Name: real-time imaging of ccl5-induced migration of periosteal skeletal stem cells in mice
Uploaded: 2020-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch den Bone Disease Program of Texas Award, den Caroline Wiess Law Fund Award und das NIAMS der National Institutes of Health unter den Award-Nummern R01 AR072018, R21 AG064345, R01 CA221946 bis D.P. unterstützt.  Wir danken M.E. Dickinson und T.J. Vadakkan im BCM Optical Imaging and Vital Microscopy Core und den BCM Advanced Technology Cores mit Mitteln von NIH (AI036211, CA125123 und DK056338).
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Alle Mäuse wurden unter pathogenfreien Bedingungen gehalten und alle Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Baylor College of Medicine genehmigt.
1. Mausvorbereitung
<ol><li>Kreuzen Sie Mx1-Cre17 und Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Tom)18 Mäuse (gekauft vom Jackson Laboratory) mit αSMA-GFP-Mäusen (hier von Dr. Ivo Kalajzic und Dr. Henry Kronenberg zur Verfügung gestellt), um Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) Reportermäuse zu erzeugen (Abbildung 2A).</li>
	<li>Für die Mx1-Cre-Induktion werden Mäuse 10 Tage lang jeden zweiten Tag mit 25 mg/kg pIpC injiziert.</li>
	<li>Bestrahlung von Mäusen mit 9,5 Gy 1 Tag vor der intravenösen Transplantation von 1 x 106 mononukleären Zellen des gesamten Knochenmarks von Wildtyp-C57BL/6-Mäusen (WT-BMT)19.</li>
	<li>Nach 6 bis 8 Wochen Genesung unterziehen mäuse der unten beschriebenen In-vivo-Bildgebung des periostalen Zellmigrationsprotokolls. HINWEIS: Bestrahlung und WT-BMT von Mx1-Cre-Mäusen sind notwendig, um endogen Mx1-markierte hämatopoetische Zellen zu eliminieren, die auf eine Verletzung reagieren können. Sechs bis acht Wochen nach der Bestrahlung liegt die hämatopoetische Zellzahl des Wirts bei <5% und damit bereit für die Bildgebung19.</li>
</ol>2. Mausfessel und Bildhalterung
<ol><li>Erstellen Sie eine Mausfessel mit einem konischen 50-ml-Rohr (Abbildung 1A).<ol>
<li>Stochern Sie mit einer spitzen Schere ein Loch durch den Boden des Koniks. Schneiden Sie vom unteren Loch bis zur Oberseite des konischen Lochs (die Schnittseite ist die Oberseite der Rückhaltevorrichtung).</li>
		<li>Machen Sie einen Schnitt von etwa 4-5 cm Länge parallel zum vorherigen Schnitt und auf halbem Weg nach unten (~ 2 cm) von der Oberseite der Rückhaltevorrichtung. Entfernen Sie diesen Abschnitt des konischen und glätten Sie die Kanten waren notwendig.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Konstruieren Sie eine konische Rohrbildhalterung mit einer verstellbaren Winkelplatte, einem optischen 0,5-Zoll-Pfosten und einer rechtwinkligen Klemme für den 0,5-Zoll-Pfosten, 0,1875-Zoll-Sechskant (Abbildung 1B und Tabelle der Materialien).<ol>
<li>Stellen Sie die Winkelplatte auf einen Winkel von 35° ein. Schrauben Sie auf der linken Seite der Winkelplatte den optischen Pfosten von der Rückseite der Platte in das zweite Loch.</li>
		<li>Führen Sie auf der rechten Seite der verstellbaren Platte eine federbelastete 0,1875" Sechskantverriegelung 0,25" Rändelschraube von vorne in das zweite Loch und die letzten Löcher auf der Platte ein. Die rechtwinklige Klemme wird mit dem optischen Pfosten verwendet, um die konische Maushalterung an Ort und Stelle zu befestigen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Präoperativer chirurgischer Eingriff
<ol><li>Mausanästhesie<ol>
<li>Zur Schmerzbehandlung subkutan wird der Maus 30–60 min vor der Operation Buprenorphin (1 mg/kg KG) mit verzögerter Freisetzung injiziert.</li>
		<li>Anästhesieren Sie Mäuse mit einer Nagetier-III-CCM-Kombinationsanästhesie (Combo III), die 37,5 mg / ml Ketamin, 1,9 mg / ml Xylazin und 0,37 mg / ml Acepromazin enthält. Die geeignete Dosierung für Mäuse beträgt 0,75–1,50 ml pro 1 kg Körpergewicht. Die Dosis dauert 30–45 Min.</li>
		<li>Sobald die Maus betäubt ist, tragen Sie mit einem sterilen Wattestäbchen eine Augensalbe auf die Augen auf, um eine Austrocknung der Augen zu verhindern.</li>
		<li>Für die Langzeitbildgebung (>45 min) erneut eine Anästhesie verabreichen, um die richtige Anästhesietiefe wie folgt aufrechtzuerhalten.<ol>
<li>Bereiten Sie eine 1-ml-Spritze mit einer ausreichenden Menge an Combo III vor, um die Anästhesie für die geplante Bildgebungsdauer aufrechtzuerhalten (0,75 ml/kg KG pro 30 Min zusätzlicher Sedierung). Befestigen Sie ein 25 G Schmetterlingsnadel-Infusionsset mit 12"-Schlauch an der Spritze und drücken Sie das Anästhetikum durch den Schlauch und die Nadel.</li>
			<li>Führen Sie die Schmetterlingsnadel intraperitoneal ein und kleben Sie die Nadel dann an Ort und Stelle. HINWEIS: Auf diese Weise wird die zusätzliche Combo III während der Bildgebung verabreicht, so dass das Tier nicht bewegt oder die Sichtebene gestört werden muss.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bieten Sie thermische Unterstützung mit einem Heizkissen, das während des gesamten Verfahrens bei 37 ° C gehalten wird. Bei längerer Bildgebung (>1 Stunde) ist eine zusätzliche Flüssigkeitsunterstützung erforderlich.  Zusätzliche Flüssigkeiten können I.P. mit zusätzlichem Combo III während der Bildgebung oder 33 ml/kg Kochsalzlösung (0,9 NaCl) subkutan bereitgestellt werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mausfesselung und Vorbereitung der Operationsstelle<ol>
