Wir danken dem Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) und der Canadian Cancer Society für finanzielle Unterstützung. SCCS dank NSERC und VNL dank der Ontario Graduate Scholarship (OGS) für Diplom-Stipendien. ARW dank der CRC für einen Canada Research Chair.

Teil 1: Geräte-Fertigung <ol><li> Saubere Glas-Substraten in Piranha-Lösung (3:1 conc Schwefelsäure:. 30% iges Wasserstoffperoxid). Verlassen Sie die Substrate in Piranha-Lösung für 10 min mit häufigem Rühren. </li><li> Nach dem Spülen in deionisiertem Wasser (DI) und Trocknen der Substrate mit N 2-Gas, statt der Substrate innerhalb des Elektronenstrahls Kammer für Chrom-Abscheidung (Dicke von 250 nm). </li><li> Zur Dehydratisierung der Chrom-beschichteten Substrat, in Isopropanol spülen und dann backen auf einer heißen Platte für 5 min bei 115 ° C. </li><li> Trocknen Sie die Substrate und prime mit Hexamethyldisilazan (HMDS) durch Spin-Coating (30 s, 3000 rpm). Spin-Mantel wieder (mit identischen Parametern) mit Shipley S1811 Fotolack. </li><li> Pre-Bake das Substrat auf einer Heizplatte (100 ° C, 2 min), dann Muster der Fotolack durch Bestrahlung mit ultraviolettem (UV) Bestrahlung für 5 s durch eine Photomaske. </li><li> Entwickeln Sie die UV-exponierten Substraten in Shipley MF 321 Entwickler für 3 min waschen in VE-Wasser. Post-Bake auf einer Heizplatte bei 100 ° C für 1 min. </li><li> Etch die exponierte Chrom durch Eintauchen in Chrom Ätzmittel für 30 s. Spülen in DI-Wasser, dann tauchen in AZ300T Stripperin für 10 min auf die verbleibenden Fotolack entfernen. Spülen in DI Wasser abspülen und mit N 2-Gas. </li><li> Kaution 2-5 um Parylene-C (ein isolierendes Polymer) durch chemische Gasphasenabscheidung auf ein Substrat mit gemusterten Chrom. Kaution 50 nm von Teflon-AF (an die Oberfläche hydrophob zu machen) durch Spin-Coating eine Lösung (1% wt / wt in Fluorinert FC-40) bei 2000 rpm für 60 s. Post-Bake auf einer Heizplatte (160 ° C, 10 min). </li><li> Zur Bildung der oberen Platte, Mantel ein un-gemusterten Indium-Zinn-Oxid (ITO) Glassubstrate 50 nm Teflon-AF, wie oben beschrieben. </li><li> Post-backen beide Substrate auf einer Heizplatte (160 ° C, 10 min). </li></ol> Teil 2: Geräte-Set-up und Automation <ol><li> In der digitalen Mikrofluidik-Geräte in &quot;Zwei-Teller&quot;-Konfiguration betrieben werden 1 Tropfen zwischen einem unteren Substrat (mit gemusterten Elektroden) und ein oberes Substrat (mit einer zusammenhängenden, transparenten Elektrode, die typischerweise aus ITO gebildet) positioniert. </li><li> Um das Gerät so auf, entfernen Polymerbeschichtungen von den Kontaktstellen des unteren Substrats durch vorsichtiges Schaben mit einem Skalpell. Paar der exponierten Pads des unteren Substrats mit 40-poliger Stecker (Abbildung 1a). </li><li> Power-auf einem Computer mit LabView (National Instruments, Austin, TX), ein Haus gebaut Schaltkasten (mit einer Reihe von Hochspannungs-Relais, die durch Signale von einem National Instruments DAQPad gesteuert), einen Funktionsgenerator und einen Verstärker . Der Computer / Schaltkasten erleichtert dem Anwender die Kontrolle über die Anwendungsbereitstellung von 100 V RMS / 18 kHz-Signale an das Gerät über den 40-poligen Stecker. </li><li> Montieren Sie das Gerät durch Positionierung von zwei Stücken doppelseitigem Klebeband (140 mu m Gesamtdicke) an den Rändern der unteren Substrat und komplett mit unstrukturierten