Ich danke den folgenden Personen für ihre Unterstützung bei der Entwicklung dieses Protokolls: Chuck Kristensen, Greta Binford, Alex K. Lancaster, Konrad Zinsmaier und Mays Imad. Massenspektrometrie und Proteomik-Daten wurden von der Arizona Proteomics-Konsortium durch NIEHS Zuschuss ES06694 zum SWEHSC, NIH / NCI Zuschuss CA023074 zum AZCC unterstützt und von der BIO5 Institut der Universität von Arizona erworben. Die Finanzierung für diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health (Nationales Institut für Allgemeinmedizin) aus Zuschüssen 1F32GM83661-01 und 1R15GM097714-01 Jessica E. Garb vorgesehen.

1. Herstellung von Elektro-Stimulator Vorrichtung <ol><li> Verbinden elektro Stimulator Netzkabel an eine Steckdose und befestigen externen Fußschalter zum externen Signaleingang. Hinweis: Elektrische Leitungen müssen gut isoliert und freiliegenden Metall liefert Strom sollte nicht berührt werden. Wear Latex oder Nitril Handschuhe zum Schutz. Electro-Stimulator Netzschalter sollte in der Position OFF beim Anbringen Netzkabel und Befestigungsdrähte sein. </li><li> Verbinden Sie die positive Elektrode auf rot Ausgangsklemme auf elektro-Stimulator (wenn Polaritätsschalter ist im normalen Modus) und verbinden Sie den negativen Elektrode mit der schwarzen Ausgangsklemme. Hinweis: Jeder Elektrodendraht sollte in einer Krokodilklemme zu beenden. </li><li> Stellen Stimulator mit den folgenden empfohlenen Voreinstellungen: Spannung = 7 V, Frequenz = 1 Impulse pro Sekunde, Delay = 0 Millisekunden Dauer = 200 Millisekunden wechseln Zwillingsimpulse = regelmäßige und Modus-Schalter = off. </li><li> Testausgang von Elektroden durch Anbringen Krokodilklemmen an voltmeter positive und negative Messleitungen. Schalten Sie Stimulator Netzschalter und liefern Strom mit Fußpedal. </li></ol> 2. Vorbereitung der Immobilisierung Pinzetten und anderen Stoffen <ol><li> Tauchen Sie ein Zinken der Federzange in flüssige Kunststoffbeschichtung und warten vier Stunden Beschichtung trocknen lassen. Dicht wickeln 15 mm von der Spitze des gegnerischen Zinke mit einer einzigen Schicht aus Baumwolle Nähgarn, und befestigen Faden durch das Binden Sie das Ende in einem Knoten. Hinweis: Das Gewinde wird verwendet, um eine Salzlösung aufgebracht, die elektrische Leitfähigkeit fördert absorbieren, während die Kunststoffbeschichtung eine Isolierung zu verzögern Strom. </li><li> Cut Spitze stumpfen Injektionsnadel mit einer scharfen Schere und glätten die Öffnung mit Sandpapier. Befestigen Sie die Nadel mit einer Vakuum Siphon (zB Vakuumfilter Kolben) über Schläuche. Hinweis: Die Nadel wird der Sog entfernt Wasser und erbrechen, und dienen dazu, die Schaltung, die durch die Stimulators Elektroden abzuschließen. Die Nadelöffnung must klein genug, um die Spinne nicht schaden können, aber groß genug, um Vakuumlösung ohne zu verstopfen (zB 25 G x 1 ½ im Gauge finden Materialliste). </li><li> Position im Federzange horizontal in einem dicht geschlossenen Position mit einer Vinylummantelung zweigleisigen Klemme an einen Magnetfuß oder festen Standgerät unter Sichtfeld einem Binokular gesichert, mit Kunststoff beschichtet Zinke Pinzette auf und fädeln beschichtet Stift auf der Unterseite. Hinweis: Die Zwei-Säulen-Klemme in einer stationären Position zu der magnetischen Basis durch einen Klemmhalter gehalten (siehe Materialliste). Ein Gummiband kann eng um Zinken der Federzange befestigt werden, neben dem Klammerhalter, um zusätzlichen Druck auf die Federzange in einer geschlossenen Position um die Spinne einmal eingeführt halten hinzuzufügen. </li><li> Bringen positive Elektrode Krokodilklemme an Pinzette &quot;Bottom Zinke vorgeGewinde und befestigen negativen Krokodilklemme an Metallvakuum Nadel stumpf. </li&gt; <li> Testschlussstrom mit Voltmeter, indem positive Leitung auf Pinzette Zinke zwischen Gewinde und Krokodilklemme und Platzierung Minusleitung auf stumpfe Vakuum Nadel. Drücken Sie Fußpedal, um eine ausreichende Strom erkannt wird, und entfernen Sie Leads, wenn genügend Strom erkannt wird. </li><li> Bereiten Sie mehrere Mikrokapillarröhrchen für Gift Kollektion. Halten Sie ein Einzel Mikrokapillarröhre an einem Ende mit einer behandschuhten Hand und am anderen Ende mit sterilem Metallzange, indem die Zange gehaltene Ende horizontal über einem Bunsenbrenner-Flamme. Ziehen Sie am mikrokapillaren mit den Metallzangen von der Flamme weg, um eine längliche Spitze zu schaffen, während das andere Ende in einer stationären Position halten. Hinweis: Schutzbrille tragen als Mikrokapillaren kann leicht brechen. </li><li> Ruhen bereit Mikrokapillaren auf einer Montage putty Streifens in einer Petrischale. Untersuchen mikrokapillaren endet unter einem Binokular und erstellen Sie eine kleine, abgeschrägte Öffnung am Ende zog mit sterilisierten Metallzangen. </li><li> Label variable Anzahl von sterilen 0,5-ml-Röhrchen. Hinzufügen sterile, entionisiertem Wasser auf Rohren steril (beispielsweise 5 &amp; mgr; l entionisiertem Wasser autoklaviert). Schließen Rohre und Ort Röhrchen auf Eis. </li><li> Bereiten Kochsalzlösung in einem Becherglas und füllen einen zweiten Becher mit autoklaviert Wasser. </li></ol> 3. Immobilisierung von Spider in Zange <ol><li> Schalten Sie CO 2 Tank und übertragen Spinne aus geschlossenen Kunststoffsammelfläschchen (siehe Materialliste) in CO 2 Kammer mit langen Metallzange. Hinweis: Schwarzen Witwen haben gefährliche Gift; immer Handschuhe tragen während dieser Protokoll. </li><li> Halten Spinne in Kammer für 5-10 min oder bis narkotisierten und bewegt sich nicht mehr, wenn sanft mit langen Zangen angestachelt. Verwenden Transferpipette Thread auf Pinzette mit Kochsalzlösung befeuchten. Hinweis: Richtlinien zur CO 2 Anästhesie Parameter für schwarze Witwen, siehe Spagna und Moore 19. </li><li> Abrufen betäubten Spinne von CO 2Kammer, indem man es durch seine Vorderbeine mit stumpfen Dissektionszangen und behandschuhten Händen. Bewegen Sie betäubt Spinne Pinzette Gerät Federgewicht. Separate Zinken geschlossenen Federzange und legen Sie das Spinnen cephalothorax in zwischen den Zinken und lassen die Zinken zu schließen gefahren, damit der Spinne zu gewährleisten ist fest an ihrem Platz gehalten, aber nicht erdrückt. Stellen Sie sicher, dass die Spinne gelegt Panzers Rücken Seite nach unten (siehe Foelix 20 für Führungsspinnenanatomie), am Gewinde beschichtet Stift ruht und Bauchseite des Panzers ist der Kunststoffbeschichtung gegenüber, während die positive Elektrode bleibt nach unten Zinke befestigt. Arbeiten Sie schnell beim Umgang mit Spinne. </li><li> Passen Binokular Vergrößerung, Fokus und Lichtquelle, bis das Spinnen Cheliceren und Reißzähne sind deutlich sichtbar. </li></ol> 4. Venom Sammlung <ol><li> Schalten Sie Vakuum und Spray Spinne Cheliceren mit Wasser-Lösung unter Verwendung eines zweiten stumpfer Spitze Spritze needle. Absaugen entfernt Wasser mit Vakuum Nadel um Verunreinigungen zu entfernen. </li><li> Berühren Sie die Nadel mit Vakuum angebracht negativen Elektrode zur Spinne Rostrum und liefern Puls mit Fußpedal ein- oder mehrmals. Vakuum entfernt erbrechen, wenn nötig. Hinweis: Spinne Rostrum ist im Mund hinter auf dorsalen Fläche zwischen Cheliceren und endites (siehe Foelix 20 für detaillierte Spinne Anatomie) Chelicerae. Hinweis: Bei jedem Impuls wird Beinen Vertrag der Spinne und Gift sichtbar klaren Tröpfchen, die aus Fängen sein. </li><li> Sammeln Gift Tropfen mit mikrokapillaren Spitze und Transfer Kapillarspitze in 0,5-ml-Röhrchen mit Wasser oder Pufferlösung (Lösung wird in die Kapillare gesaugt werden). Hinweis: Vermeiden Sie Stechen Spinne mit Kapillare, die Hämolymphe Kontamination und Tod führen kann. Vermeiden Sie auch Kontamination Kapillare mit Seide und Leim aus Spinndüsen. </li><li> Bringen Transferspritze mit Schlauchadapter an mikrokapillaren (am Ende gegenüber Sammelspitze) und dispense Giftlösung wieder in Rohr. Setzen Röhrchen auf Eis. Hinweis: Entsorgung Kapillaren in einem nahe gelegenen Behälter für scharfe Gegenstände. </li><li> Zeigen offenen Kunststoffsammelfläschchen, zusammen mit seiner Mütze, in der Nähe der Spinne. Fassen Sie vorsichtig die Spinnenbeine mit stumpfen Dissektionszangen in einer Hand gehalten und vorsichtig öffnen Federzange Zinken mit der anderen Hand, Schiebe Spinne in das Sammeln Fläschchen mit stumpfen Pinzette und schnell nahe Kappe. Fahren Sie mit nächsten Spinne und speichern Gift enthaltenden Röhrchen in -80 ° C Gefrierschrank, wenn Sie fertig. Hinweis: weiterhin Vorsicht walten lassen beim Bewegen der Spinne von der Pinzette wieder in das Fläschchen. Sicherstellen, dass die Sammelfläschchen mit Verschluss ist in der Nähe, um die Spinne für seine raschen Transfer und Handschuhe tragen. </li></ol> 5. Giftdrüse Dissections <ol><li> Zwei bis drei Tage nach der Giftsammlung, betäuben Spinne in CO 2 Kammer (siehe Schritt 3.1). Füllen flüssigem Stickstoff Träger und Platz neben Binokular. Hinweis: when Arbeiten mit flüssigem Stickstoff, Verwendung Augenschutz und Tieftemperatur Handschuhe. </li><li> Saubere Dissektion Bereich und Pinzette mit Lösung, RNase und DNA-Kontamination beseitigt. Füllen einer kleinen Petrischale unter Präpariermikroskop mit Sezieren Puffer (zB 1x mit Kochsalzlösung (SSC) Puffer) gegeben. </li><li> Transfer Spinne von CO 2 Kammer auf Petrischale und benutzen Pinzette schnell trennen die cephalothorax aus dem Bauch. </li><li> Halten Sie die cephalothorax unter dem Binokular mit einer Pinzette und positionieren Sie den Cheliceren in das Sichtfeld. Mit den scharfen Enden einer zweiten Pinzette zur Nagelhaut schneiden Beitritt des Panzers zu den seitlichen Aspekte der Cheliceren. Seitlich fassen die Cheliceren Verwendung der zweiten Pinzette, und sanft zerren und zurück, bis Giftdrüsen herausgezogen. </li><li> Separate Drüsen aus der Cheliceren (oder lassen befestigt Chelicerae falls gewünscht) zu einem cyrosafe 0,5-ml-Röhrchen und Transfer. Platz closed Röhre in flüssigem Stickstoff. Hinweis: Jeder Dissektion sollte nicht mehr als 15 Minuten dauern. </li><li> Wiederholen Dissektion mit zusätzlichen Spinnen bis beendet. Übertragungsrohre aus flüssigem Stickstoff in -80 ° C Gefrierschrank. </li></ol>