<li>Verwenden Sie eine Haarschneidemaschine, um so viele Haare wie möglich von der Oberseite des Kopfes zu entfernen. Tragen Sie die Enthaarungscreme auf den rasierten Bereich auf, um verbleibende Haare an der Operationsstelle zu entfernen.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass die Maus durch mangelnde Reaktion auf Zehendrücken vollständig betäubt ist. Wenn die Maus nicht vollständig betäubt ist, verabreichen Sie nach 15 Minuten eine zweite kleinere Dosis von Combo III (<0,75 ml/kg KG).</li>
		<li>Legen Sie die Maus zuerst in die Rückhaltevorrichtung und schieben Sie sie weit genug nach hinten, so dass die Nase leicht über dem Rand des Konikums hängt.</li>
		<li>Kleben Sie die Vorderpfoten mit medizinischem Klebeband auf die Unterseite des konischen Rohrs.</li>
		<li>Legen Sie das konische Rohr mit der Maus auf eine Bildhalterung, die in einem Winkel von 35° eingestellt ist, und sichern Sie sie mit der rechtwinkligen Klemme (Abbildung 1C).</li>
		<li>Sobald die Maus in der bildgebenden Halterung sicher ist, reinigen Sie die Operationsstelle 3x mit abwechselnden Peelings aus Betadine-Peeling und 70% Isopropylalkohol. Überprüfen Sie erneut, ob das Tier vollständig sediert ist.</li>
		<li>Bewegen Sie die Maus zu einem sauberen saugfähigen Pad und legen Sie einen Vorhang über die Maus, um ein großes steriles Feld zu erzeugen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Chirurgischer Eingriff
<ol><li>Öffnungsschnitt<ol>
<li>Nehmen Sie die Haut mit einer feinen Pinzette sofort medial zum rechten Ohr auf. Schneiden Sie mit einer Mikrodissektionsschere die Haut ab, die von der Pinzette gehalten wird. HINWEIS: Die Einleitung der Inzision mit der oben beschriebenen Methode erzeugt einen abgerundeten Schnitt, der nach dem Eingriff besser zum Nähen geeignet ist.</li>
		<li>Machen Sie einen Querschnitt beginnend mit dem ersten Schnitt zum linken Ohr (<1 cm).  Machen Sie einen weiteren Schnitt, beginnend mit dem ersten Schnitt, in Richtung der Nase des Tieres (~ 2-3 mm hinter dem rechten Auge).</li>
		<li>Trennen Sie die Haut vom Periost mit der Pinzette und der Schere, um das Bindegewebe sanft zu durchschneiden und die Haut von Calvaria periost zu trennen.</li>
		<li>Tragen Sie mit einem sterilen Wattestäbchen etwas Augensalbe auf die Oberseite des Hautlappens auf.  Heben Sie den Hautlappen vorsichtig auf und falten Sie ihn über das linke Auge. Der Schnittpunkt der sagittalen und koronalen Nähte sollte deutlich freigelegt werden (Abbildung 1E). HINWEIS: Die Augensalbe wird verwendet, um den Hautlappen an Ort und Stelle zu halten.</li>
		<li>Spülen Sie die offene Oberfläche mit sterilem PBS, um den Bereich von Blut und Resthaaren zu reinigen. HINWEIS: Verwenden Sie bei Bedarf eine Pinzette mit feiner Spitze, um Haare zu entfernen, die nach dem Spülen verbleiben, aber achten Sie darauf, das Periost nicht zu beschädigen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mikrofrakturierung<ol>
<li>Um Mikrofrakturen an der Kalvarie zu erzeugen, entfernen Sie den Kolben einer 29 G Insulinspritze und schneiden Sie das hintere Ende der Spritze um die 300-400 μl Markierungen. HINWEIS: Dieser Schritt erleichtert das Manövrieren unter einem Sezierbereich, wenn die Verletzung verursacht wird.</li>
		<li>Platzieren Sie die Spitze einer Fase (ein bis zwei Nadelbreiten) von der koronalen Naht und ein bis zwei Nadelbreiten rechts von der sagittalen Naht in Richtung Nase (Abbildung 1E).</li>
		<li>Drehen Sie die Spritze vorsichtig im Uhrzeigersinn und dann mehrmals gegen den Uhrzeigersinn. HINWEIS: Bei jungen Mäusen ist eine sehr geringe Menge an Abwärtsdruck erforderlich, um eine kreisförmige Mikrofrakturierung zu erzeugen. Achten Sie darauf, die Nadel nicht in das Gehirn eindringen zu lassen, da dies zu Blutungen führt und die Bildgebung beeinträchtigt.</li>
		<li>Verwenden Sie eine 27 G Nadel, um die Mikrofrakturierung auf ~ 0,4 mm zu erweitern. Wenn Knochenfragmente in der Mikrofrakturierung verbleiben, spülen Sie den Bereich mit PBS. Wenn Knochenfragmente noch in der Mikrofrakturierung verbleiben, verwenden Sie die 29 G-Nadel, um sie vorsichtig herauszuschöpfen.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.2.1 bis 4.2.4, um eine Verletzung auf der linken Seite der sagittalen Naht zu verursachen. HINWEIS: An dieser Stelle gibt es zwei Möglichkeiten: 1) sofort mit der CCL5-Behandlung (Abschnitt 4.3) und der Bildgebung (Abschnitt 5) fortfahren; oder 2) die Operationsstelle nach den postoperativen Eingriffen in Abschnitt 6 zu schließen. Betäuben Sie die Maus 24 Stunden später erneut, öffnen Sie das chirurgische Visier erneut, behandeln Sie die Verletzung mit CCL5 (Abschnitt 4.3) und führen Sie intravitale Bildgebung (Abschnitt 5) und postoperative Versorgung (Abschnitt 6) durch.</li>
