Dieses Protokoll hilft, die Existenz von Wolbachia in Zellen zu überprüfen, was die Grundlage für das Verständnis der Interaktion zwischen Wolbachia und seinem Host ist. In diesem Protokoll wurden vier Methoden verwendet, um eine intrazelluläre Wolbachia-Infektion erfolgreich nachzuweisen, was die Nachweisgenauigkeit der Wolbachia-Infektion von Zellen bestätigte und verbesserte. Qiuqiu Xiao, ein Doktorand des Schlüssellabors für moderne Pathogenbiologie und -merkmale, wird das Verfahren demonstrieren.
Beginnen Sie mit der Beobachtung unbefleckter Aa23- und Aa23-T-Zellen bei 100-facher Vergrößerung mittels Lichtmikroskopie. Kultivieren Sie die Zellen für fünf bis sieben Tage, um 70 bis 80% Konfluenz pro Flasche zu erreichen. Übertragen Sie mit einer Pipette 1 ml des Kulturmediums auf ein Mikrozentrifugenröhrchen.
Zentrifugieren Sie bei 100 RCF für fünf Minuten, um die Zellen zu ernten. Entfernen Sie den Überstand und lagern Sie das resultierende Zellpellet bei minus 20 Grad Celsius. Kultivieren Sie die Zellen für fünf bis sieben Tage, um 90 bis 100% Konfluenz pro Kolben zu erreichen.
Resuspendieren Sie die Pellets in 0,40 ml PBS und übertragen Sie 50 Mikroliter dieser Lösung in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie fünf Mikroliter 20 mg / ml Proteinase K hinzu und inkubieren Sie bei 55 Grad Celsius für eine Stunde. Dann inkubieren Sie die Röhrchen bei 99 Grad Celsius für 15 Minuten, um die rohe DNA zu erhalten und sie bei minus 20 Grad Celsius zu lagern.
Um eine PCR durchzuführen, bereiten Sie ein Gesamtreaktionsgemisch von 20 Mikrolitern vor und stellen Sie die PCR-Bedingungen wie im Textmanuskript beschrieben ein. Nachweis der DNA auf einem 1%Agarosegel mit einem Gel-Imager. Führen Sie eine quantitative PCR-Amplifikation mit TB Green in einem Echtzeit-PCR-System durch und zeichnen Sie die Ergebnisse jeder Reaktion auf.
Analysieren Sie die DNA in einem Gesamtreaktionsvolumen von 20 Mikrolitern und stellen Sie die quantitativen PCR-Bedingungen ein, wie im Textmanuskript beschrieben. Berechnen Sie die WSP- und RPS6-Genkopienzahlen in den Zellen nach der festgelegten Standardkurve. Berechnen Sie dann die relative Wolbachia-Dichte anhand der Kopierzahl von wsp/RPS6.
Analysieren Sie die Daten mit einem unabhängigen Stichproben-t-Test. Geben Sie 200 Mikroliter Lysepuffer in das Zellpellet und inkubieren Sie es 30 Minuten lang auf Eis. Die Lysate bei 12.000 RCF für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren und den Überstand abspritzen.
Analysieren Sie die wsp-Konzentration des Überstands mit einem BCA-Protein-Assay-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Laden Sie gleiche Mengen Protein auf ein 15%SDS-PAGE Gel. Übertragen Sie das Protein auf Nitrocellulosemembranen und blockieren Sie die Membranen mit 5% Magermilch für zwei Stunden bei Raumtemperatur.
Dann waschen Sie die Membranen dreimal mit TBST. Inkubieren Sie die Membranen über Nacht bei 4 Grad Celsius mit 100 Mikrolitern polyklonaler Anti-WSP-Antikörper, die durch Verdünnung des primären Antikörpers mit 5% Magermilch hergestellt werden. Waschen Sie den primären Antikörper dreimal mit TBST.