ITO Dias (Deckplatte). </li><li> Zur Initialisierung der Steuerung, führen Sie das LabView Kalibrierung Programm (geschrieben in-house), um den Regelkreis zu kalibrieren. </li><li> Legen Sie die Probe und Reagenzien in den entsprechenden Behältern (siehe Abschnitt 3 unten) aus und legen sie unter die Top-Substrat (Teflon-beschichteten Seite nach unten). Befestigen Sie die Erdungsklemme an die Spitze Substrat. </li><li> Laden Sie die Betätigung Code in LabView (geschrieben in-house) und das Programm ausführen zu Tröpfchen Betätigung einzuleiten. </li></ol> Teil 3: Probe und Reagenz-Vorbereitung <ol><li> Bereiten Sie arbeiten Puffer (WB): 100 mM Tris-HCl (pH 7,8) und 0,08% Pluronic F127 w / v. </li><li> Lösen Protein (e) in WB und Pipette Probe in den Behälter 1 (R-1) auf dem Gerät analysiert werden, wie in Abbildung 1b gezeigt. </li><li> Bereiten Fällungsmittel, 20% Trichloressigsäure (TCA) in DI-Wasser und Pipette in R-2. </li><li> Bereiten Waschpuffer, 70/30 Chloroform / Acetonitril (ACN) und Pipette in R-4. </li><li> Bereiten Umsolubilisieren Puffer, 100 mM Ammoniumbicarbonat (pH 8,0) und 0,08% Pluronic F127 w / v, und Pipette in R-5. </li><li> Lösen Reduktionsmittel, Tris (2-carboxy) phosphin (TCEP), bei 10 mM in WB und Pipette in R-6. </li><li> Lösen Sie Alkylierungsmittel iodoacetamide (IAM), bei 12 mM in WB und Pipette in R-7. </li><li> Lösen Trypsin in WB bei einer Konzentration gleich zu 1 / 5 der Konzentration des Gesamt-Protein-Probe (siehe 3.1, oben) und Pipette in R-8. </li></ol> Teil 4: Digitale Mikrofluidik Sample Processing <ol><li> Das folgende Verfahren wird automatisch mittels LabVIEW-Code in-house geschrieben implementiert. Das Volumen der Tröpfchen aus Stauseen verzichtet wird durch die Abmessungen der Elektroden (in diesem Fall verzichtet wird Tröpfchen ~ 600nL) definiert. </li><li> Dispense ein Tröpfchen von Protein-haltige Probe von R-1 und einem Tropfen Fällungsmittel von R-2 (Abbildung 2, Frame 1). Merge der beiden Tröpfchen und ermöglicht die kombinierte Tropfen für 5 min inkubieren, wodurch die Ausscheidung von proteins auf der Oberfläche (Abb. 2, Frames 2-3). Betätigen Sie den Überstand vom ausgefallenen Proteins an die Abfallbehälter, R-3 (Abbildung 2, Frame 4). </li><li> Dispense drei Tropfen Waschpuffer aus R-4 und fahren sie über die gefällten Proteins an die Abfallbehälter, R-3 (Abbildung 2, Frame 5). </li><li> Nachdem sich der Niederschlag zu trocknen, und verzichten einen Tropfen Umsolubilisieren Puffer von R-5 an das Protein. Lassen Sie den Puffer für 20 min inkubieren, bis der Niederschlag gelöst hat (Abbildung 2, Frame 6). </li><li> Dispense ein Tröpfchen Reduktionsmittel aus R-6 und verschmelzen sie mit der Probe Tropfen. Mix der kombinierten Tröpfchen durch Betätigen es über 6 Elektroden in einem kreisförmigen Muster. Lassen Sie die Tropfen für 1 h bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer (Abbildung 3, Frames 1-2) inkubieren. </li><li> Dispense ein Tröpfchen Alkylierungsmittel aus R-7 und verschmelzen sie mit der Probe Tröpfchen, durch Mischen (wie in 4,5) gefolgt. Lassen Sie die Tropfen für 15 min bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer, vor Licht geschützt (Abbildung 3, Frames 2-3) inkubieren. </li><li> Dispense ein Tropfen Trypsin aus R-8, und führen Sie sie mit der Probe Tröpfchen, durch Mischen (wie in 4,5) gefolgt. Lassen Sie die Tropfen für 3 h bei 37 ° C