	</ol>
</li>
	<li>CCL5 Behandlung<ol>
<li>Stellen Sie aus einem Vorrat an RANTES (100 ng / ml) eine Lösung von 10 ng / ml unter Verwendung einer Kellermembranmatrix her (Materialtabelle). Halten Sie diese Lösung auf Eis, um die Matrix in flüssiger Form zu halten.</li>
		<li>Behandeln Sie jede Verletzung mit 2 μL CCL5 (10 ng / μL) mit einer 2-20 μL Pipette (diese Pipettenspitze hat einen größeren Durchmesser, was bei Verwendung einer viskosen Flüssigkeit effektiver ist). Lassen Sie die Matrix erstarren.</li>
		<li>Sobald die Matrix erstarrt ist, bedecken Sie die Kalvarie vorsichtig mit dem Hautlappen, um sicherzustellen, dass das Gewebe nicht dehydriert wird. Inkubieren Sie 1 Stunde vor der Bildgebung.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Intravitale Bildgebung
<ol><li>Mikroskop-Einstellungen<ol>
<li>Schalten Sie den Multiphotonenlaser (Femtosekunden-Titan-Saphir-Laser) ein. Stellen Sie die Wellenlänge auf 880 nm ein und passen Sie die Leistung für die Bildgebung des Knochens der zweiten harmonischen Generation (SHG) (440 nm) an.</li>
		<li>Schalten Sie die 488 nm und 561 nm Festkörperlaser zur Anregung von GFP- bzw. tdTomato-exprimierenden Zellen ein.</li>
		<li>Schalten Sie PMT-Detektoren (Photomultiplier tube) für Signale der zweiten harmonischen Generation (405–455 nm Detektion) und GFP (505–550 nm Detektion) ein. Schalten Sie den HyD 3-Detektor für das Tomatensignal (590–620 nm Erkennung) ein.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Montage<ol>
<li>Bevor Sie die Maus zum Zielfernrohr bewegen, überprüfen Sie die Visuelle Ebene der Calvaria, indem Sie vorsichtig den Hinterkopf der Maus drücken. Wenn die Ebene nicht eben ist, passen Sie die Position an, indem Sie die Mausstütze vorsichtig nach links oder rechts drehen. HINWEIS: Dies ist ein kritischer Schritt, um eine ausreichende Bildqualität zu gewährleisten.</li>
		<li>Sterile 2% Methylcellulose in Wasser (w/v) auftragen, um die gesamte Calvaria und den Hautlappen abzudecken und ein Austrocknen des Gewebes zu verhindern.</li>
		<li>Setzen Sie die Maus auf das motorisierte Mikroskoptisch der XYZ-Achse (Abbildung 1G). Richten Sie die Maus mit dem epifluoreszierenden Licht so aus, dass 1) sie dem Mikroskop zugewandt ist und 2) der Schnittpunkt der koronalen und sagittalen Nähte der zentrierte Bezugspunkt der Stufe ist.</li>
		<li>Legen Sie die Glasabdeckung auf den Bildbereich, und überprüfen Sie die Ausrichtung (Abbildung 1H).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zeitraffer-Bildgebung<ol>
<li>Verwenden Sie eine Linse mit geringer Vergrößerung (25-faches Wasserimmersionsobjektiv mit NA = 0,95), um die Kalvarie zu scannen. Erfassen Sie ein Referenzbild der sagittalen und koronalen Nahtkreuzung.</li>
		<li>Lokalisieren Sie mithilfe der SHG- und Fluoreszenzsignale der Zellen jeden Verletzungssichtpunkt und zeichnen Sie die XYZ-Koordinaten sowie die Entfernungen von den sagittalen und koronalen Nähten auf (Abbildung 2B).</li>
		<li>Wählen Sie eine Position auf den koronalen oder sagittalen Nähten für die Langzeitbildgebung. Nehmen Sie während der Bildgebung ein detailliertes Z-Stack-Bild dieses Bereichs aus der Referenz auf. HINWEIS: Da die Nähte eine bekannte P-SSC-Nische darstellen, werden die Zellen als Reaktion auf die Calvaria-Verletzung von hier aus wandern.</li>
		<li>Verwenden Sie die Einstellungen der Zeitraffer-Software, um mindestens 1 Stunde lang alle 1 Minute ein Bild aufzunehmen. Vergleichen Sie in der Zeit zwischen den Schnappschüssen das aktuelle Sichtfeld mit dem anfänglichen Sichtfeld. Wenn sie unterschiedlich sind, verwenden Sie das Z-Stack-Bild, um zu bestimmen, in welche Richtung das Sichtfeld angepasst werden muss.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Postoperative Tierpflege
<ol><li>Nach der Bildgebung spülen Sie die exponierte Calvaria mit sterilem PBS ab, um die Methylcellulose zu entfernen.</li>
	<li>Um den Schnitt zu schließen, legen Sie den Hautlappen vorsichtig über die Kalvarie. Verwenden Sie sterile Wattestäbchen, um Reste der Augensalbe zu entfernen und die Inzisionsstelle zu trocknen.</li>
	<li>Mit monofilen Nylon 5-0 größe nicht resorbierbaren Nähten mit einer angebrachten C-1 Reverse Cutting Nadel, schließen Sie die Operationsstelle. Verwenden Sie ein steriles Wattestäbchen, um eine dreifache antibiotische Salbe auf den geschlossenen Schnitt aufzutragen. HINWEIS: Narbenbildung wird durch hochwertige Nahttechniken und minimale Blutungen reduziert.</li>
	<li>Legen Sie die Maus in einen sauberen Käfig auf einer warmen Oberfläche und überprüfen Sie alle 15 Minuten, bis das Sternalreservieren erreicht ist.</li>
	<li>Verabreichen Sie eine zweite Dosis Buprenorphin mit verzögerter Freisetzung 72 h nach der Operation.</li>
	<li>Überwachen Sie täglich das Häuschungsverhalten, das gekräuselte Fell und / oder den Mangel an Gehfähigkeit, bis die Nähte entfernt werden (~ 1 Woche).</li>
</ol>