<ol>
	<li>Fry, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+toxicogenomic+multiverse:+convergent+recruitment+of+proteins+into+animal+venoms.">The toxicogenomic multiverse: convergent recruitment of proteins into animal venoms.</a> Annu. Rev. Genom. Hum. G. 10, 483-511 (2009).</li><li>Escoubas, P., Quinton, L., Nicholson, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venomics:+unravelling+the+complexity+of+animal+venoms+with+mass+spectrometry.">Venomics: unravelling the complexity of animal venoms with mass spectrometry.</a> J. Mass. Spectrom. 43 (3), 279-295 (2008).</li><li>Twede, V. D., Miljanich, G., Olivera, B. M., Bulaj, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+and+cardioprotective+conopeptides:+An+emerging+class+of+drug+leads.">Neuroprotective and cardioprotective conopeptides: An emerging class of drug leads.</a> Curr. Opin. Drug Disc. 12 (2), 231-239 (2009).</li><li>Casewell, N. R., W&#252;ster, W., Vonk, F. J., Harrison, R. A., Fry, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+cocktails:+the+evolutionary+novelty+of+venoms.">Complex cocktails: the evolutionary novelty of venoms.</a> Trends Ecol. Evol. 28 (4), 219-229 (2013).</li><li>Vetter, R. S., Isbister, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+aspects+of+spider+bites.">Medical aspects of spider bites.</a> Annu. Rev. Entomol. 53, 409-429 (2008).</li><li>Adams, M. E., Myers, R. A., Imperial, J. S., Olivera, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxityping+rat+brain+calcium+channels+with+omega-toxins+from+spider+and+cone+snail+venoms.">Toxityping rat brain calcium channels with omega-toxins from spider and cone snail venoms.</a> Biochemistry. 32 (47), 12566-12570 (1993).</li><li>Silva, J. -. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latrophilin+1+and+its+endogenous+ligand+Lasso/Teneurin-2+form+a+high-affinity+transsynaptic+receptor+pair+with+signaling+capabilities.">Latrophilin 1 and its endogenous ligand Lasso/Teneurin-2 form a high-affinity transsynaptic receptor pair with signaling capabilities.</a> PNAS. 108 (29), 12113-12118 (2011).</li><li>Williams, J. A., Day, M., Heavner, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ziconotide:+an+update+and+review.">Ziconotide: an update and review.</a> Expert Opin. Pharmacother. 9 (9), 1575-1583 (2008).</li><li>Veiseh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+paint:+a+chlorotoxin:Cy5.5+bioconjugate+for+intraoperative+visualization+of+cancer+foci.">Tumor paint: a chlorotoxin:Cy5.5 bioconjugate for intraoperative visualization of cancer foci.</a> Cancer Res. 67 (14), 6882-6888 (2007).</li><li>Binford, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evolution,+functional+variation,+and+proposed+nomenclature+of+the+gene+family+that+includes+sphingomyelinase+D+in+sicariid+spider+venoms.">Molecular evolution, functional variation, and proposed nomenclature of the gene family that includes sphingomyelinase D in sicariid spider venoms.</a> Mol. Biol. Evol. 26 (3), 547-566 (2009).</li><li>Garb, J. E., Hayashi, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evolution+of+&#945;-latrotoxin,+the+exceptionally+potent+vertebrate+neurotoxin+in+black+widow+spider+venom.">Molecular evolution of &#945;-latrotoxin, the exceptionally potent vertebrate neurotoxin in black widow spider venom.</a> Mol. Biol. Evol. 30 (5), 999-1014 (2013).</li><li>Platnick, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The World Spider Catalog., Version 14.0., DOI: 10.5531/db.iz.0001. , (2013).</li><li>Sollod, B. L., Wilson, D., Zhaxybayeva, O., Gogarten, J. P., Drinkwater, R., King, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Were+arachnids+the+first+to+use+combinatorial+peptide+libraries.">Were arachnids the first to use combinatorial peptide libraries.</a> Peptides. 26 (1), 131-139 (2005).</li><li>King, G. F., Hardy, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spider-venom+peptides:+Structure,+pharmacology,+and+potential+for+control+of+insect+pests.">Spider-venom peptides: Structure, pharmacology, and potential for control of insect pests.</a> Annu. Rev. Entomol. 58 (1), 475-496 (2013).</li><li>Escoubas, P., Sollod, B., King, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venom+landscapes:+Mining+the+complexity+of+spider+venoms+via+a+combined+cDNA+and+mass+spectrometric+approach.">Venom landscapes: Mining the complexity of spider venoms via a combined cDNA and mass spectrometric approach.</a> Toxicon. 47 (6), 650-663 (2006).</li><li>Kristensen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comments+on+the+natural+expression+and+artificial+extraction+of+venom+gland+components+from+spiders.">Comments on the natural expression and artificial extraction of venom gland components from spiders.</a> Toxin Rev. 24 (3-4), 257-270 (2005).</li><li>Ushkaryov, Y. A., Volynski, K. E., Ashton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multiple+actions+of+black+widow+spider+toxins+and+their+selective+use+in+neurosecretion+studies.">The multiple actions of black widow spider toxins and their selective use in neurosecretion studies.</a> Toxicon. 43 (5), 527-542 (2004).</li><li>Graudins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+activity+of+a+novel+&#945;-latrotoxin+from+red-back+spider+venom.">Cloning and activity of a novel &#945;-latrotoxin from red-back spider venom.</a> Biochem. Pharmacol. 83 (1), 170-183 (2012).</li><li>Spagna, J. C., Moore, A. M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safe+immobilization+by+CO2+of+Latrodectus+hesperus+(Arachnida:+Theridiidae).">Safe immobilization by CO2 of Latrodectus hesperus (Arachnida: Theridiidae).</a> Pan-Pac. Entomo. l. 74 (4), 210-213 (1998).</li><li>Foelix, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of Spiders. , (2010).</li><li>Haney, R. A., Ayoub, N. A., Clarke, T. H., Hayashi, C. Y., Garb, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+expansion+of+the+black+widow+toxin+arsenal+uncovered+by+multi-tissue+transcriptomics+and+venom+proteomics.">Dramatic expansion of the black widow toxin arsenal uncovered by multi-tissue transcriptomics and venom proteomics.</a> BMC Genomics. 15, 366 (2014).</li><li>Pescatori, M., Bradbury, A., Bouet, F., Gargano, N., Mastrogiacomo, A., Grasso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cloning+of+a+cDNA+encoding+a+protein+(latrodectin)+which+co-purifies+with+the+&#945;-latrotoxin+from+the+black+widow+spider+Latrodectus+tredecimguttatus+(Theridiidae).">The cloning of a cDNA encoding a protein (latrodectin) which co-purifies with the &#945;-latrotoxin from the black widow spider Latrodectus tredecimguttatus (Theridiidae).</a> Eur. J. Biochem. 230 (1), 322-328 (1995).</li><li>Grasso, A., Pescatori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+studies+of+latrodectin+from+the+venom+of+black+widow+spider+(Latrodectus+tredecimguttatus).">Structural and functional studies of latrodectin from the venom of black widow spider (Latrodectus tredecimguttatus).</a> Adv. Exp. Med. Biol. 391, 237-243 (1996).</li><li>Szeto, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+funnel-web+spider+polypeptide+with+homology+to+mamba+intestinal+toxin+1+and+the+embryonic+head+inducer+Dickkopf-1.">Isolation of a funnel-web spider polypeptide with homology to mamba intestinal toxin 1 and the embryonic head inducer Dickkopf-1.</a> Toxicon. 38, 429-442 (2000).</li><li>Binford, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+geographic+and+intersexual+chemical+variation+in+venoms+of+the+spider+Tegenaria+agrestis+(Agelenidae).">An analysis of geographic and intersexual chemical variation in venoms of the spider Tegenaria agrestis (Agelenidae).</a> Toxicon. 39, 955-968 (2001).</li><li>Alape-Gir&#243;n, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snake+venomics+of+the+lancehead+pitviper+Bothrops+asper:+geographic,+individual,+and+ontogenetic+variations.">Snake venomics of the lancehead pitviper Bothrops asper: geographic, individual, and ontogenetic variations.</a> J. Proteome. Res. 7 (8), 3556-3571 (2008).</li></ol>