in einer feuchten Kammer auf einer heißen Platte (Abbildung 3, Frames 3-4). </li></ol> Teil 5: Post-Processing-Probenvorbereitung <ol><li> Entfernen Sie die obere Substrat und stillen Verdauung Reaktion durch Zugabe von 0,6 ml 2,5% Trifluoressigsäure in Wasser. </li><li> Purify abgeschreckt Reaktionsprodukt mit C18 ZipTips (Millipore, Billerica, MA) nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Verdünnen gereinigte Probe in VE-Wasser auf ein Endvolumen von 100 mL. </li></ol> Teil 6: Massenspektrometrie <ol><li> Beurteilen Sie die bearbeitete Probe auf einem Nano-HPLC gepaart mit einem Tandem-Massenspektrometer. Das HPLC-System verwendet hier aus Eksigent Technologies und ist mit einem Trap-Säule (3 mm Durchmesser. C18 Perlen, 150 pm ID x 2,5 cm) und eine Reversed-Phase-Trennsäule (3 mm Durchmesser ausgestattet. C18 Perlen, 75 pm ID x 15 cm). Das Massenspektrometer dient hier ein LTQ von Thermo-Fisher Scientific. </li><li> Legen Sie eine 2 ul Probe auf die Trap-Säule bei 5μL/min in einer mobilen Phase aus 5% Acetonitril in Wasser. Trennen Sie die Probe auf der Reversed-Phase-Säule an 0.5μL/min mit einem linearen Gradienten von 20% Acetonitril bis 80% Acetonitril über 25 min. Weiter läuft bei 80% Acetonitril für weitere 10 min. </li><li> Analysieren Sie die Bänder eluting aus der Säule durch Tandem-Massenspektrometrie. In die Arbeit hier berichtet, ist das Elutionsmittel in das Massenspektrometer über eine Nanoelektrospray Emitter (20 um ID konisch bis 10 um-ID), NewObjective abgetastet. </li><li> Identifizieren Sie die Proteine ​​in der Probe mit Hilfe einer Datenbank-Suchprogramm wie SEQUEST. In dieser Arbeit haben wir die Version von SEQUEST in Bioworks v3.01 (Thermo-Fisher Scientific) aufgenommen, und identifizierten Proteine ​​hatten Wahrscheinlichkeit Punktzahl von weniger als 1,0 E-03 (entspricht 99,9% Konfidenzintervall), und die Reihenfolge Bedeckungen von mindestens 30% (Abbildung 4). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig1a.jpg" align="Figure 1a" /> <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig1b.jpg" align="Figure 1b" /> Abbildung 1. (A) Ein Bild einer DMF-Gerät auf 40-Pin-Anschlüsse für die automatisierte Tropfen Betätigung gepaart. (B) Eine schematische Darstellung einer Vorrichtung der Darstellung der Positionierung der Probe und Reagenzien für eine Proteomanalyse Aufarbeitung erforderlich. <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig2.jpg" align="Figure 2" /> Abbildung 2. Frames aus einem Film der Darstellung der automatisierten Extraktion und Reinigung von BSA in 20% TCA (Fällungsmittel) und 70/30% Chloroform / Acetonitril (Spüllösung). In Rahmen 6, wird das ausgefallene Protein in einem Tropfen 100 mM Ammoniumbicarbonat gelöst. <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig3.jpg" align="Figure 3" /> Abbildung 3. Frames aus einem Film illustriert sequentielle Reduktion, Alkylierung und Verdauung von einem Tropfen resolubilisiert Protein. In dieser Figur sind die Reagenzien mit Farbstoffen für Klarheit gefärbt; in der Praxis sind die Reagenzien nicht gefärbt. <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig4.jpg" align="Figure 4" /> Abbildung 4. MS-Chromatogramm einer Probe von Rinderserumalbumin durch die digitale Mikrofluidik verarbeitet. 25 unterschiedliche Peptide identifiziert wurden (99,9% Konfidenzintervall) entspricht einer Sequenz Abdeckung von 44%.

