-JoVE&amp;utm_campaign=LST-IDT2014-GLO">IVIS SpectrumCT Imaging System</a></td>
			<td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td>
			<td></td>
			<td>combined optical and &#956;CT in vivo imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Product/ID/119240?utm_source=JoVE&amp;utm_medium=display&amp;utm_content=LST-IDT2014-GLO-Q414-JoVE&amp;utm_campaign=LST-IDT2014-GLO">Living Image Software</a></td>
			<td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis software for in vivo optical imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combined in vivo optical and &#181;ct imaging to monitor infection, inflammation, and bone anatomy in an orthopaedic implant infection in mice

Multimodalität Bildgebung hat als gemeinsamen technologischen Ansatz sowohl in der präklinischen und klinischen Forschung eingesetzt entstanden. Fortgeschrittene Techniken, die in vivo optische und μCT-Bildgebung zu kombinieren ermöglichen die Visualisierung biologischer Phänomene in einem anatomischen Zusammenhang. Diese bildgebenden Verfahren kann besonders nützlich sein, um Bedingungen zu untersuchen, die Auswirkungen Knochen. Insbesondere orthopädische Implantat-Infektionen sind ein wichtiges Problem in der klinischen orthopädischen Chirurgie. Diese Infektionen sind schwer zu behandeln, weil bakterielle Biofilme bilden sich auf den fremden Materialien chirurgisch implantiert, was zu anhaltenden Entzündungen, Osteomyelitis und eventuelle Osteolyse des Knochens das Implantat, was schließlich zu Implantatlockerung und Miss Umgebung. Hier wird ein Mausmodell einer infizierten orthopädischen Prothesenimplantat verwendet wurde, das die chirurgische Platzierung einer Kirschner-Draht-Implantats derart eingebunden in einen Markkanal des Oberschenkelknochens, dass das Ende des Implantats ein das Kniegelenk XTended. In diesem Modell LysEGFP Mäusen, einem Mausstamm, der EGFP-Fluoreszenz Neutrophilen wurden in Verbindung mit einem Biolumineszenz-Staphylococcus aureus-Stamm, der natürlicherweise Licht aussendet, verwendet. Die Bakterien wurden in den Kniegelenken der Mäuse vor dem Schließen der Operationsstelle geimpft. In vivo Biolumineszenz-und Fluoreszenzabbildung verwendet, um die bakterielle Belastung und neutrophile Entzündungsreaktion zu quantifizieren sind. Zusätzlich wurde μCT Bildgebung auf der gleichen Mäusen durchgeführt, so daß die 3D-Position der biolumineszenten und fluoreszierende optische Signale können mit den anatomischen μCT Bilder zusammen registriert werden. Um die Änderungen in den Knochen über die Zeit quantifizieren, wurden die äußeren Knochenvolumen der distalen Oberschenkelknochen zu bestimmten Zeitpunkten unter Verwendung eines halbautomatischen Kontur basierend Segmentierungsprozess gemessen. Zusammengenommen ist die Kombination von in vivo Biolumineszenz / Fluoreszenz-Imaging mit μCT-Bildgebung kann besonders nützlich sein, foder die nicht-invasive Überwachung der Infektion, Entzündungsreaktion und anatomischen Veränderungen der Knochen im Laufe der Zeit.