<ol>
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L.C.O. und D.P. legen ein angemeldetes Patent mit dem Titel "Periosteal Skeletal Stem Cells in Bone Repair" (BAYM. P0264US. P1). Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Während der Knochenheilung sind Periostzellen die Hauptquelle für neu differenzierte Chondrozyten und Osteoblasten innerhalb einer Verletzungskalus3. Ähnlich wie im Knochenmark wurden auch osteogene/chondrogene SSCs im Periost identifiziert4,5,6. Die Bewertung der endogenen P-SSC-Funktionsmerkmale ist technisch anspruchsvoll. Oft wird die Migrationsdynamik von SSCs in vitro bewertet, was die Interpreta...

Die Frakturreparatur ist ein dynamischer, mehrzelliger Prozess, der sich von der embryonalen Skelettentwicklung und dem Umbau unterscheidet. Während dieses Prozesses folgt auf die Induktion von Verletzungssignalen aus geschädigtem Gewebe die schnelle Rekrutierung, Proliferation und anschließende Differenzierung von Skelettstamm- / Vorläuferzellen, die alle für die Gesamtstabilität und Fixierung von Frakturen entscheidend sind1. Insbesondere erfordern frühe Stadien der Frakturheilung eine weiche Kallusbildung, die hauptsächlich auf periostale residente Zellen zurückgeführt wird2. Wenn Knochen verletzt werden, reagiert eine Untergruppe von Periostzellen schnell und trägt zu neu differenzierten Knorpelzwischenprodukten und Osteoblasten innerhalb des Kallus3 bei, was das Vorhandensein einer ausgeprägten Skelettstamm- / Vorläuferzellpopulation im Periost impliziert. Daher stellen die Identifizierung und funktionelle Charakterisierung der periostresidenten Skelettstammzellen (SSCs) einen vielversprechenden Therapieansatz für degenerative Knochenerkrankungen und Knochendefekte dar4.
Es wird angenommen, dass sich SSCs an mehreren Gewebestandorten befinden, einschließlich des Knochenmarks. Ähnlich wie im Knochenmark wurden auch osteogene/chondrogene SSCs im Periost identifiziert4,5,6.  Diese periostalen SSCs (P-SSCs) können während der fetalen Knochenentwicklung mit frühen mesenchymalen Lineage-Markern (d. h. Prx1-Cre5, Ctsk-Cre7 und Axin2-CreER8) markiert werden4,7,8,9,10. Eine wesentliche Einschränkung dieser Modelle zur Verfolgung einzelner genetischer Abstammungslinien besteht darin, dass innerhalb der markierten Zellpopulationen eine erhebliche Heterogenität besteht. Darüber hinaus können sie markierte SSCs in vivo nicht von ihren Nachkommen unterscheiden. Um diese Einschränkung zu beheben, haben wir kürzlich eine Dual-Reporter-Maus (Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+) entwickelt, um P-SSCs aus Knochenmark-SSCs (BM-SSCs)11 deutlich sichtbar zu machen. Mit diesem Modell wurde festgestellt, dass P-SSCs durch Mx1+αSMA+-Doppelmarkierung gekennzeichnet sind, während sich differenziertere Mx1+-Zellen im Knochenmark, in endostalen und periostalen Oberflächen sowie in kortikalen und trabekulären Knochen befinden11,12.
Es ist bekannt, dass mehrere Zytokine und Wachstumsfaktoren den Knochenumbau und die Knochenreparatur regulieren und wurden auf die Verbesserung der Skelettreparatur bei kritischen Segmentdefekten getestet1,13. Aufgrund der zellulären Komplexität von Verletzungsmodellen, die durch die Störung der physikalischen Barriere des Knochenkompartiments entstehen, sind die direkten Auswirkungen dieser Moleküle auf die endogene P-SSC-Migration und -Aktivierung während der Heilung jedoch unklar. Die funktionellen Eigenschaften und die Migrationsdynamik von SSCs werden häufig in vitro durch die Durchführung eines Transwell- oder Scratch-Assays in Kombination mit Zytokinen oder Wachstumsfaktoren bewertet, von denen bekannt ist, dass sie die Migration in anderen Zellpopulationen induzieren. Daher ist die Interpretation der Ergebnisse dieser In-vitro-Experimente für die Anwendung in den entsprechenden in vivo-Systemen eine Herausforderung. Derzeit wird die In-vivo-Bewertung der Skelettstamm-/Vorläuferzellmigration in der Regel nicht in Echtzeit beobachtet; Vielmehr wird es zu festen Zeitpunkten nach der Fraktur gemessen5,7,14,15,16.
Eine Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass die Migration nicht auf Einzelzellebene bewertet wird; Vielmehr wird es über Veränderungen der Zellpopulationen gemessen. Aufgrund der jüngsten Fortschritte in der intravitalen Mikroskopie lebender Tiere und der Erzeugung zusätzlicher Reportermäuse ist nun eine In-vivo-Verfolgung einzelner Zellen möglich. Unter Verwendung der intravitalen Mikroskopie von Lebendtieren beobachteten wir die deutliche Migration von P-SSCs aus der Calvaria-Nahtnnische zu einer Knochenverletzung innerhalb von 24-48 h nach der Verletzung bei Mx1/Tomato/αSMA-GFP-Mäusen.
CCL5/CCR5 wurde kürzlich als Regulierungsmechanismus identifiziert, der die Rekrutierung und Aktivierung von P-SSCs während des frühen Verletzungsreaktionsverhaltens beeinflusst. Interessanterweise wurde keine signifikante P-SSC-Migration als Reaktion auf eine Verletzung in Echtzeit festgestellt. Die Behandlung einer Verletzung mit CCL5 führt jedoch zu einer robusten, richtungsdifferierten Migration von P-SSCs, die in Echtzeit erfasst werden kann. Daher ist es das Ziel dieses Protokolls, eine detaillierte Methodik für die Aufzeichnung der In-vivo-Migration von P-SSCs in Echtzeit nach der Behandlung mit CCL5 bereitzustellen.