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	<li>Abdelgawad, M., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Digital+Revolution:+A+New+Paradigm+for+Microfluidics.">The Digital Revolution: A New Paradigm for Microfluidics.</a> Adv. Mat. 21, 920-925 (2009).</li><li>Jebrail, M., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Digital+Microfluidic+Method+for+Protein+Extraction+by+Precipitation.">A Digital Microfluidic Method for Protein Extraction by Precipitation.</a> Anal. Chem. 81, 330-335 (2009).</li><li>Luk, V. N., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Digital+Microfluidic+Approach+to+Proteomic+Sample+Processing.">A Digital Microfluidic Approach to Proteomic Sample Processing.</a> Anal. Chem. 81, 4524-4530 (2009).</li></ol>

Der Mangel an standardisierten Probe Handhabung und Verarbeitung in der Proteomik ist eine große Einschränkung für das Feld. Darüber hinaus beinhaltet konventionellen makroskopischen Probe Umgang mit mehreren Containern und Lösung Transfers, die zur Zerstörung und Verschmutzung Probe kann. Eine mögliche Lösung für diese Probleme ist es, integrierte Systeme für die Probenaufbereitung sich auf digitale Mikrofluidik 1 (DMF) zu bilden. In früheren Arbeiten wurde DMF gezeigt, dass für die effiziente En...

digital microfluidics for automated proteomic processing

Klinische Proteomics ist eine wichtige neue Disziplin entstanden, viel versprechende Entdeckung von Biomarkern, die nützlich für die frühe Diagnose und Prognose von Krankheiten wird. Während in der klinischen Proteomik Methoden sehr unterschiedlich sind, ist ein gemeinsames Merkmal der Notwendigkeit (i) Extraktion von Proteinen aus äußerst heterogenen Flüssigkeiten (zB Serum, Vollblut, etc.) und (ii) umfassende biochemische Verarbeitung vor der Analyse. Hier berichten wir über eine neue digitale Mikrofluidik (DMF) basierende Methode der Integration mehrerer Prozessschritte in der klinischen Proteomik eingesetzt. Dazu gehören Proteinextraktion, Resolubilisierung, Reduktion, Alkylierung und enzymatische Verdauung. Digitale Mikrofluidik ist ein mikro-Fluid-Handling-Technik, bei der Nanoliter-Mikroliter-Tröpfchen auf einer offenen Fläche manipuliert werden. Tröpfchen auf der Oberseite aus einem Array von Elektroden, die durch eine dielektrische Schicht beschichtet sind, positioniert sind - wenn ein elektrisches Potential an den Tropfen angelegt wird, sammeln sich Ladungen auf beiden Seiten des Dielektrikums. Die Gebühren dienen als elektrostatische Griffe, die verwendet werden, um Tropfen Lageregelung werden können, und durch Vorspannen einer Folge von Elektroden in Serie, Tropfen gemacht zu verzichten, verschieben, zusammenführen, Mix-und Split auf der Oberfläche sein. Daher ist DMF eine natürliche Ergänzung für die Durchführung schneller, sequentiell, mehrstufige, miniaturisierte automatische biochemische Assays. Dies stellt einen bedeutenden Fortschritt gegenüber herkömmlichen Methoden (unter Berufung auf manuelles Pipettieren oder Roboter), und hat das Potenzial, ein nützliches neues Werkzeug in der klinischen Proteomik werden. Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk und Steve CC Shih trugen gleichermaßen zu dieser Arbeit. Sergio LS Freire die aktuelle Adresse an der Universität der Wissenschaften in Philadelphia auf 600 South 43rd Street, Philadelphia, PA 19104 gelegen.

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Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Digitale Mikrofluidik ist eine Technik, durch die Manipulation von diskreten Tröpfchen (~ nL - mL) charakterisiert auf eine Reihe von Elektroden, die durch die Anwendung von elektrischen Feldern. Es ist für die Durchführung schnelle, sequentielle, miniaturisierte automatische biochemische Assays gut geeignet. Hier berichten wir über eine Plattform, die die Automatisierung von mehreren Proteom Verarbeitungsschritte.

Digitale Mikrofluidik für die automatisierte Verarbeitung Proteomic

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

digital-microfluidics-for-automated-proteomic-processing

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K Aufrufe.  University of Toronto. Digitale Mikrofluidik ist eine Technik, durch die Manipulation von diskreten Tröpfchen (~ nL - mL) charakterisiert auf eine Reihe von Elektroden, die durch die Anwendung von elektrischen Feldern. Es ist für die Durchführung schnelle, sequentielle, miniaturisierte automatische biochemische Assays gut geeignet. Hier berichten wir über eine Plattform, die die Automatisierung von mehreren Proteom Verarbeitungsschritte.