In-vivo-Biolumineszenz-und Fluoreszenzabbildungs In der vorliegenden Studie wird das Protokoll für diese bereits veröffentlichten Modell einer orthopädischen Gelenkprothesen Infektion in Mäusen 14-19, die die chirurgische Platzierung einer Titan-K-Draht-Implantat, das aus einem Knochenmarkkanal in die Fuge erstreckt sich in den Femur umfasst beschriebene Platz 14-19. S. aureus Stamm biolumineszenten Xen29 (1 × 10 3 CFU in 2 ul PBS) wurde direkt auf die Oberseite des Endes Titanimplantat in das Kniegelenk vor dem Schließen der Operationsstelle 16 pipettiert. Zu visualisieren und zu quantifizieren, die bakterielle Belastung und Neutrophileneinstrom nichtinvasiv an narkotisierten Mäusen LysEGFP, wurde in vivo ganze Tier optische Bildgebung für Bild nacheinander durchgeführt die Biolumineszenz-Signale von den Bakterien und die EGFP Fluoreszenzsignale aus den Neutrophilen infiltriert mit dem IVIS Spectrum optische ganze Tier in vivoAbbildungssystem auf drei Tage nach der Operation (dh den Tagen 2, 14 und 28). Die Biolumineszenz-Signale Xen29-infizierten Mäusen blieb über Hintergrundsignale von Schein-infizierten Mäusen für die Dauer des Experiments (1A, C) 16. Unserer früheren Arbeit zeigten, daß die in vivo-Biolumineszenz-Signale genau die Zahl der ex vivo CFU vom Gelenk / Knochengewebe isoliert und haft den Implantaten 17,18 angenähert. Darüber hinaus wurden die EGFP Fluoreszenz-Signale höher als Schein-infizierten Mäusen zu frühen Zeitpunkten, sondern näherte Hintergrundwerte im Verlauf der Infektion (Abbildung 2B, C) ​​16. 3D-Co-Registrierung von in vivo optische Signale mit μCT Bilder Um die optischen Signale (dh bakterielle Biolumineszenz-und EGFP-Fluoreszenz-Signale) im anatomischen Kontext der postoperativen Kniegelenke visualisieren in 3D, waren die optischen Bilder die unter Verwendung des IVIS Spectrum Imaging-System Co-registriert mit μCT Bilder erzeugt mit Hilfe des Quantum FX μCT-Bildgebungssystem. Diese Co-Registrierung kann erreicht werden, weil die Maus Abbildungskammer kann entweder in Maschinen eingefügt, um sicherzustellen, dass die Mäuse in der exakt gleichen Ausrichtung sein. Um diese Genauigkeit zu verifizieren, wurden die Ergebnisse mit einer Bildaufnahme unter Verwendung des IVIS Spectrum-CT in vivo-Bildgebungssystem, die beiden Modalitäten in einem Gerät integriert, ohne die physikalische Verlagerung des Tieres. Um die optischen Daten auf die μCT-Bilder in 3D abzubilden, verwendeten wir eine diffuse optische Tomographie Rekonstruktionsalgorithmus 16. Die resultierende 3D-Rekonstruktion dargestellt (Film 1). Darüber hinaus μCT Bildgebung erlaubt die Visualisierung und Quantifizierung der Folgeänderungen in der Qualität und Abmessungen der Knochen, die während aufgetretender Infektion (Figur 2) 16. Wie bereits berichtet, die äußere Knochenvolumen des distalen Femurs im wesentlichen über die Zeit erhöht (2A) 16. Um diese Veränderungen zu quantifizieren, wurde die volumetrische 3D Bildanalyse auf der distalen 25% der knöchernen Oberfläche des Femurs durchgeführt, und die Veränderungen in der Knochenvolumen im Laufe der Zeit wurden normalisiert auf die Anfangsknochenvolumens. Die äußere Knochenvolumen im wesentlichen in infizierten Mäusen im Vergleich zu Schein-infizierten Mäusen (2B) 16 erhöht. Der Anstieg im distalen Femur äußeren Knochenvolumen war aufgrund von Knochenschäden durch die Infektion der Gelenkgewebe und Knochen, die mit μCT Bildgebung und histologische Analyse 16 beobachtet wurden, verursacht wahrscheinlich. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51612/51612fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. 2D in vivo </strong&gt; Biolumineszenz-und Fluoreszenzsignale. S. aureus Xen29 oder keine Bakterien (nicht infizierten) in das Kniegelenk nach K-Draht-Anordnung und LysEGFP Mäuse wurden mit dem IVIS Spectrum Abbildungssystem 16 abgebildet wird, inokuliert. (A) verstanden, in vivo Biolumineszenz-Signale, wie durch Gesamtfluss (Photonen / sec) gemessen ± SEM. (B) Mittelwert in vivo EGFP Fluoreszenzsignale wie von Gesamtstrahlungsleistung (Photonen / s) gemessen / (uW / cm 2) ± SEM. (C) Vertreter in vivo Biolumineszenz-und Fluoreszenzsignale auf eine Schwarz-Weiß-Fotoüberlagert Bild der Mäuse. Die Nachweisgrenze der bakteriellen Belastung unter Verwendung von in vivo-Biolumineszenz-Bildgebung zwischen 1 x 10 2 und 1 × 10 3 CFU. * P &lt;0,05, † p &lt;0.01, ‡ p &lt;0,001 Xen29-infizierten Mäusen im Vergleich zu schein-infizierten Mäusen (Student-t-Test [two-tailed]). BitteHinweis Dies ist eine repräsentative Figur, die zuvor veröffentlicht mit Xen29 erzeugt und mit dem IVIS Lumina XR-Bildgebungssystem 16 abgebildet Daten enthält. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51612/51612fig1highres.jpg" target="_blank">klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51612/51612fig2highres.jpg" width="500" /> Abbildung 2. 3D μCT Bildgebung. S. aureus Xen29 oder keine Bakterien (nicht infizierten) wurden nach dem K-Draht Platzierung in das Kniegelenk eingeimpft und Mäusen wurden unter Verwendung der Quantum FX in vivo μCT System abgebildet. (A) Repräsentative 3D-Renderings von μCT Xen29 infizierten Mäusen (obere Felder) und schein-infizierten Mäusen (untere Felder). (B) Anteil der äußeren Knochenvolumenänderung (distal 25% der Oberschenkelknochen) normiert auf den ersten timich Punkt (Mittelwert ± SEM). * P &lt;0,05, † p &lt;0.01, ‡ p &lt;0,001 Xen29-infizierten Mäusen im Vergleich zu schein-infizierten Mäusen (Student-t-Test [two-tailed]). Bitte beachten Sie, dies ist eine repräsentative Figur, die zuvor veröffentlicht erzeugten Daten mit Hilfe des Biolumineszenz-Stamm S. beinhaltet aureus Xen29 und mit der Quantum FX in vivo μCT Abbildungssystem 16 abgebildet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51612/51612fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51612/Movie_1.mpg" target="_blank">Film 1</a> . Repräsentative anatomische 3D-Co-Registrierung der Xen29 Biolumineszenz-Signale und die EGFP-Neutrophilen-Fluoreszenzsignale in Kombination mit den μCT Bilder. Die Bilder werden auf der vertikalen Achse gedreht wird.