Der Autor hat nichts zu offenbaren und keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Gifte sind eine wesentliche Quelle von physiologisch reaktiven Proteinen, Peptiden und anderen Molekülen mit Anwendungen für die Wirkstoffentwicklung, als auch für grundlegende Aspekte der zellulären und ökologische Forschung 3.1. Allerdings ist die Sammlung von Gift, vor allem aus gefährlichen oder kleine Tiere, ist eine anspruchsvolle Aufgabe. Dieses Protokoll zeigt, wie Gift und Giftdrüsen kann von Schwarzen Witwen gesammelt werden, und bestätigt den Erfolg dieses Ansatzes über eine Kombination aus mudPIT Analyse des Giftes und einem Protein-Datenbank von cDNAs abgeleitet vom Gift geklont Verschraubungen 21. Während dieses Protokoll funktioniert gut für schwarze Witwen und mittelgroße Spinnen, andere Gift Sammlung Techniken für größere mygalomorph (Tarantel-like) Spinnen, wie direkten Absaugen von Gift aus Fänge in Glaspipetten zB 24. Dieser letztere Ansatz verwendet worden, jedoch , wird nicht gut für kleinere Spinnen, die nicht aggressi werden arbeitenve. Ein besonders wichtiger Aspekt der hier beschriebenen Gift Sammelprotokoll ist die Anfangsphase der Herstellung und Optimierung des Sammelprozesses, so dass es mehr Routine, konsistente und schneller. Das Protokoll ist zunächst schwer zu meistern, jedoch mit wiederholten Versuchen, wird es einfacher und schneller. Vorsicht ist auch bei allen kritischen Phasen, die den Umgang mit gefährlichen Spinnen, die Verwendung von elektrischem Strom, feine Punktglasmikro Kapillaren und Spritzennadeln gedrängt. Es ist wichtig, geeignete persönliche Schutzausrüstung zu tragen wie Nitril-Handschuhe, einen Laborkittel, lange Hosen und geschlossene Schuhe sowie Brillen bei der Gestaltung Mikro Kapillaren. Eine weitere Herausforderung bei den Gift-Kollektion ist die geringe Menge des Giftes von einem Spinnen, insbesondere Latrodectus-Arten, von denen die Mengen gesammelt werden, können li sein produziertbestenfalls 1-2 Mikroliter pro Einzel grenzten. Erhalten ausreichender Gift für Downstream-Anwendungen, wie zB Protein-Gele oder funktionelle Assays kann die Kombination von Gift aus mehreren Individuen in einem Rohr erforderlich. In solchen Fällen sollte Gift nur von Personen gleichen Geschlechts, ontogenetische Stufe kombiniert werden, und die Bevölkerung angesichts der Anerkennung von intersexuellen, Entwicklungs- und geographische Variabilität in manchen Giften 25, 26. Spinnen kann auch aufweisen, eine beträchtliche Variation in der Menge an Gift unter Individuen, wobei geringere Mengen der letzten Entleerung der Drüse reflektieren hergestellt. So kann es ratsam sein Gift mehrere Tage nach ihrem letzten Fütterung sammeln. Wenn kleine Gift freigesetzt wird, sollte ein übermäßiger Strom nicht an die Spinne, die bewirken können, die Kutikula zu Bruch angelegt, was zur Verunreinigung des Giftes mit Hämolymphe oder Tod. Die Kontamination von Proben mit Spinnengift silk oder menschlichen Quellen auch durch die Verwendung von sterilen oder sauberen Ausrüstung vermieden werden. Trotz dieser Herausforderungen Sammlung von reinen Gift, so dass die Spinne lebt, ist vorzuziehen, Methoden, die Gift aus Drüsen Homogenate (die nicht trennen Giftkomponenten von anderen zellulären Proteinen) und töten die Spinne zu erhalten. Es ist auch wichtig, um sicherzustellen, dass die Proben schnell eingefroren, um Proteinabbau zu verhindern. Die Extraktion von Gift fördert spätere Giftproduktion, wodurch Gift Genexpression stimulierende im Giftdrüse. So, da dieses Protokoll ermöglicht Spinnen Gift Verarmungs überleben kann ihre Drüsen seziert werden einige Tage später (die Tötung der Spinne) an einem Punkt, wo Gift Genexpression wird erwartet, ausreichend für genetische Studien, wie Transkript Klonen 10,11 zu sein. Einige wichtige Vorsichtsmaßnahmen müssen auch Giftdrüse Dissektionen genommen werden. Der Schwerpunkt sollte auf mit Labor equipm platziert werdenent und Reagenzien, die frei von RNasen, die RNA abbauen. So wird empfohlen, Zangen und anderen nicht-Einweg-Geräte und Oberflächen mit Lösungen, die RNase und DNA-Kontamination zu beseitigen wischen. Die Sektionen sollte so schnell wie möglich direkt gefrorenen geführt werden, um weiter sicherzustellen, RNA Integrität des Gewebes. Schließlich sollte Dissektionen nur betäubt Spinnen durchgeführt werden, nachdem ihre cephalothorax und Bauch sind schnell getrennt. Abschließend dieser Artikel bietet eine überprüfte Protokoll zu Spinnengift und Giftdrüsen erhalten. Venom und Giftdrüsen ermöglichen die Isolierung und Charakterisierung ihrer Protein- und Peptid-Komponenten mit proteomischen und transkriptomischen Ansätze. Zusätzlich kann Gift Proben der Ausgangspunkt der funktionellen Assays, die die biomedizinische und pharmakologische Potenzial ihrer konstituierenden Moleküle bestimmen zu vertreten. Fast alle Spinnen produzieren Gift, und die breite Taucherversität Giftkomponenten von einzelnen Spezies synthetisiert schlägt eine große Vielfalt der Giftmoleküle noch nicht entdeckt zu 13 werden. Entsprechend stellt dieses Protokoll Werkzeuge, um die reiche Quelle von im Spinnengifte vorhanden biologisch aktive Moleküle zu untersuchen.