Serie: Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Chemotactic Response of Marine Micro-Organisms to Micro-Scale Nutrient Layers

The degree to which planktonic microbes can exploit microscale resource patches will have considerable implications for oceanic trophodynamics and biogeochemical flux. However, to take advantage of nutrient patches in the ocean, swimming microbes must overcome the influences of physical forces including molecular diffusion and turbulent shear, which will limit the availability of patches and the ability of bacteria to locate them. Until recently, methodological limitations have precluded direct examinations of microbial behaviour within patchy habitats and realistic small-scale flow conditions. Hence, much of our current knowledge regarding microbial behaviour in the ocean has been procured from theoretical predictions. To obtain new information on microbial foraging behaviour in the ocean we have applied soft lithographic fabrication techniques to develop 2 microfluidic devices, which we have used to create (i) microscale nutrient patches with dimensions and diffusive characteristics relevant to oceanic processes and (ii) microscale vortices, with shear rates corresponding to those expected in the ocean. These microfluidic devices have permitted a first direct examination of microbial swimming and chemotactic behaviour within a heterogeneous and dynamic seascape. The combined use of epifluorescence and phase contrast microscopy allow direct examinations of the physical dimensions and diffusive characteristics of nutrient patches, while observing the population-level aggregative response, in addition to the swimming behaviour of individual microbes. These experiments have revealed that some species of phytoplankton, heterotrophic bacteria and phagotrophic protists are adept at locating and exploiting diffusing microscale resource patches within very short time frames. We have also shown that up to moderate shear rates, marine bacteria are able to  fight the flow  and swim through their environment at their own accord. However, beyond a threshold high shear level, bacteria are aligned in the shear flow and are less capable of swimming without disturbance from the flow. Microfluidics represents a novel and inexpensive approach for studying aquatic microbial ecology, and due to its suitability for accurately creating realistic flow fields and substrate gradients at the microscale, is ideally applicable to examinations of microbial behaviour at the smallest scales of interaction.  We therefore suggest that microfluidics represents a valuable tool for obtaining a better understanding of the ecology of microorganisms in the ocean.

The fabrication of microfluidic channels and their implementation in experiments for studying the chemotactic foraging behaviour of marine microbes within a patchy nutrient seascape and the swimming behaviour of bacteria within shear flow are described.

Chemotaktische Reaktion der marinen Mikroorganismen zu Micro-Scale Nutrient Layers

The degree to which planktonic microbes can exploit microscale resource patches will have considerable implications for oceanic trophodynamics and ...

Forschung

Biologie

Studies of Bacterial Chemotaxis Using Microfluidics - Interview

Studium der bakteriellen Chemotaxis Mit Mikrofluidik - Interview

Applying Microfluidics to Electrophysiology

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the microfluidic brain slice device is discussed including how the device docks to standard perfusion chambers and the technique of passive pumping which is used to deliver boluses of neuromodulators to the brain slice.  By simplifying the device design, we are able to achieve a practical solution to the current unmet electrophysiology need of applying multiple neuromodulators across multiple regions of the brain slice.  This is achieved by substituting the standard coverglass substrate of the perfusion chamber with a thin microfluidic device bonded to the coverglass substrate.  This was then attached to the perfusion chamber and small holes connect the open-well of the perfusion chamber to the microfluidic channels buried within the microfluidic substrate.  These microfluidic channels are interfaced with ports drilled into the edge of the perfusion chamber to access and deliver stimulants.  This project represents how the field of microfluidics is transitioning away from proof-of concept device demonstrations and into practical solutions for unmet experimental and clinical needs.

Anwenden von Mikrofluidik zur Elektrophysiologie

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the ...

Development of New Therapeutic Applications Using Microfluidics

Entwicklung neuer therapeutischer Anwendungen mit Hilfe von Mikrofluidik

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

Elektrophoretische Trennung von Proteinen

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Immunoblot Analysis

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the specificity inherent in antigen-antibody recognition. It involves the solubilization and electrophoretic separation of proteins, glycoproteins, or lipopolysaccharides by gel electrophoresis, followed by quantitative transfer and irreversible binding to nitrocellulose, PVDF, or nylon. The immunoblotting technique has been useful in identifying specific antigens recognized by polyclonal or monoclonal antibodies and is highly sensitive (1 ng of antigen can be detected). This unit provides protocols for protein separation, blotting proteins onto membranes, immunoprobing, and visualization using chromogenic or chemiluminescent substrates.