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Combined In vivo Optical and  &amp;#181;CT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

Kombinierte optische und μCT Bildgebung in einem Mausmodell der orthopädischen Implantatinfektion unter Verwendung eines Biolumineszenz-engineered Stamm von Staphylococcus aureus, sofern die Möglichkeit, die Dynamik der bakteriellen Infektion, sowie die entsprechende Entzündungsreaktion und anatomische Veränderungen in den nichtinvasiven und in Längsrichtung zu überwachen Knochen.

Kombiniert<em&gt; In-vivo-</em&gt; Optische und μCT Imaging-Infektion, Entzündung und Knochenanatomie in einem Orthopädie Implantat-Infektion in Mäuse Monitor

Multimodality imaging has emerged as a common technological approach used in both preclinical and clinical research. Advanced techniques that combine in ...

combined-vivo-optical-ct-imaging-to-monitor-infection-inflammation

Research

JoVE Journal

Medicine

Combined In vivo Optical and &#181;CT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

16.9K Aufrufe.  David Geffen School of Medicine at University of California, Los Angeles (UCLA).  Kombinierte optische und μCT Bildgebung in einem Mausmodell der orthopädischen Implantatinfektion unter Verwendung eines Biolumineszenz-engineered Stamm von Staphylococcus aureus, sofern die Möglichkeit, die Dynamik der bakteriellen Infektion, sowie die entsprechende Entzündungsreaktion und anatomische Veränderungen in den nichtinvasiven und in Längsrichtung zu überwachen Knochen. 