Gifte sind tierische Sekrete vorwiegend in ein anderes Tier für die Zwecke der Plünderung oder verteidigungs injiziert, und haben auch wichtige biologische Anwendungen mit biomedizinischer Relevanz 1-3. Nur bestimmte Tiere synthetisieren Gift, aber seine Produktion ist taxonomisch auf wirbellose Tiere (zB Nesseltiere, Kegelschnecken, Skorpione und Spinnen) und Wirbeltieren (zB Schlangen, einige Fische und Säugetiere) weit verbreitet, weil sie unabhängig voneinander entwickelt hat mehrfach 1,4 . Biochemische Charakterisierung Gifte Regel zeigen sie aus einer Vielzahl von Proteinen und Peptiden, die im Wesentlichen auf den Kreislauf und das Nervensystem von injizierten Tieren handeln schnell liefern Bestand Toxine 1 zusammengesetzt. Ein kleiner Bruchteil der giftigen Tieren eine Gefahr für den Menschen, vor allem Arten mit synanthrop Verteilungen 5 darstellen. Die Studie von Gift Zusammensetzung und funktionelle Aktivitäten eine wichtige Rolle spielenDie funktionelle Charakterisierung von Wirbel zellulären Komponenten (insbesondere neuronalen Ionenkanäle) 6 und bei der Aufklärung grundlegender zellulärer Prozesse (zB Neurosekretion) 7. Darüber hinaus wählen Sie Gift Peptide haben nützliche Eigenschaften in der biomedizinischen Kontexten, einschließlich ihrer Verwendung als Behandlungen für Krebs und Schmerzen 8,9 und sind für Arzneimittelkandidat Leads und Gegengift Entwicklung abgebaut. Venoms spielen eine herausragende Rolle in ökologischen und evolutionären Forschung 1,4,10,11, damit die Sammlung dieser gefährlichen Sekret hat viele Versorgungsunternehmen. Es gibt&gt; 40.000 beschriebenen Spinnenarten (Order Araneae), und alle, aber einer der mehr als 100 Spinnenfamilien besitzen gepaart Giftdrüsen, die Reißzähnen in der 12 zu beenden. Die hohe Artenvielfalt von Spinnen legt nahe, dass sie die größte Clade von giftigen Organismen darstellen. , Biochemische Charakterisierung von Spinnengifte hat jedoch largely auf einer kleinen Anzahl von Arten, die am häufigsten mit menschlichen envenomation zugeordnet engt. Aktuelle Proteom und Transkriptom-Studien von Spinnengiften zeigen sie enthalten typischerweise viele einzigartige Proteine ​​und Peptide 2,13,14. Fortschritte in der Hochdurchsatz-Sequenzierung und cDNA-Massenspektrometrie Peptidfingerprinting hat stark die Entdeckung dieser Giftproteine ​​15 erleichtert. Dennoch beginnt diese Arbeit mit der Sammlung von ausreichender Gift und / oder Giftdrüsen aus den Spinnen und detaillierte Dokumentation für solche Techniken sind einige 16. Dieser Beitrag stellt ein Protokoll für die Sammlung von Gift und Giftdrüsen von Schwarzen Witwen, die zu ähnlich großen Spinnen angewendet werden können. Die Sammlung von Gift getrennt von den Drüsen ermöglicht die Identifizierung von Proteinen, die in dem Gift abgesondert werden, im Gegensatz zu Proteinen, die Ausführung anderer zellulärer Funktionen. Schwarz Witwen und andere Latrodectus Arten werden weitgehend als einer der gefährlichsten Spinnen aufgrund ihrer hoch neurotoxische Gift, die starke Schmerzen beim Menschen verursacht, die manchmal durch starkes Schwitzen, Muskelkontraktionen, Bluthochdruck, Atembeschwerden und lücken Lähmung 5 begleitet wird anerkannt. Die hier vorgestellte Gift Sammlung Protokoll verwendet Elektrostimulation, um elektrischen Strom zu anästhesie Spinnen liefern an Muskelkontraktionen und die Freisetzung von Gift entlocken. Venom Tröpfchen schnell mit Mikro-Kapillaren gesammelt und in Rohre für Tiefkühllagerung verzichtet. Da das Protokoll beinhaltet gefährliche Verfahren, sollte es nur von gut ausgebildeten Personen durchgeführt werden und Vorsicht ist bei wichtigen Schritten gedrängt. Die gesammelten Gift hat zahlreiche Anwendungen, wie die Charakterisierung und Isolierung von konstituierenden Moleküle 2, für physiologische Experimente oder funktionellen Assays 18, und Gift Genexpression 11 stimulieren. Das Protokoll schließt mit einem description der Giftdrüse Präparation und Konservierung, die für die Klonierung von Gift-spezifischen Genen, deren Expression wurde gezeigt, dass 2-3 Tage nach venom Verarmungs in verschiedenen Spinnen 10,11 erfolgen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1090">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Nerve and muscle stimulator (electro-stimulator)&#160;</td>
			<td style="width:153px;">Grass Technologies</td>
			<td style="width:107px;">SD9</td>
			<td style="width:435px;">http://www.grasstechnologies.com/products/stimulators/stimsd9.html</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Voltmeter</td>
			<td style="width:153px;">RadioShack</td>
			<td>22-223</td>
			<td>any generic voltmeter/multimeter can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pointed Featherweight Forceps</td>
			<td style="width:153px;">Bioquip</td>
			<td>4748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasti Dip</td>
			<td style="width:153px;">Performix</td>
			<td></td>
			<td>Available at Ace Hardware</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">21 G X 1 1/2in Precision Glide hypodermic syringe needle</td>
			<td style="width:153px;">BD Medical&#160;</td>
			<td>305190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vacuum filter flask 1L</td>
			<td style="width:153px;">Nalgene</td>
			<td>DS4101-1000</td>
			<td>smaller flask sizes may also work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Buchner Two Piece funnel, 90 mm</td>
			<td style="width:153px;">Nalgene</td>
			<td style="width:107px;">4280-0900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 microlitter Capillary Bores (Micro capillaries)</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td>53508-375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting putty strip&#160;</td>
			<td style="width:153px;">Loctite</td>
			<td></td>
			<td>Available at Ace Hardware</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand* General-Purpose Extra-Long Forceps Length: 11-13/16 in.</td>
			<td style="width:153px;">Fisher</td>
			<td>10-316C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SSC Buffer, 20X (pH 7.0), Molecular Grade</td>
			<td style="width:153px;">Promega</td>
			<td>V4261</td>
			<td>can be made from stock chemicals (150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf safe-lock tubes 0.5 mL tubes (cryogenic safe)</td>
			<td style="width:153px;">Eppendorf</td>
			<td>22363611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nalgene Dewar, 1L, HDPE, Liquid nitrogen benchtop flask</td>
			<td style="width:153px;">Thermo Scientific</td>
			<td>4150-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rnase Away</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td>53225-514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra Fine Tweezers (dissecting forceps)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>78310-0</td>
			<td>similar high-quality fine point forceps can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Foot switch/pedal</td>
			<td style="width:153px;">Linemaster Switch Corp.</td>
			<td style="width:107px;">491-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:395px;">Two-pronged extension clamp, with vinyl covered sleeves, 8.5 inches</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td style="width:107px;">21570-007</td>
			<td>similar models could be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Clamp Holder</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td style="width:107px;">89084-746</td>
			<td>similar models could be substituted, must accommodate diameter of extension clamp rod</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Magnetic base (holds extension clamp via clamp holder)</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td style="width:107px;">300042-270</td>
			<td>similar apparatus able to securely hold extension clamp in fixed position may be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Plastic Collecting Vials (large/40 dram)</td>
			<td style="width:153px;">Bioquip</td>
			<td style="width:107px;">8940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Cotton sewing thread</td>
			<td style="width:153px;">Threadart.com</td>
			<td style="width:107px;">&#160;THRCOT9</td>
			<td>similar product could be substituted</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of venom and venom gland microdissections from spiders for proteomic and transcriptomic analyses