<table><tbody><tr><td>&amp;frac12;&amp;rdquo; optical post</td><td>ThorLabs</td><td>TR2</td><td>For imaging mount</td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>27G needle</td><td>BD PercisionGlide</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>29G insulin syringe</td><td>McKesson</td><td>102-SN05C905P</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conicol tube</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td>For mouse restraint</td></tr><tr><td>Adjustable angle plate</td><td>Renishaw</td><td>R-PCA-5023-50-20</td><td>For imaging mount</td></tr><tr><td>Alcohol wipes</td><td>Coviden</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>betadine surgical scrub</td><td>Henry Schen</td><td>67618-151-16</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine SR-LAB</td><td>ZooPharm</td><td></td><td>1mg/mL Sustained Release</td></tr><tr><td>Combo III</td><td>Obtained from staff veterinarian</td><td>N/A</td><td>37.6 mg/mL Ketamine; 1.9 mg/mL Xylazine; 0.37 mg/mL Acepronazine</td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Fisher</td><td>12-545-87</td><td>24 x 40 premium superslip</td></tr><tr><td>Fine tip forcepts</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>KetaVed</td><td>50989-161-06</td><td>100 mg/mL</td></tr><tr><td>Leica TCS SP8MP with DM6000CFS</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>344500101</td><td></td></tr><tr><td>Medical tape</td><td>McKesson</td><td>100199</td><td>3&quot; x 10 yds (7.6 cm x 9.1 m)</td></tr><tr><td>Methocellulose</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19560</td><td></td></tr><tr><td>Microdissection scissors</td><td>FST</td><td>1456-12</td><td></td></tr><tr><td>Motorized stage</td><td>Anaheim automation</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Needle holder</td><td>FST</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>Nonabsorbable sutures</td><td>McKesson</td><td>S913BX</td><td>monofilament nylon 5-0 nonabsorbable sutures with attached C-1 reverse cutting needle</td></tr><tr><td>Opthalmic ointment</td><td>Rugby</td><td>0536-1086-91</td><td></td></tr><tr><td>RANTES</td><td>Biolegend</td><td>594202</td><td>10 &amp;micro;g/50 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Right-angle clamp for &amp;frac12;&amp;rdquo; post, 3/16&amp;rdquo; Hex</td><td>ThorLabs</td><td>RA90</td><td>For imaging mount</td></tr><tr><td>Spring-loaded 3/16&amp;rdquo; Hex-locking &amp;frac14;&amp;rdquo; thumbscrew</td><td>ThorLabs</td><td>TS25H</td><td>For imaging mount</td></tr><tr><td>Sterile cotton swabs</td><td>Henry Schen</td><td>100-9249</td><td></td></tr><tr><td>Sterile DPBS (1x)</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sterile drapes</td><td>McKessen</td><td>25-517</td><td></td></tr><tr><td>Surgical gloves</td><td>McKessen</td><td>3158VA</td><td></td></tr><tr><td>Triple antibiotic ointment</td><td>Taro Pharmaceuticals U.s.a., Inc.</td><td>51672-2120-2</td><td></td></tr><tr><td>Vacutainer blood collection set</td><td>BD</td><td>REF 367298</td><td>25G butterfly needle infusion set with 12&quot; tubing</td></tr></tbody></table>