Serie: Combined In vivo Optical and  &#181;CT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-Photonen-Imaging der Tumorzellinvasion in einem orthotopen Mausmodell des oralen Plattenepithelkarzinoms

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Forschung

Medizin

Bronchoalveolar Lavage (BAL) for Research; Obtaining Adequate Sample Yield

We describe a research technique for fiberoptic bronchoscopy with bronchoalveolar lavage (BAL) using manual hand held suction in order to remove nonadherent cells and lung lining fluid from the mucosal surface. In research environments, BAL allows sampling of innate (lung macrophage), cellular (B- and T- cells), and humoral (immunoglobulin) responses within the lung.
BAL is internationally accepted for research purposes and since 1999 the technique has been performed in &#62; 1,000 subjects in the UK and Malawi by our group.
Our technique uses gentle hand-held suction of instilled fluid; this is designed to maximize BAL volume returned and apply minimum shear force on ciliated epithelia in order to preserve the structure and function of cells within the BAL fluid and to preserve viability to facilitate the growth of cells in ex vivo culture. The research technique therefore uses a larger volume instillate (typically in the order of 200 ml) and employs manual suction to reduce cell damage.
Patients are given local anesthetic, offered conscious sedation (midazolam), and tolerate the procedure well with minimal side effects. Verbal and written subject information improves tolerance and written informed consent is mandatory. Safety of the subject is paramount. Subjects are carefully selected using clear inclusion and exclusion criteria.
This protocol includes a description of the potential risks, and the steps taken to mitigate them, a list of contraindications, pre- and post-procedure checks, as well as precise bronchoscopy and laboratory techniques.

Bronchoalveolar Lavage BAL for Research; Obtaining Adequate Sample Yield

We describe a research technique for fiberoptic bronchoscopy and bronchoalveolar lavage using low pressure suction. The technique is used to harvest immune cells from the lung bronchoalveolar surfaces. Local anesthetic and mild conscious sedation (midazolam) is used. Subjects tolerate the procedure well and experience minimal side effects.

Bronchoalveoläre Lavage (BAL) für Forschung, Beschaffung angemessene Probenausbeute

We describe a research technique for fiberoptic bronchoscopy with bronchoalveolar lavage (BAL) using manual hand held suction in order to remove ...

Experimental Human Pneumococcal Carriage

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major source of transmission and the prerequisite of invasive disease. A model of carriage will allow accurate determination of the immunological correlates of protection, the immunizing effect of carriage and the effect of host pressure on the pathogen in the nasopharyngeal niche. Further, methods of carriage detection useful in epidemiologic studies, including vaccine studies, can be compared.
Aim
We aim to develop an EHPC platform that is a safe and useful reproducible method that could be used to down-select candidate novel pneumococcal vaccines with prevention of carriage as a surrogate of vaccine induced immunity. It will work towards testing of candidate vaccines and descriptions of the mechanisms underlying EHPC and vaccine protection from carriage1. Current conjugate vaccines against pneumococcus protect children from invasive disease although new vaccines are urgently needed as the current vaccine does not confer optimal protection against non-bacteraemic pneumonia and there has been evidence of serotype replacement with non-vaccine serotypes2-4.
Method
We inoculate with S. pneumoniae suspended in 100 &mu;l of saline. Safety is a major factor in the development of the EHPC model and is achieved through intensive volunteer screening and monitoring. A safety committee consisting of clinicians and scientists that are independent from the study provides objective feedback on a weekly basis.
The bacterial inoculum is standardized and requires that no animal products are inoculated into volunteers (vegetable-based media and saline). The doses required for colonization (104-105) are much lower than those used in animal models (107)5. Detecting pneumococcal carriage is enhanced by a high volume (ideally &gt;10 ml) nasal wash that is relatively mucus free. This protocol will deal with the most important parts of the protocol in turn. These are (a) volunteer selection, (b) pneumococcal inoculum preparation, (c) inoculation, (d) follow-up and (e) carriage detection.
Results
Our current protocol has been safe in over 100 volunteers at a range of doses using two different bacterial serotypes6. A dose ranging study using S. pneumoniae 6B and 23F is currently being conducted to determine the optimal inoculation dose for 50% carriage. A predicted 50% rate of carriage will allow the EHPC model to have high sensitivity for vaccine efficacy with small study numbers.