Geben Sie 100 Mikroliter Meerrettichperoxidase-konjugierten Sekundärantikörper zu den Membranen und inkubieren Sie ihn auf einem Shaker für eine Stunde bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Membranen dreimal mit TBST und mischen Sie 20 Mikroliter Lösung A und 20 Mikroliter Lösung B im Chemilumineszenz-Detektionskit in einem Verhältnis von eins zu eins. Tauchen Sie die gesamte Membran gleichzeitig in die Lumineszenzlösung ein und beobachten Sie die Signale mit einem multifunktionalen Bildgebungssystem.
Inkubieren Sie auf einer konfokalen Laser-Petrischale Aa23- und Aa23-T-Zellen für drei bis vier Tage bei 28 Grad Celsius unter 5% atmosphärischem Kohlendioxid. Wenn die Zelle 60 bis 70% Konfluenz erreicht, waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Fixieren Sie die Zellen in einem ml 4% Paraformaldehyd für 20 Minuten bei vier Grad Celsius.
Waschen Sie die festen Zellen fünf Minuten lang mit PBST und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS neu. Brüten Sie die Petrischale in einem ml 3%Rinderserumalbumin für eine Stunde bei 37 Grad Celsius aus. Geben Sie 100 Mikroliter Maus-Anti-WSP-Polyklonal-Antikörper und Mausserum zu den Objektträgern und inkubieren Sie es über Nacht in einer nassen Box bei vier Grad Celsius.
Die Petrischale aus der Nasszelle nehmen und wieder auf Raumtemperatur bringen. Waschen Sie sie dreimal mit PBS und entfernen Sie die PBS. Schützen Sie die folgenden Verfahren vor Licht.
Brüten Sie die Petrischale mit 100 Mikrolitern eines Alexa Fluor 488-konjugierten Ziegen-Anti-Maus-Antikörpers bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten aus. Inkubieren Sie die Proben-Petrischale mit 50 Mikrolitern DAPI, verdünnt in PBS auf 10 Mikrogramm / ml bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten und waschen Sie sie dann dreimal mit PBS. Beobachten Sie die Immunfärbung unter einem konfokalen Mikroskop.
Vor dem Nachweis von Wolbachia wurden Aa23- und Aa23-T-Zellen unter einem Lichtmikroskop beobachtet, um morphologische Unterschiede zwischen den beiden Zelllinien zu bestimmen. Die Aa23- und AA23-T-Zellen hatten mindestens zwei Zellmorphologien, aber es wurden keine offensichtlichen morphologischen Unterschiede zwischen den beiden Zelltypen beobachtet. Mit den diagnostischen Primern 81F/691R wurde eine positive Amplifikation des Wolbachia wsp-Gens in Aa23-Zellen, aber nicht in Aa23-T-Zellen nachgewiesen.
Die Analyse der Wolbachia-Dichte in den Zelllinien zeigte ein wsp/rps6-Verhältnis von 2,4 in Aa23-Zellen, aber keine Wolbachia in Aa23-T-Zellen. Die Western-Blot-Analyse von Proteinextrakten zeigte ein starkes WSP-Signal für Aa23, aber für Aa23-T wurde kein Signal detektiert. Der indirekte Immunfluoreszenz-Assay wies das wsp-Protein in Aa23-Zellen nach, während in Aa23-T-Zellen nur DAPI-gefärbte DNA nachgewiesen wurde.
Stellen Sie sicher, dass die Kulturkolben fünf bis sieben Tage lang bei 28 Grad Celsius unter 5% atmosphärischem Kohlendioxid inkubiert werden. Diesem Verfahren kann eine Elektronenmikroskopie folgen, bei der besonders auf die Probenvorbereitung und das Schneiden der Proben geachtet werden muss. Die vier experimentellen Methoden, die in dieser Studie verwendet wurden, bestätigten die Nachweisgenauigkeit der Wolbachia-Infektion in Zellen, die auch auf andere Arten von Zellen und Geweben anwendbar ist.