real-time imaging of ccl5-induced migration of periosteal skeletal stem cells in mice

Periostale Skelettstammzellen (P-SSCs) sind für die lebenslange Knochenerhaltung und -reparatur unerlässlich und damit ein idealer Schwerpunkt für die Entwicklung von Therapien zur Verbesserung der Frakturheilung.  Periostzellen wandern schnell zu einer Verletzung, um neue Chondrozyten und Osteoblasten für die Frakturheilung zu liefern. Traditionell wurde die Wirksamkeit eines Zytokins zur Induktion der Zellmigration nur in vitro durch die Durchführung eines Transwell- oder Scratch-Assays durchgeführt. Mit Fortschritten in der intravitalen Mikroskopie unter Verwendung der Multiphotonenerregung wurde kürzlich entdeckt, dass 1) P-SSCs das Migrationsgen CCR5 exprimieren und 2) die Behandlung mit dem CCR5-Liganden, der als CCL5 bekannt ist, die Frakturheilung und die Migration von P-SSCs als Reaktion auf CCL5 verbessert. Diese Ergebnisse wurden in Echtzeit erfasst. Hier beschrieben ist ein Protokoll zur Visualisierung der P-SSC-Migration aus der kalvarialen Naht-Skelettstammzell-Nische (SSC) zu einer Verletzung nach der Behandlung mit CCL5. Das Protokoll beschreibt die Konstruktion einer Mausfessel und einer bildgebenden Halterung, die chirurgische Vorbereitung der Mauskalvarie, die Induktion eines Calvaria-Defekts und die Erfassung der Zeitrafferbildgebung.