Gifte sind chemisch komplexe Sekrete typischerweise aus zahlreichen Proteinen und Peptiden mit unterschiedlichen physiologischen Aktivitäten. Funktionelle Charakterisierung Gift Proteine ​​hat wichtige biomedizinische Anwendungen, einschließlich der Identifizierung von Leitstrukturen oder Sonden für zelluläre Rezeptoren. Spinnen sind die meisten Arten reichen Clade von giftigen Organismen, aber die Gifte von nur wenigen Arten gut verstanden, teilweise aufgrund der Schwierigkeit, mit dem Sammeln von winzigen Mengen Gift von kleinen Tieren verbunden. Dieser Beitrag stellt ein Protokoll für die Sammlung von Gift von Spinnen mit Elektrostimulation, was die Prozedur auf dem westlichen Schwarzen Witwe (Latrodectus hesperus). Die gesammelte Gift ist nützlich für abwechslungsreiche Downstream-Analysen einschließlich direkter Proteinidentifizierung mittels Massenspektrometrie, funktionelle Assays und Stimulation von Gift Genexpression für transkriptomischen Studien. Diese Technik hat den Vorteil gegenüber Protokolle, isoSpätgift aus ganzen Drüse Homogenate, die nicht trennen echten Giftkomponenten von zellulären Proteinen, die nicht als Teil des Giftes sezerniert werden. Repräsentative Ergebnisse zeigen die Detektion von bekannten Gift-Peptiden aus der gesammelten Probe mittels Massenspektrometrie. Das Gift Sammelprozedur wird durch ein Protokoll zum Präparieren Spinnengiftdrüsen, wobei die Ergebnisse zeigen, dass dies zur Charakterisierung Gift-exprimierte Proteine ​​und Peptide auf Sequenzebene folgt.