Experimental human pneumococcal carriage offers a natural model of carriage and a potential model for use in vaccine development. This technique is valuable yet complex and involves clinical risk by introducing a pathogen into a human. We have developed a detailed protocol.

Experimentelle Menschliche Pneumokokken Carriage

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study model. As the use of mouse models are often a vital step in preclinical drug discovery and drug development1-8, it is necessary to design a system to introduce drugs into mice in a uniform, reproducible manner. Ideally, the system should permit the collection of blood samples at regular intervals over a set time course. The ability to measure drug concentrations by mass-spectrometry, has allowed investigators to follow the changes in plasma drug levels over time in individual mice1, 9, 10. In this study, paclitaxel was introduced into transgenic mice as a continuous arterial infusion over three hours, while blood samples were simultaneously taken by retro-orbital bleeds at set time points. Carotid artery infusions are a potential alternative to jugular vein infusions, when factors such as mammary tumors or other obstructions make jugular infusions impractical. Using this technique, paclitaxel concentrations in plasma and tissue achieved similar levels as compared to jugular infusion. In this tutorial, we will demonstrate how to successfully catheterize the carotid artery by preparing an optimized catheter for the individual mouse model, then show how to insert and secure the catheter into the mouse carotid artery, thread the end of the catheter out through the back of the mouse&#8217;s neck, and hook the mouse to a pump to deliver a controlled rate of drug influx. Multiple low volume retro-orbital bleeds allow for analysis of plasma drug concentrations over time.

This method was developed with the goal of delivering a steady drug solution via the carotid artery, to assess the pharmacokinetics of novel drugs in mouse models.

Halsschlagader Infusionen für pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Analyse von Taxanen in Mäusen

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging

Cerebral malaria is a sign of severe malarial disease and is often a harbinger of death. While aggressive management can be life-saving, the detection of cerebral malaria can be difficult. We present an experimental mouse model of cerebral malaria that shares multiple features of the human disease, including edema and microvascular pathology. Using magnetic resonance imaging (MRI), we can detect and track the blood-brain barrier disruption, edema development, and subsequent brain swelling. We describe multiple MRI techniques that can visualize these pertinent pathological changes. Thus, we show that MRI represents a valuable tool to visualize and track pathological changes, such as edema, brain swelling, and microvascular pathology, in vivo.

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging

We describe a mouse model of experimental cerebral malaria and show how inflammatory and microvascular pathology can be tracked in vivo using magnetic resonance imaging.

In vivo Verfolgung von Ödementwicklung und mikrovaskulärer Pathologie in einem Modell der experimentellen zerebralen Malaria mit Magnetresonanztomographie

Cerebral malaria is a sign of severe malarial disease and is often a harbinger of death. While aggressive management can be life-saving, the detection of ...

Treatment with Vancomycin Loaded Calcium Sulphate and Autogenous Bone in an Improved Rabbit Model of Bone Infection

Bone infection results from bacterial invasion, which is extremely difficult to treat in clinical, orthopedic, and traumatic surgery. The bone infection may result in sustained inflammation, osteomyelitis, and eventual bone non-union. Establishment of a feasible, reproducible animal model is important to bone infection research and antibiotic treatment. As an in vivo model, the rabbit model is widely used in bone infection research. However, previous studies on rabbit bone infection models showed that the infection status was inconsistent, as the amount of bacteria was variable. This study presents an improved surgical method for inducing bone infection on a rabbit, by blocking the bacteria in the bone marrow. Then, multi-level evaluations can be carried out to verify the modelling method.
In general, debriding necrotic tissue and implantation of vancomycin-loaded calcium sulphate (VCS) are predominant in antibiotic treatment. Although calcium sulphate in VCS benefits osteocyte crawling and new bone growth, massive bone defects occur after debriding. Autogenous bone (AB) is an appealing strategy to overcome bone defects for the treatment of massive bone defects after debriding necrotic bone.
In this study, we used the tail bone as an autogenous bone implanted in the bone defect. Bone repair was measured using micro-computed-tomography (micro-CT) and histological analysis after animal sacrifice. As a result, in the VCS group, bone non-union was consistently obtained. In contrast, the bone defect areas in the VCS-AB group were decreased significantly. The present modeling method described a reproducible, feasible, stable method to prepare a bone infection model. The VCS-AB treatment resulted in lower bone non-union rates after antibiotic treatment. The improved bone infection model and the combination treatment of VCS and autogenous bone could be helpful in studying the underlying mechanisms in bone infection and bone regeneration pertinent to traumatology orthopedic applications.