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the specificity inherent in antigen-antibody recognition. This video provides protocols for protein separation, blotting proteins onto membranes, immunoprobing, and visualization using chromogenic or chemiluminescent substrates.

Immunoblot-Analyse

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the ...

Staining Proteins in Gels

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for detecting proteins by four popular methods. Coomassie blue staining is an easy and rapid method. Silver staining, while more time consuming, is considerably more sensitive and can thus be used to detect smaller amounts of protein. Fluorescent staining is a popular alternative to traditional staining procedures, mainly because it is more sensitive than Coomassie staining, and is often as sensitive as silver staining. Staining of proteins with SYPRO Orange and SYPRO Ruby are also demonstrated here.

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. Staining of proteins with Coomassie Blue, Silver Staining, SYPRO Orange, SYPRO Ruby are demonstrated in this video.

Die Färbung Proteine ​​in Gelen

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, moniliformin, etc... have adverse effects on both human and animal health and some are considered as pathogenicity factors. Proteomic studies showed to be effective for deciphering toxin production mechanisms (Taylor et al., 2008) as well as for identifying potential pathogenic factors (Paper et al., 2007, Houterman et al., 2007) in Fusaria. It becomes therefore fundamental to establish reliable methods for comparing between proteomic studies in order to rely on true differences found in protein expression among experiments, strains and laboratories. The procedure that will be described should contribute to an increased level of standardization of proteomic procedures by two ways. The filmed protocol is used to increase the level of details that can be described precisely. Moreover, the availability of standardized procedures to process biological replicates should guarantee a higher robustness of data, taking into account also the human factor within the technical reproducibility of the extraction procedure.
The protocol described requires 16 days for its completion: fourteen days for cultures and two days for protein extraction (figure 1). 
Briefly, Fusarium strains are grown on solid media for 4 days; they are then manually fragmented and transferred into a modified toxin inducing media (Jiao et al., 2008) for 10 days. Mycelium is collected by filtration through a Miracloth layer. Grinding is performed in a cold chamber. Different operators performed extraction replicates (n=3) in order to take into account the bias due to technical variations (figure 2). Extraction was based on a SDS/DTT buffer as described in Taylor et al. (2008) with slight modifications. Total protein extraction required a precipitation process of the proteins using Aceton/TCA/DTT buffer overnight and Acetone /DTT washing (figure 3a,3b). Proteins were finally resolubilized in the protein-labelling buffer and quantified. Results of the extraction were visualized on a 1D gel (Figure 4, SDS-PAGE), before proceeding to 2D gels (IEF/SDS-PAGE). The same procedure can be applied for proteomic analyses on other growing media and other filamentous fungi (Miles et al., 2007).

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Protein extraction for proteomic analyses in fungal species requires high levels of standardization to be accomplished according with the minimum information about a proteomic experiment (MIAPE) guidelines. We present a video-protocol that includes a procedure for minimizing experimental bias during toxin induction and protein extraction from Fusarium spp.

Toxin Induktions-und Protein-Extraktion aus Fusarium Spp. Kulturen für Proteom-Studien

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is a highly aqueous extracellular matrix overlying the retina where intraocular as well as extraocular proteins accumulate during disease.1-3 Abnormal interactions between vitreous and retina underlie several diseases such as retinal detachment, proliferative diabetic retinopathy, uveitis, and proliferative vitreoretinopathy.1,4 The relative mouse vitreous volume is significantly smaller than the human vitreous (Figure 1), since the mouse lens occupies nearly 75% of its eye.5 This has made biochemical studies of mouse vitreous challenging. In this video article, we present a technique to dissect and isolate the mouse vitreous from the retina, which will allow use of transgenic mouse models to more clearly define the role of this extracellular matrix in the development of vitreoretinal diseases.

The dissection technique illustrates evisceration of the vitreous, retina, and lens from the mouse eye, separation by centrifugation, and characterization with protein assays.

Ausweiden der Maus Glaskörper und Netzhaut für Proteomik-Analysen

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Metabolische Markierung und Membran Fraktionierung für Vergleichende Proteomanalyse von<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Fahrwerk Zellkulturen

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...