Diese Methode ermöglicht es, die räumliche zeitliche Verteilung der von B-Zellen angewendeten Kräfte an immunsynapse zu messen und sie mit der Rekrutierung spezifischer Proteine zu korrelieren. Die Traktionskraftmikroskopie mit Polyacrylamidgelen ist einfach zu implementieren. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um schnell die Messung der mechanischen Fähigkeiten vieler B-Zellen einzurichten.
Diese Methode ist flexibel und kann angepasst werden, um andere Liganden wie Integrine zu grafisch zu graphieren oder andere Arten von Immunsynapsen wie T-Zellen oder frustrierte Phagozytose zu studieren. Aufgrund der physikalischen und chemischen Eigenschaften der Gele, die für dieses Experiment erforderlich sind, kann die Anpassung klassischer Traktionskraftmikroskopiemethoden an B-Zellen schwierig sein. Beginnen Sie mit der Versalzung der Gelunterstützung.
Aktivieren Sie den Deckelrutsch oder Glasboden Petrischale mit einer UV-Lampe für zwei Minuten, dann versalzen Sie es mit 200 Mikroliter APTMS für fünf Minuten. Dadurch wird die Unterstützung für die kovalente Bindung des Gels vorbereitet. Waschen Sie die Deckel- oder Glasbodenschale gründlich mit reinem Ultrawasser und trocknen Sie sie mit Vakuumaspiration.
Um die Abdeckungen zum Abflachen des Gels vorzubereiten, legen Sie sie in einen keramischen Deckeldeckelhalter, legen Sie den Halter in einen kleinen Becher und gießen Sie das silikonisierende Reagenz über die Abdeckungen, um sie vollständig zu bedecken. Bedecken Sie den Becher mit Aluminiumfolie und lassen Sie ihn bei Raumtemperatur für drei Minuten. In der Zwischenzeit einen großen Becher mit reinem Ultrawasser füllen.
Nach drei Minuten Inkubation im Siliziumisagen den Deckelhalter mit den Deckellipsen in den Becher mit Wasser geben. Spülen Sie die Abdeckungen gründlich mit reinem Reinstwasser ab. Trocknen Sie sie gut und legen Sie sie auf Papiertücher.
Um optimale Ergebnisse zu erzielen, fahren Sie sofort mit der Gelpolymerisation fort. Bereiten Sie einen 500 Pascal Gel-Vormix nach Manuskriptanweisungen vor, dann kombinieren Sie 167 Mikroliter des Pre-Mix mit 1,67 Mikroliter Perlen. Wirbel und beschallen die Mischung in einem Bad Beschallungsgerät für fünf Minuten.
Schützen Sie die Mischung vor Licht mit Aluminiumfolie. Um die Polymerisation zu großzumachen, fügen Sie 1,67 Mikroliter 10%Ammoniumpersulfat in die Gelmischung ein, und initiieren Sie dann die Polymerisation, indem Sie 0,2 Mikroliter TEMED hinzufügen und das Gel mit einer Pipette mischen. Um das Gel zu gießen, Pipette neun Mikroliter Gel mischen auf jede versalzte Abdeckung slip oder Glas Bodenschale.
Das Gel sofort mit dem silikonisierten Deckelschlupf abflachen und mit Zangen nach unten drücken, um sicherzustellen, dass sich das Gel über den gesamten Bereich des Deckels ausbreitet und ein Teil davon austritt. Invertieren Sie die Coverslip- oder Glasbodenschale in eine große Petrischale und tippen Sie sie auf die Bank, um die Perlen zur Geloberfläche zu zwingen. Legen Sie ein befeuchtetes Gewebe auf die Schale, um eine Nasskammer zu schaffen.
Bedecken Sie es mit Aluminiumfolie und inkubieren Sie es für eine Stunde. Erleichtern Sie nach der Inkubation die Coverslip-Freigabe, indem Sie der Probe PBS hinzufügen. Entfernen Sie vorsichtig den Deckelrutsch mit einer Nadel, leicht kippen die Schale, aber stellen Sie sicher, dass das Gel in der PBS untergetaucht ist.
Das Siliziummittel Acrylamid, Basisacrylamid und TEMED können durch Einatmen toxisch sein. Tragen Sie standardmäßige persönliche Schutzausrüstung und manipulieren Sie diese Produkte unter einer chemischen Haube. Aspirieren Sie die PBS aus den Gelen und fügen Sie 150 Mikroliter Sulfo-SANPAH bei Raumtemperatur hinzu.
Setzen Sie das Gel für zwei Minuten uv-behandlung, dann waschen Sie das Gel dreimal mit PBS. Wiederholen Sie die Behandlung mit Sulfo-SANPAH und den PBS-Waschungen, fügen Sie dann 250 Mikroliter Hühnerei-Lysozym oder HEL in das Gel ein und inkubieren Sie es über Nacht in einer feuchtigkeitskammer bei vier Grad Celsius, die mit Aluminiumfolie bedeckt ist. Nach der Inkubation das HEL-Antigen entfernen und das Gel dreimal mit PBS waschen.