Die Sammlung von Gift und Giftdrüse Dissektionen werden häufig durchgeführt, um Gift Proteine ​​und Peptide auf Sequenzebene 10,11,15 charakterisieren. Erhaltene Gift kann auch in physiologischen Assays verwendet, um die funktionellen Aktivitäten 18 zu bestimmen. Die Sammlung von Gift wird Giftdrüse Genexpression stimulieren, wodurch die Klonierung von spezifischen Toxin Transkripte über RT-PCR 10,11 Erleichterung. Identifizierung von Giftproteine ​​können auch in einem Hochdurchsatz-Art und Weise durch Integration von Standard Massenspektrometrie mit Sequenzdatenbanken von Giftdrüse cDNA-Bibliotheken erzeugt 15,21 erreicht werden. Ein Beispiel für eine solche Arbeit, ausgehend von Gift und Drüsen gesammelt unter Verwendung des Protokolls oben beschrieben, zeigt seine Wirksamkeit, wird in Abbildung 1 veranschaulicht. Gift von L. gesammelten hesperus erwachsenen Weibchen wurde mit Trypsin verdaut und an ein in Lösung unterzogenMudPIT Analyse, die HPLC (High Performance Liquid Chromatography), um Tandem-Massenspektrometrie (MS / MS) verbindet. Hier wurde die mudPIT Analyse durch die Universität von Arizona Proteomics-Konsortium durchgeführt. Massen erkannt Peptide und ihre distanzierte Fragmente (Tochterionen, abgeleitete von Spektren) wurden Peptidsequenzen theoretisch aus Übersetzungen von cDNA-Sequenzen aus einem Gen-Expressionsbibliothek aus L. konstruiert erhalten prognostiziert im Vergleich hesperus Giftdrüsen (Drüsen wurden von der Dissektion Protokoll erworben oben beschrieben) 21. In diesem Experiment wurden 36 Proteine ​​aus allen gesammelten Spektren detektiert, an der Wahrscheinlichkeitsschwelle von 99,9% und enthielt wenigstens einen detektierten Peptids. Eine der nachgewiesenen Proteine ​​von 43 insgesamt Spektren (in 1A gezeigten beispielhafte Spektren) unterstützt wird, die den drei exklusive Peptiden, dabei 35% der Proteinsequenz (Abbildung 1B). Die nachgewiesene Protein (übersetzt aus einer collecte<html> d cDNA) eine obere BLASTp Hit von L. latrodectin tredecimguttatus (GenBank Accession P49125.1), mit einem E-Score von 2e-46, und teilt 80% Identität auf Aminosäureebene mit der Sequenz, die in diesem Experiment nachgewiesen Protein. Latrodectin, die auch als alpha-Latrotoxin niedermolekularen Proteins bekannt, ist ein anerkannter Gift Bestandteil Schwarzen Witwen 22, 23, die Überprüfung der Wirksamkeit der vorgestellten Protokoll. Einige Proteine, die aus dem Gift identifizierten Sequenzen entsprechen, für die keine BLAST Treffer gefunden wird. Es ist unklar, ob ein solches Ergebnis ist aufgrund der begrenzten Ressourcen für die genomische Spinnen zur Verfügung sowie die begrenzte Funktionsinformationen für die Proteine, oder weil das unbekannte Protein stellt einen Giftverunreinigung. Dennoch Gens oder der Proteinexpression analysiert Untersuchung der Abundanz eines solchen neuartigen Proteins in Giftdrüsen relativ zu anderen Geweben sollten zeigen, ob es eine echte Gift-Komponente ist. ent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51618/51618fig1highres.jpg" width="600" /> Abbildung 1: Latrodectin Peptid aus der schwarzen Witwe Gift mittels Massenspektrometrie identifiziert (A) Repräsentative Spektren (einer von 43) über MS / MS Teil mudPIT Analyse der L. erkannt. hesperus venom die vorhergesagte Translation eines teil B. Spectra gezeigt gesammelten cDNA-Sequenz zugeordnet wurde zeigt Massenverhältnis (m / z) der detektierten Sekundärionen auf das durch Fragmentieren Stammpeptid (CGEEDFGEEIVK) erzeugten Horizontalachse berechnen, mit Buchstaben oben Angabe der Peptidsequenz basierend auf Tochterionen Massen. (B) Proteinsequenz, auf die Spektren in Teil A zugewiesen wurde, zeigt in rot, fett und unterstrichen Text der entsprechenden Sequenz aus dem in Teil A gezeigten Spektren, zusätzliche rote Text (nicht fett) stellt mit anderen gesammelten sp anderes Peptid in diesem Protein nachgewiesenectra. Die Proteinsequenz wird aus einer cDNA-Sequenz aus sezierten Giftdrüsen erhalten rechnet.

Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses at JoVE.com

Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses

Dieser Artikel enthält ein Protokoll für die Extraktion von Gift von Spinnen mit Elektrostimulation, um 1) durchzuführen Proteom Charakterisierung, 2) stimulieren Giftdrüse Genexpression, und 3) durchführen funktionelle Studien von Giften. Dies wird durch eine Beschreibung der Giftdrüse Mikrodissektionen für Genexpressionsstudien gefolgt.

Extraktion von Venom und Giftdrüse Mikrodissektionen von Spiders für Proteomik und transkriptomischen Analysen

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional ...

extraction-venom-venom-gland-microdissections-from-spiders-for

Research

JoVE Journal

Biology

33.3K Aufrufe.  University of Massachusetts Lowell.  Dieser Artikel enthält ein Protokoll für die Extraktion von Gift von Spinnen mit Elektrostimulation, um 1) durchzuführen Proteom Charakterisierung, 2) stimulieren Giftdrüse Genexpression, und 3) durchführen funktionelle Studien von Giften. Dies wird durch eine Beschreibung der Giftdrüse Mikrodissektionen für Genexpressionsstudien gefolgt. 

Serie: Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

Elektrophoretische Trennung von Proteinen

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Forschung

Biologie

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and prognosis of disease. While clinical proteomic methods vary widely, a common characteristic is the need for (i) extraction of proteins from extremely heterogeneous fluids (i.e. serum, whole blood, etc.) and (ii) extensive biochemical processing prior to analysis. Here, we report a new digital microfluidics (DMF) based method integrating several processing steps used in clinical proteomics. This includes protein extraction, resolubilization, reduction, alkylation and enzymatic digestion. Digital microfluidics is a microscale fluid-handling technique in which nanoliter-microliter sized droplets are manipulated on an open surface. Droplets are positioned on top of an array of electrodes that are coated by a dielectric layer - when an electrical potential is applied to the droplet, charges accumulate on either side of the dielectric. The charges serve as electrostatic handles that can be used to control droplet position, and by biasing a sequence of electrodes in series, droplets can be made to dispense, move, merge, mix, and split on the surface. Therefore, DMF is a natural fit for carrying rapid, sequential, multistep, miniaturized automated biochemical assays. This represents a significant advance over conventional methods (relying on manual pipetting or robots), and has the potential to be a useful new tool in clinical proteomics.
Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk, and Steve C. C. Shih contributed equally to this work.
Sergio L. S. Freire's current address is at the University of the Sciences in Philadelphia located at 600 South 43rd Street, Philadelphia, PA 19104.

Digital Microfluidics is a technique characterized by the manipulation of discrete droplets (~nL - mL) on an array of electrodes by the application of electrical fields. It is well-suited for carrying out rapid, sequential, miniaturized automated biochemical assays. Here, we report a platform capable of automating several proteomic processing steps.

Digitale Mikrofluidik für die automatisierte Verarbeitung Proteomic

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, moniliformin, etc... have adverse effects on both human and animal health and some are considered as pathogenicity factors. Proteomic studies showed to be effective for deciphering toxin production mechanisms (Taylor et al., 2008) as well as for identifying potential pathogenic factors (Paper et al., 2007, Houterman et al., 2007) in Fusaria. It becomes therefore fundamental to establish reliable methods for comparing between proteomic studies in order to rely on true differences found in protein expression among experiments, strains and laboratories. The procedure that will be described should contribute to an increased level of standardization of proteomic procedures by two ways. The filmed protocol is used to increase the level of details that can be described precisely. Moreover, the availability of standardized procedures to process biological replicates should guarantee a higher robustness of data, taking into account also the human factor within the technical reproducibility of the extraction procedure.
The protocol described requires 16 days for its completion: fourteen days for cultures and two days for protein extraction (figure 1). 
Briefly, Fusarium strains are grown on solid media for 4 days; they are then manually fragmented and transferred into a modified toxin inducing media (Jiao et al., 2008) for 10 days. Mycelium is collected by filtration through a Miracloth layer. Grinding is performed in a cold chamber. Different operators performed extraction replicates (n=3) in order to take into account the bias due to technical variations (figure 2). Extraction was based on a SDS/DTT buffer as described in Taylor et al. (2008) with slight modifications. Total protein extraction required a precipitation process of the proteins using Aceton/TCA/DTT buffer overnight and Acetone /DTT washing (figure 3a,3b). Proteins were finally resolubilized in the protein-labelling buffer and quantified. Results of the extraction were visualized on a 1D gel (Figure 4, SDS-PAGE), before proceeding to 2D gels (IEF/SDS-PAGE). The same procedure can be applied for proteomic analyses on other growing media and other filamentous fungi (Miles et al., 2007).

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Protein extraction for proteomic analyses in fungal species requires high levels of standardization to be accomplished according with the minimum information about a proteomic experiment (MIAPE) guidelines. We present a video-protocol that includes a procedure for minimizing experimental bias during toxin induction and protein extraction from Fusarium spp.