Es wurde vorgeschlagen, dass Skelettvorläufer ein Migrations- oder Kreislaufpotenzial haben20. Kürzlich wurden Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) Reportermäuse erzeugt, bei denen P-SSCs durch Mx1+α SMA+ Doppelmarkierung gekennzeichnet sind (Abbildung 2A,B). Innerhalb von 24–48 h nach der Verletzung fand eine...

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Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

Dieses Protokoll beschreibt den Nachweis der CCL5-vermittelten periostalen Skelettstammzellmigration in Echtzeit mittels lebender tierexperimenteller Mikroskopie.

Echtzeit-Bildgebung der CCL5-induzierten Migration von periostalen Skelettstammzellen in Mäusen

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of ...

real-time-imaging-ccl5-induced-migration-periosteal-skeletal-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

2.2K Aufrufe.  Baylor College of Medicine. Dieses Protokoll beschreibt den Nachweis der CCL5-vermittelten periostalen Skelettstammzellmigration in Echtzeit mittels lebender tierexperimenteller Mikroskopie.

Serie: Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

Bioengineering von humanisierten Knochenmark-Mikroumgebungen in der Maus und ihre Visualisierung durch Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Multimodale Bildgebung von Stem Cell Implantation in das zentrale Nervensystem der Mäuse

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Neurowissenschaften

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the efficacy of cell persistence and biodistribution of haMSCs in animal models. We demonstrated a method to label the cell membrane of haMSCs with lipophilic fluorescent dye. Subsequently, intra-articular injection of the labeled cells in rats with surgically induced KOA was monitored dynamically by an in vivo imaging system. We employed the lipophilic carbocyanines DiD (DilC18 (5)), a far-red fluorescent Dil (dialkylcarbocyanines) analog, which utilized a red laser to avoid excitation of the natural green autofluorescence from surrounding tissues. Furthermore, the red-shifted emission spectra of DiD allowed deep-tissue imaging in live animals and the labeling procedure caused no cytotoxic effects or functional damage to haMSCs. This approach has been shown to be an efficient tracking method for haMSCs in a rat KOA model. The application of this method could also be used to determine the optimal administration route and dosage of MSCs from other sources in pre-clinical studies.

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

This protocol describes an efficient way to monitor the cell persistence and biodistribution of human adipose-derived mesenchymal stem cells (haMSCs) by far-red fluorescence labeling in a rat knee osteoarthritis (KOA) model via intra-articular (IA) injection.