Schließlich das Gel mit 500 Mikroliterb B-Zellkulturmedien abdecken und bei Raumtemperatur belassen. Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop mit thermischer und Kohlendioxid-Steuerung für die Bildgebung. Aspirieren Sie die Medien aus dem Gel, so dass etwa 200 Mikroliter.
Positionieren Sie das Gel auf dem Mikroskop. Zwei Hauptschichten von Perlen erscheinen auf der Unterseite und oben des Gels. Konzentrieren Sie sich auf die Gelebene und finden Sie einen gleichmäßigen Bildbereich.
Wählen Sie den Bildbereich sorgfältig aus und achten Sie darauf, im Fokus zu bleiben. Eine angemessene Perlendichte und eine gleichmäßige Oberfläche sind der Schlüssel zu robusten und zuverlässigen Kraftmessungen. Fügen Sie 80 Mikroliter primäre B-Lymphozyten von MD4-Mäusen zum Gel hinzu, um das Gel zu berühren, um den Fokus zu erhalten.
Stellen Sie sicher, dass der Fokus immer noch korrekt ist und dass Zellen im Bereich absteigend zu sehen sind. Starten Sie die Erfassung, bevor die Zellen das Gel erreichen. Öffnen Sie den Film als Stapel von Bildern in ImageJ, und führen Sie dann das Makro cropandsave.ijm aus.
Wählen Sie ein Ausgabeverzeichnis aus, und konfigurieren Sie die Attributkanaleinstellungen. Wählen Sie die Bereiche aus, die mit dem Rechteckwerkzeug von Interesse sind, und fügen Sie sie mit der T-Taste zur ROI-Liste hinzu. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf OK. Wenn das Makro eine Maske der Zelle vorschlägt, klicken Sie auf OK, wenn sie zufriedenstellend ist.
Wenn nicht zufriedenstellend, klicken Sie auf nicht OK, und wählen Sie dann manuell einen geschlossenen Bereich mit einem beliebigen Auswahlwerkzeug aus, und klicken Sie dann auf Fortfahren. Öffnen Sie MATLAB und führen Sie tfmv1.m aus. Geben Sie die erforderlichen Parameter ein.
Überprüfen Sie insbesondere die Bildeigenschaften, z. B. Pixelgröße und Zeitintervall der Erfassung und die Geleigenschaften wie Young-Modul E und Poisson-Verhältnis. Suchen Sie nach Abschluss der Ausgaben der Software im selben Verzeichnis wie die Originaldatei. Korrekte Perlenbilder sehen aus wie eine gleichmäßige und zufällige Verteilung von hellen Flecken, die einem Sternenhimmel ähneln.
Daten und Analysen sind nicht zuverlässig, wenn die Anzahl der Perlen zu niedrig ist oder das Bild nicht im Fokus steht. Es ist möglich, die Bewegung der Perlen durch das Auge mit einem Referenzrahmen zu beobachten, der dem ersten Kontakt der Zelle mit dem Substrat vorausging. Ungefähre Ergebnisse konnten durch die Einzelpartikelverfolgung erzielt werden.
Die Analyse liefert eine Segmentierung der Perlen im Referenzbild als Steuerelement. Mit Hilfe von Software ist es auch möglich, das Verschiebungs- und Spannungsfeld zu erhalten, das der Vektor der lokalen Spannung bei jedem Pixel und jedem Zeitpunkt ist. Skalare Scalar Produkt der Verschiebung und Kraftfelder auf der Fläche der Zelle integriert bietet Die gesamte Arbeit von der Zelle auf dem Substrat ausgeübt.
Beim Vergleich von zwei biologischen Bedingungen kann eine durchschnittliche Kurve oder ein Durchschnittswert über die letzten Zeitpunkte berechnet werden, an denen die Energie ein Plateau erreicht. Wenn räumliche Informationen der Kräfte relevant sind, ist es auch möglich, einzelne Zeitpunkte jeder Bedingung zu vergleichen. Ein Beispiel für Fluoreszenz-Antigenextraktions-Zeitraffer wird hier gezeigt.
Das fortschreitende Auftreten von fluoreszierenden Signalen an der Synapse weist auf eine Antigenablösung vom Gel hin. Die Fluoreszenzdaten können verwendet werden, um eine durchschnittliche Extraktionskurve zu erstellen. Der heikelste Schritt im Protokoll ist die Polymerisation des Gels unter dem Deckschein.
Dieser Schritt muss relativ schnell und sorgfältig durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass das Gel gleichmäßig unter den Deckelschlupf gedrückt wird. Nach diesem Verfahren kann fluoreszierendes Protein, das B-Lymphozyten exzeicht, verwendet werden, um gleichzeitig die Lokalisation intrazellulärer Strukturen zu bewerten und die Musterung zu erzwingen. Diese Technik kann mit genetischen oder chemischen Störungen kombiniert werden, um die Rolle bestimmter Proteine auf zellkontraktilität und Antigenaufnahme zu bewerten.