Toxin Induktions-und Protein-Extraktion aus Fusarium Spp. Kulturen für Proteom-Studien

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

DNA-Extraktion aus in Paraffin eingebettete Material für genetische und epigenetische Analysen

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is a highly aqueous extracellular matrix overlying the retina where intraocular as well as extraocular proteins accumulate during disease.1-3 Abnormal interactions between vitreous and retina underlie several diseases such as retinal detachment, proliferative diabetic retinopathy, uveitis, and proliferative vitreoretinopathy.1,4 The relative mouse vitreous volume is significantly smaller than the human vitreous (Figure 1), since the mouse lens occupies nearly 75% of its eye.5 This has made biochemical studies of mouse vitreous challenging. In this video article, we present a technique to dissect and isolate the mouse vitreous from the retina, which will allow use of transgenic mouse models to more clearly define the role of this extracellular matrix in the development of vitreoretinal diseases.

The dissection technique illustrates evisceration of the vitreous, retina, and lens from the mouse eye, separation by centrifugation, and characterization with protein assays.

Ausweiden der Maus Glaskörper und Netzhaut für Proteomik-Analysen

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. The large airways therefore require an efficient repair mechanism to protect our bodies. This repair process occurs from stem cells in the airways and isolating these stem cells from the airways is important for understanding the mechanisms of repair and regeneration. It is also important for understanding abnormal repair that can lead to airway diseases 2. The goal of this method is to isolate a novel stem cell population from the mouse tracheal submucosal gland ducts and to place these cells in in vitro and in vivo model systems to identify the mechanisms of repair and regeneration of the submucosal glands 3. This production shows methods that can be used to isolate and assay the duct and basal stem cells from the large airways 3.This will allow us to study diseases of the airway, such as cystic fibrosis, asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Currently, there are no methods for isolation of submucosal gland duct cells and there are no in vivo models to study the regeneration of submucosal glands.

Here we demonstrate our protocol for isolation of basal and submucosal gland duct cells from mouse tracheas. We also demonstrate the method of injecting stem cells into the dorsal mouse fat pad to create an in vivo model of submucosal gland regeneration.

Isolierung von Basalzellen und Submuköse Gland Duct Zellen aus Maus Trachea

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale quantitative analysis of formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) tissue. The procedure comprises four distinct steps. The first one is the preparation of sections from the FFPE material and microdissection of cells of interest. In the second step the isolated cells are lysed and processed using 'filter aided sample preparation' (FASP) technique. In this step, proteins are depleted from reagents used for the sample lysis and are digested in two-steps using endoproteinase LysC and trypsin. 
After each digestion, the peptides are collected in separate fractions and their content is determined using a highly sensitive fluorescence measurement. Finally, the peptides are fractionated on 'pipette-tip' microcolumns. The LysC-peptides are separated into 4 fractions whereas the tryptic peptides are separated into 2 fractions. In this way prepared samples allow analysis of proteomes from minute amounts of material to a depth of 10,000 proteins. Thus, the described workflow is a powerful technique for studying diseases in a system-wide-fashion as well as for identification of potential biomarkers and drug targets.

Archival formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) clinical samples are valuable material for investigation of diseases. Here we demonstrate a sample preparation workflow allowing in-depth proteomic analysis of microdissected FFPE tissue.

Proteomik Probenvorbereitung von Formalin fixiert und in Paraffin eingebetteten Gewebe

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and validated a method for CORT extraction and analysis from rhesus monkey hair and subsequently adapted this method for use with human scalp hair. In contrast to CORT &#34;point samples&#34; obtained from plasma or saliva, hair CORT provides an integrated measure of hypothalamic-pituitary-adrenocortical (HPA) system activity, and thus physiological stress, during the period of hormone incorporation. Because human scalp hair grows at an average rate of 1 cm/month, CORT levels obtained from hair segments several cm in length can potentially serve as a biomarker of stress experienced over a number of months.
In our method, each hair sample is first washed twice in isopropanol to remove any CORT from the outside of the hair shaft that has been deposited from sweat or sebum. After drying, the sample is ground to a fine powder to break up the hair&#39;s protein matrix and increase the surface area for extraction. CORT from the interior of the hair shaft is extracted into methanol, the methanol is evaporated, and the extract is reconstituted in assay buffer. Extracted CORT, along with standards and quality controls, is then analyzed by means of a sensitive and specific commercially available enzyme immunoassay (EIA) kit. Readout from the EIA is converted to pg CORT per mg powdered hair weight. This method has been used in our laboratory to analyze hair CORT in humans, several species of macaque monkeys, marmosets, dogs, and polar bears. Many studies both from our lab and from other research groups have demonstrated the broad applicability of hair CORT for assessing chronic stress exposure in natural as well as laboratory settings.

Cortisol (CORT) accumulates in the growing hair shaft of humans and nonhuman primates. We describe methods for extracting and analyzing hair CORT with high precision and sensitivity. Measurement of hair CORT is particularly well-suited for assessing chronic stress over periods of weeks to months.

Extraktion und Analyse von Cortisol aus Menschen-und Affen-Haar

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

Hochdurchsatz-Screening Quantitative Expression und Aufreinigung rekombinanter zu Disulfid-reichen Proteine ​​Venom Produziert in Applied<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Bacterial symbionts form an intimate relationship with their hosts and confer advantages to the hosts in most cases. Genomic information is critical to study the functions and evolution of bacterial symbionts in their host. As most symbionts cannot be cultured in vitro, methods to isolate an adequate quantity of bacteria for genome sequencing are very important. In the whitefly Bemisia tabaci, a number of endosymbionts have been identified and are predicted to be of importance in the development and reproduction of the pests through multiple approaches. However, the mechanism underpinning the associations remains largely unknown. The obstacle partially comes from the fact that the endosymbionts in whitefly, mostly restrained in bacteriocytes, are hard to separate from the host cells. Here we report a step-by-step protocol for the identification, extraction and purification of endosymbionts from the whitefly B. tabaci mainly by dissection and filtration. Endosymbiont samples prepared by this method, although still a mixture of different endosymbiont species, are suitable for subsequent genome sequencing and analysis of the possible roles of endosymbionts in B. tabaci. This method may also be used to isolate endosymbionts from other insects.

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Here, we present a protocol to isolate endosymbionts from the whitefly Bemisia tabaci through dissection and filtration. After amplification, the DNA samples are suitable for subsequent sequencing and study of the mutualism between endosymbionts and whitefly.

Methoden zur Extraktion von Endosymbionten aus der Whitefly<em&gt; Bemisia tabaci</em

Bacterial symbionts form an intimate relationship with their hosts and confer advantages to the hosts in most cases. Genomic information is critical to ...