This study presents an improved rabbit model infected with Staphylococcus aureus by blocking the same amount of bacteria in bone marrow. Vancomycin loaded calcium sulphate and autogenous bone are used for antibiotic and bone repair treatment. The protocol could be helpful for studying bone infection and regeneration.

Behandlung mit Vancomycin Calcium-Sulfat und autogener Knochen in eine verbesserte Kaninchen-Modell der Knochenentzündung geladen

Bone infection results from bacterial invasion, which is extremely difficult to treat in clinical, orthopedic, and traumatic surgery. The bone infection ...

Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

The assessment of modern sub-unit vaccines reveals that the generation of neutralizing antibodies is important but not sufficient for adjuvant selection. Therefore, adjuvants with both humoral and cellular immuno-stimulatory capabilities that are able to promote cytotoxic T lymphocytes (CTL) responses are urgently needed. Thus, faithful monitoring of adjuvant candidates that induce cross-priming and subsequently enhance CTL generation represents a crucial step in vaccine development. In here we present an application for a method that uses SIINFEKL-specific (OT-I) T cells to monitor the cross-presentation of the model antigen ovalbumin (OVA) in vivo in the presence of different adjuvant candidates. This method represents a rapid test to select adjuvants with the best cross-priming capabilities. The proliferation of CD8+ T cells is the most valuable indication of cross-priming and it is also regarded as a correlate of adjuvant-induced cross-presentation. This feature can be evaluated in different immune organs like lymph nodes and spleen. The extent of the CTL generation can also be monitored, thereby giving insights on the nature of a local (draining lymph node mainly) or a systemic response (distant lymph nodes and/or spleen). This technique further allows multiple modifications for testing drugs that can inhibit specific cross-presentation pathways and also offers the possibility to be used in different strains of conventional and genetically modified mice. In summary, the application that we present here will be useful for vaccine laboratories in industry or academia that develop or modify chemical adjuvants for vaccine research and development.

Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant&#039;s Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

We present here an application for a standard immunological technique (CFSE stained OT-I proliferation) intended to rapidly monitor adjuvant-mediated cytotoxic T lymphocyte (CTL) generation in vivo. This fast estimation of CTL capacities is useful for the development of prophylactic vaccines against intracellular pathogens as well as therapeutic cancer vaccines.

Schnelle In-Vivo Beurteilung des Adjuvans der zytotoxischen T-Lymphozyten Generation Fähigkeiten für die Impfstoffentwicklung

The assessment of modern sub-unit vaccines reveals that the generation of neutralizing antibodies is important but not sufficient for adjuvant selection. ...

The Generation of Closed Femoral Fractures in Mice: A Model to Study Bone Healing

Bone fractures impose a tremendous socio-economic burden on patients, in addition to significantly affecting their quality of life. Therapeutic strategies that promote efficient bone healing are non-existent and in high demand. Effective and reproducible animal models of fractures healing are needed to understand the complex biological processes associated with bone regeneration. Many animal models of fracture healing have been generated over the years; however, murine fracture models have recently emerged as powerful tools to study bone healing. A variety of open and closed models have been developed, but the closed femoral fracture model stands out as a simple method for generating rapid and reproducible results in a physiologically relevant manner. The goal of this surgical protocol is to generate unilateral closed femoral fractures in mice and facilitate a post-fracture stabilization of the femur by inserting an intramedullary steel rod. Although devices such as a nail or a screw offer greater axial and rotational stability, the use of an intramedullary rod provides a sufficient stabilization for consistent healing outcomes without producing new defects in the bone tissue or damaging nearby soft tissue. Radiographic imaging is used to monitor the progression of callus formation, bony union, and subsequent remodeling of the bony callus. Bone healing outcomes are typically associated with the strength of the healed bone and measured with torsional testing. Still, understanding the early cellular and molecular events associated with fracture repair is critical in the study of bone tissue regeneration. The closed femoral fracture model in mice with intramedullary fixation serves as an attractive platform to study bone fracture healing and evaluate therapeutic strategies to accelerate healing.

The murine closed femoral fracture model is a powerful platform to study fracture healing and novel therapeutic strategies to accelerate bone regeneration. The goal of this surgical protocol is to generate unilateral closed femoral fractures in mice using an intramedullary steel rod to stabilize the femur.

Die Generation der geschlossenen femoralen Frakturen bei Mäusen: ein Modell zur Knochenheilung

Bone fractures impose a tremendous socio-economic burden on patients, in addition to significantly affecting their quality of life. Therapeutic strategies ...

High-Throughput Analysis of Optical Mapping Data Using ElectroMap

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we present, in a step-by-step guide, the use of ElectroMap for analysis, quantification, and mapping of high-resolution voltage and calcium datasets acquired by optical mapping. ElectroMap analysis options cover a wide variety of key electrophysiological parameters, and the graphical user interface allows straightforward modification of pre-processing and parameter definitions, making ElectroMap applicable to a wide range of experimental models. We show how built-in pacing frequency detection and signal segmentation allows high-throughput analysis of entire experimental recordings, acute responses, and single beat-to-beat variability. Additionally, ElectroMap incorporates automated multi-beat averaging to improve signal quality of noisy datasets, and here we demonstrate how this feature can help elucidate electrophysiological changes that might otherwise go undetected when using single beat analysis. Custom modules are included within the software for detailed investigation of conduction, single file analysis, and alternans, as demonstrated here. This software platform can be used to enable and accelerate the processing, analysis, and mapping of complex cardiac electrophysiology.

This protocol describes the setup and use of ElectroMap, a MATLAB-based open-source software platform for analysis of cardiac optical mapping data. ElectroMap provides a versatile high-throughput tool for analysis of optical mapping voltage and calcium datasets across a wide range of cardiac experimental models.

Hochdurchsatzanalyse optischer Mapping-Daten mit ElectroMap

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They mature in the bone marrow and are released into the peripheral blood, where they circulate for about 6&#8722;8 h; however, in tissue, they can survive for days. By diapedesis through the endothelium, they leave the blood stream, enter tissues, and migrate towards the site of an infection following chemotactic gradients.&#160;Neutrophils can combat invading microorganisms by phagocytosis,&#160;degranulation, and generation of neutrophil extracellular traps (NETs). This protocol will help to detect NETs in paraffin-embedded tissue. NETs are the result of a process called NETosis, which leads to the release of nuclear, granular, and cytoplasmic components either from living (vital NETosis) or dying (suicidal NETosis) neutrophils. In vitro, NETs form cloud-like structures, which occupy a space several times larger than that of the cells from which they descended. The backbone of NETs is chromatin, to which a selection of proteins and peptides originating from granules and cytoplasm are bound. Thereby, a high local concentration of toxic compounds is maintained so that NETs can capture and inactivate a variety of pathogens including bacteria, fungi, viruses, and parasites, while diffusion of the highly active NET components leading to damage in neighboring tissue is limited. Nevertheless, in recent years it has become apparent that NETs, if generated in abundance or cleared insufficiently, do have pathological potential ranging from autoimmune diseases to cancer. Thus, detection of NETs in tissue samples may have diagnostic significance, and the detection of NETs in diseased tissue can influence the treatment of patients. Since paraffin-embedded tissue samples are the standard specimen used for pathological analysis, it was sought to establish a protocol for fluorescent staining of NET components in paraffin-embedded tissue using commercially available antibodies.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are three-dimensional structures generated by stimulated neutrophil granulocytes. It has become clear in recent years that NETs are involved in a wide variety of diseases. Detection of NETs in tissue may have diagnostic relevance, so standardized protocols for labelling NET components are required.

Immunfluoreszenz-Kennzeichnung von humanen und murinen neutrophilen extrazellulären Fallen in Paraffin-Embedded Tissue

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...