In Vivo Tracking der menschlichen Fettgewebe mesenchymalen Stammzellen in einem Rattenmodell Knie Arthrose mit fluoreszierenden lipophile Membran Farbstoff

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Sequentiell<em&gt; In-vivo-</em&gt; Imaging von osteogenen Stammzellen / Vorläuferzellen während Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Medizin

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

Tracking-Maus-Knochenmark-Monozyten<em&gt; In-vivo-</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Immunologie und Infektion

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

Femur Fensterkammer Modell für<em&gt; In Vivo</em&gt; Zelltracking im Knochenmark der Maus

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to nonmarrow tissue have not been completely clarified. We describe here the technique of intravital microscopy applied to the mouse cremaster microcirculation for analysis of peripheral bone marrow stem cell migration in vivo. Intravital microscopy of the M. cremaster has been previously introduced in the field of inflammatory research for direct observation of leucocyte interaction with the vascular endothelium. Since sufficient peripheral stem and progenitor cell migration includes similar initial steps of rolling along and firm adhesion at the endothelial lining it is conceivable to apply the M. cremaster model for the observation and quantification of the interaction of intravasculary administered stem cells with the endothelium. As various chemical components can be selectively applied to the target tissue by simple superfusion techniques, it is possible to establish essential microenvironmental preconditions, for initial stem cell recruitment to take place in a living organism outside the bone marrow.

Intravital microscopy of the mouse M. cremaster microcirculation offers a unique and well-standardized in vivo model for the analysis of peripheral bone marrow stem cell migration.

Intravitalmikroskopie der Mikrozirkulation in der Maus Cremaster-Muskel für die Analyse der peripheren Stammzell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Biologie

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine ​​mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after co-culture with cochlear epithelium. The organ of Corti was immobilized on a plastic coverslip by pressing a portion of the Reissner's membrane generated during the dissection. MSCs confined by a glass cylinder migrated toward cochlear epithelium when the cylinder was removed. Their predominant localization was observed in the modiolus of the organ of Corti, aligned in a direction similarly to that of the nerve fibers. However, some MSCs were localized in the limbus area and showed a horizontally elongated shape. In addition, migration into the hair cell area was increased, and the morphology of the MSCs changed to various forms after kanamycin treatment. In conclusion, the results of this study indicate that the coculture of MSCs with cochlear epithelium will be useful for the development of therapeutics via cell transplantation and for studies of cell regeneration that can examine various conditions and factors.

In this study, we present a real-time imaging method using confocal microscopy to observe cells moving toward damaged tissue by ex vivo incubation with the cochlear epithelium containing the organ of Corti.

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging zur Erforschung der Zellmigration zum Organ von Corti

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after ...

Echtzeit-Bildgebung der CCL5-induzierten Migration von periostalen Skelettstammzellen in Mäusen

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Bioengineering von humanisierten Knochenmark-Mikroumgebungen in der Maus und ihre Visualisierung durch Live Imaging

Multimodale Bildgebung von Stem Cell Implantation in das zentrale Nervensystem der Mäuse

In Vivo Tracking der menschlichen Fettgewebe mesenchymalen Stammzellen in einem Rattenmodell Knie Arthrose mit fluoreszierenden lipophile Membran Farbstoff

Sequentiell

Tracking-Maus-Knochenmark-Monozyten

Femur Fensterkammer Modell für

Intravitalmikroskopie der Mikrozirkulation in der Maus Cremaster-Muskel für die Analyse der peripheren Stammzell Migration

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging zur Erforschung der Zellmigration zum Organ von Corti

Echtzeit-Bildgebung der CCL5-induzierten Migration von periostalen Skelettstammzellen in Mäusen

Zusammenfassung

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Bioengineering von humanisierten Knochenmark-Mikroumgebungen in der Maus und ihre Visualisierung durch Live Imaging

Multimodale Bildgebung von Stem Cell Implantation in das zentrale Nervensystem der Mäuse

In Vivo Tracking der menschlichen Fettgewebe mesenchymalen Stammzellen in einem Rattenmodell Knie Arthrose mit fluoreszierenden lipophile Membran Farbstoff

Sequentiell

Tracking-Maus-Knochenmark-Monozyten

Femur Fensterkammer Modell für

Intravitalmikroskopie der Mikrozirkulation in der Maus Cremaster-Muskel für die Analyse der peripheren Stammzell Migration

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine ​​mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging zur Erforschung der Zellmigration zum Organ von Corti

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte