Wir möchten Michaela Jansen an der Texas Tech University Health Sciences Center, Lubbock, TX und Mladen Yovchev an der University of Pittsburgh Medical Center, Pittsburgh für die großzügige Bereitstellung pcDNA 3.1 myc-His (A) und hEF1α Promoter die Plasmide danken, PA . Forschung in dieser Veröffentlichung berichtet, wurde von der Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health und Human Development der National Institutes of Health unter Verleihungsnummer R01HD037109 (CCM) unterstützt. Zusätzliche Unterstützung war von Laura W. Bush Institut für Frauengesundheit (CCM und PNG). Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health. Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

1. In Silico Gestaltung der Plasmide und Erzeugung des Überlappungs Grundierungen HINWEIS: Das Ziel dieses Schrittes ist die vollständige Nucleotidsequenz des Konstrukts zusammen und entwerfen die Primer verwendet werden, um Fragmente mit überlappenden Enden für GA Klonen erzeugen. <ol><li> Entwerfen Sie eine kontinuierliche Nukleotidsequenz, die endgültige Plasmid darstellen. </li><li> Zu erhalten, oder eine Liste der tatsächlichen Plasmide und DNA-Fragmente, die als Matrizen bei der PCR verwendet werden. HINWEIS: DNA-Fragmente, die nicht leicht verfügbar sind - wie andere Kombination von Tags und Promotoren - kann als eine einzelne oder mehrere synthetische Doppelstrang-DNA-Fragmente (sDNA) bestellt werden. Diese Fragmente sind zu relativ geringen Kosten im Handel erhältlich und kann bis zu 2 kb Länge (siehe Tabelle der Materialien) sein. </li><li> Unterteilen den kontinuierlichen Nucleotidsequenz des Konstrukts in Schritt 1.1 in DNA-Fragmente für PCR zusammengebaut. Confirm, die die Fragmente entsprechen erhältlichen Plasmiden und sDNA Fragmente. Vermeiden DNA-Fragmente kleiner als 200 nt. </li><li> Zugriff auf die Grundierung Werkzeuggeneration (siehe Tabelle der Ausrüstung). Wählen Sie das Menü &quot;Set Preferences&quot;. Wählen Sie die entsprechenden Einstellungen, indem Sie auf der Registerkarte &quot;CHANGE PREFS&quot; im &quot;Change Gibson Assembly-Einstellungen&quot; Popup-Fenster. HINWEIS: Primer Design kann auch ohne die Verwendung des Primers Werkzeug Generation durchgeführt werden. Die Verwendung des Primers Werkzeugerzeugung vereinfacht jedoch das Verfahren. </li><li> Starten Sie den Aufbau des Konstrukts, indem Sie das Menü &quot;Build-Construct&quot;. Stecken Sie das gespaltene DNA-Fragmente in der Grundierung Generierungstool sequentiell von 5 &#39;nach 3&#39; Ende. ANMERKUNG: Das DNS-Fragment als Plasmidrückgrat eingesetzt bequem in zwei Teile aufgeteilt werden. In der PCR-Endprodukt das 5&#39;-Ende dieser ersten Fragment und das 3&#39;-Ende des letzten Fragments zusammen in einer kontinuierlichen DN verbundenEin Fragment, das die Vektor-Hauptkette. </li><li> Fügen Sie den ersten DNA-Fragment das 5&#39;-Ende der Vektor-DNA in FASTA-Format (eine textbasierte Darstellung der Nukleotid-Sequenz) in die &quot;Enter Vektor oder Insert Fragment&quot; Popup-Fenster darstellt. Benennen Sie die DNA-Fragment. Wählen Sie die passende Art und Weise, um das DNA-Fragment zu erhalten, entweder als PCR, RE Digest oder Synthese. Klicken Sie auf die Registerkarte &quot;WEITER&quot;. </li><li> Wenn es notwendig ist, zusätzliche Nukleotide / Restriktionsstellen an der Kreuzung der endgültige Konstrukt hinzuzufügen benutzen Sie die &quot;FWD oder REV Primer Spacer&quot; Bereiche im Fenster &quot;Add einen Einsatz Fragment der Montage&quot; zur Verfügung gestellt. Fügen Sie zusätzliche Nukleotide / Restriktionsstellen, um nur eine der DNA-Fragmente und nicht an beiden Fragmenten. Klicken Sie auf &quot;DONE&quot; Registerkarte. </li><li> Wiederholung für alle Fragmente, bis das Konstrukt abgeschlossen ist. Wählen Sie das Menü &quot;Ansicht Primer&quot; und überprüfen Sie die Primer-Sequenzen. </li><li> Wiederholen Sie dies für alle Konstrukte (Vektor backbones und Einsätze), oder für die DNA-Fragmente, die unterschiedlich sind. </li></ol> 2. Verstärkung der DNA-Fragmente durch PCR mit Hot Start Korrektur DNA Polymerase (2x Master Mix) ANMERKUNG: Das Ziel dieses Schrittes ist es, ausreichend DNA für die Montage mit Hilfe der PCR-Reaktion erhalten. <ol><li> Erwerben der PCR-Primer in dem vorhergehenden Schritt als entsalzt Produkte und in möglichst geringem Umfang gestaltet. Verdünnen auf 10 &amp; mgr; M in Wasser oder TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,9, 1 mM EDTA). </li><li> Erwerben DNA-Fragmente, die nicht ohne weiteres als sDNA Fragmente vorhanden sind. </li><li> Verdünne alle DNA-Fragmente, einschließlich der sDNA Fragmente, die als Vorlagen für die PCRs bis 1 ng / &amp; mgr; l in Wasser verwendet wird. </li><li> Montieren Sie die PCR-Reaktionen bei Raumtemperatur. Kurz gesagt, verwenden 2,5 ul (10 &amp; mgr; M Stammlösung) der jedem jeweiligen Primer des Primerpaares, 1 &amp; mgr; l (von 1 ng / &amp; mgr; l Vorratslösung) des Matrizen-DNA-Fragment, 25 μl Warmstart Korrekturlesen-DNA-Polymerase (DNA pol; 2x Mastermix, siehe Tabelle der Materialien) und 19 &amp; mgr; l Wasser. Mischen Sie den Schlauch durch leichtes Schnippen und sammeln Sie die Flüssigkeitströpfchen durch kurze Zentrifugation. </li><li> Gleichzeitig verstärken in getrennten Röhren DNA-Fragmente von ähnlicher Größe entsprechend den Empfehlungen für die DNA-pol. Führen 25-28 PCR-Zyklen oder bestimmen die Anzahl der Zyklen, die eine ausreichende DNA-Ausbeute zu produzieren. </li><li> Laufen 10% des PCR-Reaktionsvolumen (5 ul) auf einem Standard-Agarosegel-Elektrophorese und Ethidiumbromid (0,2 ug / ml Endkonzentration) gefärbt. Stellen Sie sicher, dass eine einzelne DNA-Bande, die den PCR-Produkt zu sehen ist. Bestimmung der Größe und der relativen Menge der DNA-Fragmente unter Verwendung von DNA-Molekulargewichtsstandards. Wiederholen Sie gegebenenfalls die PCR, um eine ausreichende Menge an DNA-Fragmente zu erhalten. </li></ol> 3. DpnI Verdau der PCR-Produkte HINWEIS: Das Ziel dieses Schrittes ist es DIGEst Restplasmid Templat-DNA aus den PCRs in Abschnitt 2. DpnI wird Plasmid-DNA zu spalten, wenn es methyliert, wie er bei den in dam + Bakterienstämme gezüchtet Plasmid-DNA. Daher nicht mit DpnI behandelt, wenn die Plasmid-DNA wird als DNA-Fragment in der GA-Reaktion verwendet werden. <ol><li> Hinzufügen 2 ul Restriktionsenzym DpnI an der 45 ul der in Abschnitt 2. Inkubieren hergestellt PCR-Produkte bei 37 ° C für 1 Stunde. Fahren Sie mit Abschnitt 4 oder Einfrieren bei -20 ° C, bis sie benötigt. </li></ol> 4. Reinigung und Konzentration der DNA-Fragmente in DNA Purification Magnetic Beads ANMERKUNG: Das Ziel dieses Schrittes ist es, zu reinigen und zu konzentrieren, die PCR-Produkte in den Abschnitten 2 und 3. Andere PCR-Reinigungsverfahren erhalten werden, können ebenso verwendet werden. <ol><li> Äquilibrieren die DNA-Aufreinigung magnetischen Kügelchen auf Raumtemperatur. Resuspendieren die Perlen durch kurzes Vortexen. </li><li> Übertragen Sie die PCRs vorverdaut with DpnI auf ein 1,5-ml-Röhrchen und fügen Sie 81 ul der DNA-Aufreinigung magnetischen Kügelchen in jedes Röhrchen. Inkubieren des Gemisches bei Raumtemperatur für 10 min. </li><li> Die Röhrchen auf dem Magnetsammler für etwa 2 min. Entsorgen Sie die klare Flüssigkeit mit einer Pipette. Zweimaliges Waschen mit 200 ul 80% Ethanol für 30 sec. </li><li> Ermöglichen, dass die Pellets zu trocknen. Halten den Deckel der Rohre offen ist, wobei die Rohre auf dem Magnetsammler positioniert ist. </li><li> Re-suspendieren die getrockneten Perlen in 10 ul 10 mM Tris-HCl, pH 8,0. Inkubiere bei Raumtemperatur für 2 min. Spin kurz, um die Flüssigkeit am Boden der Röhrchen zu sammeln. </li><li> Positionieren Sie die Rohre auf dem Magnetsammler für 2 min. Entfernen von 8,5 bis 10 &amp; mgr; l der klaren Lösung und legen Sie sie in eine neue Pre-markierten Röhrchen. Man bestimmt die Konzentration der DNA-Fragmente, die durch UV-Spektroskopie (siehe Tabelle Equipment). </li></ol> 5. Montage Klonen Reaktion und Transformation der Produkte in E. coli &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Hinweis: Das Ziel dieses Schrittes ist die Berechnung 3: 1-Verhältnis von Insert: Vektor und führen Sie die Montage Reaktion. <ol><li> Verwenden mindestens 100 ng DNA-Fragment, das das Vektorgerüst und DNA Fragment, das die selektiven Marker. Berechnen der 3-fachen molaren Überschuß für die DNA-Fragmente, die als Einlage verwendet wird. </li><li> Konvertieren Sie die Mol-Überschuß in ng benötigt jedes einzelnen Einsatz. HINWEIS: Ein bequemer Weg, um die Berechnungen zu tun ist, um eine Web-basierte Anwendung verwenden (siehe Tabelle der Ausrüstung). </li><li> Mischen Sie berechneten Mengen von DNA-Fragmenten in einem PCR-Röhrchen, die Lautstärke auf 10 ul. Fügen Sie 10 ul der GA-Mastermix (2x siehe Tabelle der Materialien). Inkubieren der Reaktion bei 50 ° C für 1 Stunde zur Montage von 4 - 6 Fragmente oder 15 min für die Montage von 2-3 Fragmente in einem PCR-Thermocycler. </li><li> Fahren Sie mit der Transformation der Montage Produkt in kompetente E. coli oder Einfrieren der Produkte bei -20° C, bis es gebraucht wird. </li><li> Folgen Sie dem Transformationsverfahren, die die chemische oder elektrokompetenten Zellen begleitet. Normalerweise benutzen 2 ul der Versammlung Reaktion pro Transformationsansatz. </li><li> Nachdem die Umwandlung abgeschlossen ist, verteilt die transformierten Zellen auf Agarplatten mit den entsprechenden selektiven Antibiotikum ergänzt. </li></ol> 6. Plasmidisolierung, Restriktionsenzymverdau und Sequenzierung ANMERKUNG: Das Ziel dieses Schrittes ist die Plasmid-DNA aus E. Isolieren coli, anschließend, um das Konstrukt durch Restriktionsverdau und Sequenzierung verifizieren. <ol><li> Propagieren mehrere Einzelkolonien für Minipreps und Plasmidisolierung. Verwenden Sie 2-5 ml LB Flüssigkultur über Nacht mit einer geeigneten Antibiotika ergänzt. Isolieren der entsprechenden Plasmide nach dem Verfahren, das in dem Mini prep Kits, die verwendet wird, beschrieben wird. </li><li> Bestimmung der Menge und Konzentration der Plasmide mit spektro erhaltenenPhotometer. </li><li> Führen Restriktionsverdau mit einer oder mehreren Restriktionsendonukleasen, um ~ 0,5 &amp; mgr; g der gereinigten Plasmide. Verwenden Restriktionsenzyme, die unterschiedliche Muster der Verdauung charakteristisch für die DNA-Konstrukte bereitzustellen. </li><li> Bestätigen DNA-Klonierung Erfolg durch DNA-Sequenzierung unter Verwendung spezifischer Primer oder Standard. Analysieren Sie die Sequenzdaten für die Richtigkeit. </li></ol>

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	<li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments.">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods in enzymology. 498, 349-361 (2011).</li><li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome.">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nature methods. 7, 901-903 (2010).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature methods. 6, 343-345 (2009).</li><li>Bowtell, D. D., Johnson, G. R., Kelso, A., Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+genes+transferred+to+haemopoietic+stem+cells+by+recombinant+retroviruses.">Expression of genes transferred to haemopoietic stem cells by recombinant retroviruses.</a> Molecular biology &amp; medicine. 4, 229-250 (1987).</li><li>Challita, P. M., Kohn, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+expression+from+a+retroviral+vector+after+transduction+of+murine+hematopoietic+stem+cells+is+associated+with+methylation+in+vivo.">Lack of expression from a retroviral vector after transduction of murine hematopoietic stem cells is associated with methylation in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 2567-2571 (1994).</li><li>Lutzko, C., Senadheera, D., Skelton, D., Petersen, D., Kohn, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+vectors+incorporating+the+immunoglobulin+heavy+chain+enhancer+and+matrix+attachment+regions+provide+position-independent+expression+in+B+lymphocytes.">Lentivirus vectors incorporating the immunoglobulin heavy chain enhancer and matrix attachment regions provide position-independent expression in B lymphocytes.</a> Journal of Virology. 77, 7341-7351 (2003).</li><li>Meilinger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Np95+interacts+with+de+novo+DNA+methyltransferases,+Dnmt3a+and+Dnmt3b,+and+mediates+epigenetic+silencing+of+the+viral+CMV+promoter+in+embryonic+stem+cells.">Np95 interacts with de novo DNA methyltransferases, Dnmt3a and Dnmt3b, and mediates epigenetic silencing of the viral CMV promoter in embryonic stem cells.</a> EMBO reports. 10, 1259-1264 (2009).</li><li>Chan, K. K., Wu, S. M., Nissom, P. M., Oh, S. K., Choo, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+high-level+stable+transgene+expressing+human+embryonic+stem+cell+lines+using+Chinese+hamster+elongation+factor-1+alpha+promoter+system.">Generation of high-level stable transgene expressing human embryonic stem cell lines using Chinese hamster elongation factor-1 alpha promoter system.</a> Stem cells and development. 17, 825-836 (2008).</li><li>Chung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+different+promoter+systems+for+efficient+transgene+expression+in+mouse+embryonic+stem+cell+lines.">Analysis of different promoter systems for efficient transgene expression in mouse embryonic stem cell lines.</a> Stem cells. 20, 139-145 (2002).</li><li>Qin, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+constitutive+promoters+and+the+doxycycline-inducible+promoter.">Systematic comparison of constitutive promoters and the doxycycline-inducible promoter.</a> PloS one. 5, e10611 (2010).</li><li>Lund, A., Knudsen, S. M., Vissing, H., Clark, B., Tommerup, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assignment+of+human+elongation+factor+1alpha+genes:+EEF1A+maps+to+chromosome+6q14+and+EEF1A2+to+20q13.3.">Assignment of human elongation factor 1alpha genes: EEF1A maps to chromosome 6q14 and EEF1A2 to 20q13.3.</a> Genomics. 36, 359-361 (1996).</li><li>Wallace, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+forms+of+the+64,000+Mr+protein+of+the+cleavage+stimulation+factor+are+expressed+in+mouse+male+germ+cells.">Two distinct forms of the 64,000 Mr protein of the cleavage stimulation factor are expressed in mouse male germ cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6763-6768 (1999).</li><li>MacDonald, C. C., McMahon, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+mechanisms+of+alternative+polyadenylation:+testis,+brain,+and+beyond.+Wiley+interdisciplinary+reviews.">Tissue-specific mechanisms of alternative polyadenylation: testis, brain, and beyond. Wiley interdisciplinary reviews.</a> RNA. 1, 494-501 (2010).</li><li>Sabath, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'-End+processing+of+histone+pre-mRNAs+in+Drosophila:+U7+snRNP+is+associated+with+FLASH+and+polyadenylation+factors.">3'-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors.</a> Rna. 19, 1726-1744 (2013).</li><li>Yang, X. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+containing+the+CPSF73+endonuclease+and+other+polyadenylation+factors+associates+with+U7+snRNP+and+is+recruited+to+histone+pre-mRNA+for+3'-end+processing.">A complex containing the CPSF73 endonuclease and other polyadenylation factors associates with U7 snRNP and is recruited to histone pre-mRNA for 3'-end processing.</a> Molecular and cellular biology. 33, 28-37 (2013).</li><li>Grozdanov, P. N., Macdonald, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Sequencing+of+RNA+Isolated+by+Cross-Linking+and+Immunoprecipitation+(HITS-CLIP)+to+Determine+Sites+of+Binding+of+CstF-64+on+Nascent+RNAs.">High-Throughput Sequencing of RNA Isolated by Cross-Linking and Immunoprecipitation (HITS-CLIP) to Determine Sites of Binding of CstF-64 on Nascent RNAs.</a> Methods in molecular biology. 1125, 187-208 (2014).</li><li>Youngblood, B. A., Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CstF-64+supports+pluripotency+and+regulates+cell+cycle+progression+in+embryonic+stem+cells+through+histone+3'+end+processing.">CstF-64 supports pluripotency and regulates cell cycle progression in embryonic stem cells through histone 3' end processing.</a> Nucleic acids research. , (2014).</li><li>Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one+pot,+one+step,+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability.">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PloS one. 3, e3647 (2008).</li><li>Irwin, C. R., Farmer, A., Willer, D. O., Evans, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-fusion(R)+cloning+with+vaccinia+virus+DNA+polymerase.">In-fusion(R) cloning with vaccinia virus DNA polymerase.</a> Methods in molecular biology. 890, 23-35 (2012).</li><li>Annaluru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+synthesis+of+a+functional+designer+eukaryotic+chromosome.">Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome.</a> Science. 344, 55-58 (2014).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+a+bacterial+cell+controlled+by+a+chemically+synthesized+genome.">Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome.</a> Science. 329, 52-56 (2010).</li></ol>

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Der erfolgreiche Einsatz der GA Klonierung stets durch eine sorgfältige Konstruktion der gesamten Konstrukt (Abbildung 2 und Abbildung 3) vorausgehen. Eine sorgfältige Überprüfung der Primersequenzen durch den Primer Werkzeuggeneration konzipiert ist auch sehr zu empfehlen. Primer für GA kann ohne die Verwendung des Primers Werkzeuggeneration erzeugt werden. Jedoch ist die Verwendung des Werkzeugs sehr empfehlen, da es den Prozess vereinfacht. Im Allgemeinen muss die Grundierung für GA Klonen zwei funktionell verschiedene Sequenzen. Die erste Sequenz-DNA-Fragment-spezifisch, und erlaubt die Amplifikation des Fragments unter Verwendung von PCR. Die zweite Sequenz überlappt mit der angrenzenden Fragment, das für GA Montage notwendig ist. Eine typische DNA-Fragment-spezifische Sequenz würde 18-22 nt lang. DNA-Fragment-spezifischen Sequenzen verwendet werden, um die gleiche DNA amplifizieren müssen ähnliche Schmelztemperaturen und dem GC-Gehalt. Überlappende Sequenz sollte mindestens 15nt in der Länge mit einer Schmelztemperatur von mindestens 48 ° C. Die Anordnung von mehr als 4 DNA-Fragmente wird die überlappende Sequenz erfordern mindestens 20 nt betragen. Mehr Überschneidungen wird eine erhöhte Spezifität des Glühen was zu mehr richtig zusammengebaut DNA-Fragmente zu ermöglichen. Es wird empfohlen, um Sequenzen, die in ihrer GC- oder AT-Gehalt in den Entwicklungs überlappende Sequenzen verzerrt werden, da schräg Sequenzen möglicherweise richtige DNA Anordnung beeinträchtigen vermeiden. Wir empfehlen die Verwendung als negative Kontrolle, die keine Arzneimittel-resistente Bakterienkolonien, nur die DNA-Fragment, das dem Vektor-Rückgrat in einem GA Reaktion nicht produzieren sollten. Alternativ kann eines der DNA-Fragmente, umfassend die &quot;Einsätze&quot; kann aus der GA-Reaktion, die auch in nicht Arzneimittel-resistente Bakterienkolonien führen soll weggelassen werden. Der Grund, keine Kolonien wachsen wird das Fehlen von überlappenden Enden der benachbarten DNA-Fragmente sein, welche den Zusammenbau eines kompl rendertete Plasmid. Beschrieben in der Protokoll überlappende Sequenzen von 25 nt zur Erzeugung der Primersätze verwendet wurden, da die Anzahl der DNA-Fragmente verwendet (Abbildung 3). Die Empfehlung des Werkzeugs Website Primer Generation (siehe Tabelle der Ausrüstung) ist es, mindestens 20 nt überlappende Sequenzen zu verwenden, um 4 zu montieren - 6 DNA-Fragmente. Außerdem mehr überlappende Sequenz die richtige Komplementation der DNA-Stränge zu gewährleisten (siehe Abbildung 1) Erhöhung der Anzahl der genau zusammengesetzten Produkte. Derzeit mehrere Systeme für die nahtlose Klonen zur Verfügung. Jedoch verwenden einige dieser Systeme noch Restriktionsenzymen (dh Golden Gate Klonen 18). Andere verwenden eigene Mischungen der Enzyme auf Vaccinia-Virus-DNA-Polymerase und DNA-Einzelstrangbindeprotein aus derselben biologischen Quelle 19. Beide Systeme sind im Vergleich zu GA vom Shor begrenztter Länge der überlappenden Sequenzen. Weil kürzere überlappende Sequenzen stellt möglicherweise ausreichende Spezifität zu dem Glühschritt benachbarter DNA-Fragmente, wodurch die korrekte Montage von mehr als 23-DNA-Fragmente problematisch. Diese Mängel sind nicht in der GA-System vorhanden ist. Die Grße der DNA-Fragmente, die amplifiziert werden soll auch berücksichtigt, um nicht die Größe von PCR zuverlässig amplifizierbare (dh weniger als 8 kbp Länge) überschritten wird. Selbst mit den Verbesserungen in der Funktion der DNA-Polymerasen in den letzten 10 Jahren werden große DNA-Fragmente mit weniger Effizienz und Genauigkeit verstärkt werden. Falls erforderlich, könnten größere DNA-Fragmente aus anderen Quellen Alternative zur PCR, beispielsweise erhalten werden, indem Plasmid-Isolierung und geeignete DNA-Verdauung mit Restriktionsenzymen. Insbesondere für die im aktuellen Manuskript beschriebenen Protokoll unserer rational PCR verwendet wurde auf die Größe der verfügbaren DNA-Fragmente, die alle kleiner sind basierend5 kbp. Wenn es mehr als ein PCR-Produkt durch Agarosegelelektrophorese identifiziert wird Gelreinigung des gewünschten Fragmentgröße unter Verwendung von einer der verfügbaren Techniken der Molekularbiologie oder entsprechende Kits empfohlen. In der aktuellen Protokoll eine thermostabile DNA-Polymerase verwendet (siehe Tabelle der Materialien). Jedoch kann jede DNA-Polymerase, hohe Genauigkeit und Ausbeute wird geeignet mit diesem Protokoll verwendet werden kann. Wenn High-Fidelity DNA-Polymerasen, anders als im Protokoll beschrieben sind, verwenden Sie die Einrichtung Bedingungen wie in den entsprechenden Handbüchern beschrieben. In der aktuellen Protokoll, chemisch kompetente E. coli-Zellen verwendet werden, die mit dem GA-Kit geliefert werden. Alternativ chemisch oder elektro kompetente E. coli-Stämme, wie DH5a oder DH10B verwendet werden. Die Montage Klonen 2x Mastermix ist einfach, mit minimalen hands-on Zeit verwenden. Jedoch ist eine genaue Pipettieren wegen der kleinen Volumina ne erforderlicheEDED miteinander vermischt werden. Geeignet Molekularbiologie Technik benötigt, um jederzeit als auch ausgeübt werden. Der GA Klonen bietet unbegrenzte Möglichkeiten für eine Konstruktion von DNA-Fragmenten, Plasmide und Vektoren, die länger als 3 kbp groß sind. Zusätzlich hat es eine breitere Wirkung auf dem Gebiet der synthetischen Biologie, weil es die Synthese und Anordnung von zum Beispiel eine ganze Bakterien (Mycoplasma mycoides) Genom oder eine Hefe (Saccharomyces cerevisiae) Chromosom 20,21. Die Technik ist auch anwendbar auf konventionelle Klonen muss nahtlose Konstrukte zu erzeugen. Abschließend bietet GA Klonierung schnelle, zuverlässige und flexible Alternative zu herkömmlichen DNA Klonierungsverfahren.

Herkömmliche DNA-Klonierungsverfahren beruhen auf der Verwendung von Restriktionsenzymen, um die DNA und die DNA-Ligase zu spalten, um die DNA-Fragmente miteinander zu verbinden. Erzeugung von benutzerdefinierten Expressionskonstrukte, die verschiedene DNA-Fragmente ist ein sequentielles Verfahren, das die Spaltung der DNA mit einem und / oder mehreren Restriktionsendonukleasen und die anschließende Insertion von DNA-Fragmenten durch Ligation umfasst. Der Hauptnachteil dieses Verfahrens ist, dass geeignete Restriktionsenzyme für eines der DNA-Fragmente können schwer zu identifizieren (dh kann mehrere Spaltstellen) Rendern erfolgreichen DNA-Klonierung der Volllängen-Protein von Interesse möglich. Daher Generation von kundenspezifischen Expressionskonstrukte unter der Transkriptionsregulation der effizienten zelltypspezifische Promotoren mit kundenspezifischen Protein-Tags erfordert eine sehr sorgfältige Gestaltung. Es ist auch ein zeit- und arbeitsaufwendige Technik. Vor kurzem beschrieben Methoden zur multip montieren mehrere Berichtele verschiedenen synthetischen DNA-Fragmenten in einer kontinuierlichen Sequenz gleichzeitig in entweder ein- oder zweistufigen Reaktionen ohne die Verwendung von Restriktionsenzymen 1-3. Das einstufige Klonierung Reaktion (unter Ausschluss aller vorbereitenden Schritte), hängt von der Verwendung einer Mischung von DNA-Exonuclease, DNA-Polymerase, DNA-Ligase 2,3 und die überlappenden Enden der DNA-Fragmente (1). Da es keine Verwendung von Restriktionsenzymen, DNA-Fragmente können von beliebiger Größe und Sequenzzusammensetzung (ohne hoch repetitive Sequenzen) zusammen in einer nahtlosen Konstruktion fusioniert werden. Vor kurzem wurde ein im Handel erhältlichen Kits (Gibson Anordnung; GA) für die Ein-Schritt-Klonierung Reaktionen verfügbar wurde. Dieses Kit ermöglicht eine schnelle und kostengünstige Montage von beliebigen DNA-Fragmente in einem einzigen Vektor mit kundenspezifischen Promotoren und Protein-Tags. Die verwendet werden, um exogene Proteine ​​in Säugetier-Zellkulturmodellen ausdrücken weithin erhältlichen Plasmid-Expressionsvektoren sind häufig unter der Transkriptions regordnung des viralen Cytomegalovirus (CMV) oder Simian Virus 40 (SV40) Promotoren. Diese viralen Promotoren stellen robuste transiente Expression der exogenen Proteine ​​in den meisten Säugerzellkultur-Modellen. Jedoch ist von Zelllinien, die stabil exogene Proteine ​​oft wegen Transkriptions Silencing der CMV- oder SV40-Promotoren während des Herstellungsvorgangs 4,5 erfolglos. Darüber hinaus sind die SV40 und CMV virale Promo nicht ausreichend die Expression von exogenen Proteinen in Zellen aus der lymphoiden Linie oder embryonale Stammzellen 6,7 fördern. Die Lösung der inhärenten Beschränkungen der viralen Promotoren ist es, starke konstitutive nicht-viralen Promotoren 8-10 zu verwenden. Ein gut charakterisiertes starken konstitutiven nichtviralen Promotor von menschlichem Ursprung ist die Elongationsfaktor 1α (hEF1α) Promotor (hEF1α ist bei der Katalyse des GTP-abhängige Assoziation von Aminoacyl-tRNA an Ribosomen 11 beteiligt sind). JedochExpressionsvektoren, die das hEF1α Promotor nicht so stark wie der virale Promotor-enthaltenden Plasmiden verfügbar, insbesondere solche, ebenfalls enthaltend 3 × FLAG am Amino-terminalen Ende des Proteins von Interesse. Das 64.000 MW Spaltung Stimulationsfaktor-Protein (CstF-64) wird in das 3&#39;-End-Verarbeitung der meisten mRNAs 12,13 einschließlich replikationsabhängigen Histon-mRNAs 14,15 beteiligt. CstF-64 ist in allen Körpergeweben 12 ausgedrückt. Seine RNA-Erkennungsmotiv bindet an GU-reiche RNA-Sequenzen auf im Entstehen begriffene Transkripte hinter der Spaltung und Polyadenylierung Seite 16. Diese Bindung CstF-64 auf die prä-mRNA fördert die effiziente endonukleolytische Spaltung des entstehenden Niederschrift. Hier wird ein Protokoll beschrieben, das die PCR-Amplifikation der DNA-Fragmente verwendet, um eine Gibson Anordnung Klonierungskit (das chemisch kompetenten Bakterienzellen enthält) individuelle Vektoren 3xFLAG markierten m herzustellenouse CstF-64 oder eine Mutante CstF-64 ihre aminoterminalen Ende unter dem Ausdruck hEF1α Promotor 1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="553">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:196px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:196px;">Synthetic double-stranded DNA fragment (sDNA)</td>
			<td style="width:71px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>We used gBlocks, which can be up to 2 kb in length. However, there are many commercial sources of synthetic DNA available.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:196px;">DNA purification magnetic beads</td>
			<td style="width:71px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A63880</td>
			<td>Agencourt AMPure XP - PCR Purification system</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:196px;">Plasmid Isolation Mini Kit</td>
			<td style="width:71px;">Omega Bio-Tek Inc</td>
			<td style="width:119px;">D6942-01</td>
			<td>E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:196px;">Gibson Assembly Cloning Kit</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">E5510S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">DNA polymerase&#160;</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">M0494S</td>
			<td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:196px;">DpnI</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:196px;">NheI</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R3131S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:196px;">NotI</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R3189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:196px;">HindIII</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R3104S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:196px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>NanoDrop device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">EditSeq</td>
			<td style="width:71px;">DNASTAR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Part of Lasergene Core Suite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">SeqBuilder</td>
			<td style="width:71px;">DNASTAR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Part of Lasergene Core Suite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">Word</td>
			<td style="width:71px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Part of&#160; Microsoft Office</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">NEBuilder</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>primer generation tool: http://nebuilder.neb.com</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">NEBioCalculator</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>ligation calculator: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of plasmid vectors expressing flag-tagged proteins under the regulation of human elongation factor-1&#945; promoter using gibson assembly

Gibson Anordnung (GA) Klonierung bietet eine schnelle, zuverlässige und flexible Alternative zu herkömmlichen DNA-Klonierungsverfahren. Wir verwendeten GA angepasste Plasmide für die Expression von exogenen Genen in mausembryonalen Stammzellen (mESCs) zu erstellen. Expression exogener Gene unter der Kontrolle des SV40 oder menschliche Cytomegalovirus-Promotoren vermindert schnell nach Transfektion in mESCs. Eine Abhilfe für diese verminderte Expression ist es, die menschliche Elongationsfaktor-1 alpha (hEF1α) Promoter zu verwenden, um die Genexpression zu fahren. Plasmidvektoren, die hEF1α sind nicht so weit verbreitet wie SV40 oder CMV-haltigen Plasmide, vor allem jenen, die auch N-terminale 3xFLAG-Tags zur Verfügung. Das hier beschriebene Protokoll ist eine schnelle Methode, um die Plasmide FLAG-markierten CstF-64 und CstF-64-Mutante unter der Ausdrucks Regulierung des hEF1α Promotors erstellen. GA verwendet eine Mischung aus DNA-Exonuclease, DNA-Polymerase und DNA-Ligase, um die Klonierung von überlappenden Enden der DNA-Fragmente zu ermöglichen.Auf der Grundlage der Vorlage DNAs wir zur Verfügung hatten, haben wir unsere Konstrukte in einer einzigen Sequenz zusammengesetzt werden. Unser Design verwendet vier DNA-Fragmente: pcDNA 3.1 Vektor-Rückgrat, hEF1α Promoter Teil 1, Teil 2 hEF1α Promoter entweder CstF-64 oder spezifische CstF-64-Mutante (die 3xFLAG-Tag als doppelsträngige synthetische DNA-Fragment enthielt gekauft), und. Die Sequenzen dieser Fragmente wurden an einen Primer Generierungswerkzeug geeignete PCR-Primer für die Erzeugung der DNA-Fragmente zu entwerfen hochgeladen. Nach der PCR wurden DNA-Fragmente mit dem Vektor, der den Selektionsmarker und die GA Klonierung Reaktion wurde zusammengemischt. Plasmide von einzelnen transformierten bakteriellen Kolonien wurden isoliert. Einstieg der Plasmide wurde durch Restriktionsverdau durchgeführt, gefolgt von einer Sequenzierung. Abschließend erlaubt GA uns, maßgeschneiderte Plasmide für die Genexpression in 5 Tagen zu erstellen, einschließlich konstruieren Bildschirme und Verifikation.

Ein Arbeitsablauf des Protokolls, gefolgt wurde, ist in 2A gezeigt. Wir wollten CstF-64 und mutierten CstF-64 Proteine ​​3xFLAG-Tag unter dem Ausdrucks Regulierung hEF1α Promotor (2B und 3) fusioniert zu klonen. Ein Plasmid, das hEF1α gefolgt von 3xFLAG-Tag nicht zur Verfügung zu uns. Allerdings waren die folgenden Plasmide verfügbar: pcDNA 3.1 myc-His (A, ein großzügiges Geschenk von Michaela Jansen), hEF1α das Plasmid (ein großzügiges Geschenk von Mladen Yovchev) und Maus CstF-64 Plasmide 12 (Abbildung 3). Die gesamte Sequenz für das Konstrukt (e) wurde mit den Nukleotid-und Textbearbeitungsprogramme (siehe Tabelle der Anlagen Abbildung 3) montiert. Anschließend wurde die Sequenz (en) in vier praktischen Stücke (2B roten Blöcke und Figur 3), die den erhältlichen Plasmid DNAs spalten. Verstärkung primers wurden mit Primer Generierungstool (siehe Tabelle der Anlagen) mit Einschränkungen von 4 entwickelt - 6 Fragmente mit minimaler Überlappung von 25 nt, in der &quot;Change Gibson Assembly-Einstellungen&quot; Popup-Fenster festlegen. NheI und NotI-Restriktionsstellen wurden in die Primer-Design für den Zweck der Identifizierung korrekt montiert Plasmide enthalten. NheI-Stelle in dem Primer-Sequenz zwischen pcDNA 3.1 und 5 &#39;Ende des hEF1α Promotor. NotI-Stelle nach dem Stopp-Codon (UGA) des CstF-64 und pcDNA 3.1 Vektorgerüst entfernt. Bei gleichzeitiger Spaltung mit beide Enzyme DNA-Fragment, bestehend aus hEF1α Promotor 3xFLAG und CstF-64 oder Mutanten CstF-64 wird freigegeben (siehe unten und 2B). Primer wurden auf kleinstem Maßstab bestellt und entsalzt. Der zweite Teil des hEF1α Promotor enthaltenden 3xFLAG-tag-DNA-Fragment (490 bp, 2B, 3) als ein einzelnes sDNA-Fragment (s gekauftee Tabelle der Materialien). DNA-Fragmente in der Versammlung Reaktion verwendet wurden mit DNA pol (siehe Tabelle der Materialien) amplifiziert. DNA-Fragmente von hEF1α Promoter Teil 1, hEF1α Promoter Teil 2, in voller Länge und mutierten CstF-64 wurden gleichzeitig in einem separaten Röhrchen für 28 Zyklen (4A) verstärkt wird, im Anschluss an die Empfehlungen des Lieferanten, der das DNA-pol (siehe Tabelle der Materialien für jeden Zyklus Denaturierung dauerte 7 sec bei 98 ° C, Annealing 45 sec bei 55 ° C, Dehnung von 90 sec bei 72 ° C). Anfänglich wurde die pcDNA 3.1 Rückgrat 22 Zyklen (mit den gleichen Bedingungen wie oben mit der Ausnahme der Dehnung Zeit, die 3 Minuten bei 72 ° C eingestellt war) amplifiziert. Jedoch war das resultierende DNA-Ausbeute nicht ausreichend, um in einem Assoziationsreaktion (4A) verwendet werden. Daher wurde eine zusätzliche Amplifizierung durchgeführt, um ausreichende DNA zu erhalten. PCR-Produkte zu erhalten,ed aus einem Plasmid Vorlage muss mit DpnI Restriktionsenzym verdaut werden, um die Plasmid-DNA, die sonst die sich ergebende Anordnung Reaktionsprodukte kontaminieren und falsch-positiven Drogen-resistenten Bakterienkolonien produzieren zu entfernen. Daher wurden die PCR-Produkte mit dem Restriktionsenzym DpnI, spaltet, methyliert und Hemi-methylierte Plasmid-DNA aus dam + E. getrennt verdaut coli-Stämmen. Erhaltenen PCR-Produkte unter Verwendung von synthetischen DNA-Fragmente als Matrizen müssen nicht mit DpnI da chemisch synthetisierte DNA verdaut enthält nicht methyliert oder hemi-methylierte Basen. DNA-Fragmente wurden gereinigt und über DNA-Aufreinigung magnetischen Kügelchen konzentriert (siehe Tabelle der Materialien), wie im Protokoll Schritt 4. Die PCRs für den pcDNA 3.1 Vektor-Rückgrat wurden vereinigt beschrieben, und die Menge der DNA-Reinigung magnetische Kügelchen verwendet wurde entsprechend angepasst. Die DNA-Ausbeute bestimmtVerwendung eines Spektrophotometers (Tabelle 1 und Tabelle Equipment). Aufbaureaktionen zum CstF-64 und mutante CstF-64-Konstrukte wurden auf Eis (Tabelle 1) zusammengesetzt. A 3-fachen molaren Überschuß von den DNA-Fragmenten als &quot;Einsätze&quot; betrachtet wurde (Tabelle 1, Abbildung 3). Das endgültige Volumen der gemischten DNA-Fragmente wurden zu 10 &amp; mgr; l mit Wasser und 10 ul Anordnung Mastermix (2x) wurde zugegeben. Die Reaktionen wurden gemischt und bei 50 ° C für 1 h inkubiert. Positive Kontrollreaktion wurde nach der Empfehlung des Kit manuelle GA montiert und gleichzeitig mit den CstF-64 und mutierten CstF-64 Reaktionen inkubiert. Wie im Protokoll empfohlen wurden 2 ul der jeder der Montage Reaktionen in chemisch kompetente E. transformierten coli geliefert mit der Montage Klonierungskit (siehe Tabelle der Materialien). Die Transformation wurde durchgeführt wie in dem Kit beschriebenHandbuch. Positive Klone wurden auf Ampicillin-Agar / LB-Platten selektiert. 6 Kolonien pro jeder Baugruppe Reaktion wurden zufällig ausgewählt, um vermehrt werden. Plasmid-DNAs wurden unter Verwendung eines Plasmid-Isolation Mini Kit (siehe Tabelle der Materialien) isoliert. In silico Verdauung der Konstrukte mit den Restriktionsenzymen NheI und NotI ergab zwei Fragmente mit Größen von 4590 bp, 3032 bp für CstF-64 und 4.590 bp, 2.711 bp auf mutante CstF-64 (2B und 4B). Verdauung mit den Restriktionsenzymen HindIII und NotI ergab drei Fragmente mit den Größen: 5.872 bp, 1005 bp und 745 bp (CstF-64) und 5.872 bp, 1005 bp und 424 bp (Mutante CstF-64, Figur 2B und 4C). Tatsächlich Verdau der isolierten Plasmide zeigten die erwarteten charakteristischen Mustern (4B, C). Man beachte, dass die durch Spaltung mit HindIII und NotI des CstF-64-Mutante produziert 424 bp DNA-Fragment,Plasmide auf 4C schwach aufgrund seiner geringen Größe gefärbt. 2 der 6 isolierten Plasmide wurden für die Sequenzierung gesandt. Wir sequenzierten das hEF1α Promotor und CstF-64 oder eine Mutante CstF-64 Teile des Konstrukts, um zu überprüfen, dass es keine Deletionen, Insertionen oder Substitutionen. Wir empfehlen die Sequenzierung der DNA-Konstrukte hieraus resultierenden oder einer PCR-basiertes Protokoll. Die Sequenzierung zeigte, dass eines von jedem Plasmid sequenziert die erwartete Sequenz im Bereich von hEF1α, 3xFLAG-tag und CstF-64 oder eine Mutante CstF-64 enthielt. Jede der anderen Plasmide hatten eine Punktmutation in der Verstärkung des entsprechenden DNA-Fragment eingeführt wird. Expression des Plasmids, welches CstF-64 in embryonale Stammzellen der Maus, hergestellt reichliche Menge an exogenem Protein vergleichbar mit Wildtyp-Expressions 17. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52235/52235fig1highres.jpg" width="450" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der Gibson Assembly-Mechanismus. DNA-Fragmente mit überlappenden Enden wurden isotherm in einem einzigen kontinuierlichen Abfolge zusammengesetzt. Die überlappenden Enden zuerst zurück durch 5&#39;-Exonuclease, die allmählich durch Hitze inaktiviert gekaut. Folglich werden verschiedene DNA-Fragmente mit überlappenden Enden annealen isotherm. DNA-Polymerase wird in die Lücken und thermostabilen DNA-Ligase Ligaten der Kerben zu füllen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52235/52235fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52235/52235fig2highres.jpg" width="650" /> Abbildung 2. (A) Flussdiagramm des Protokolls beschriebenen Montage Klonen. (B) Darstellung der Plasmid pGA-CstF-64 erzeugt unter Verwendung von GA-Kit Red - DNA-Fragmente in der Bindungsreaktion verwendet. PcDNA3.1; hEF1α Promoter Teil 1 (hEF1a - 1); hEF1α Promoter Teil 2 (hEF1a - 2) bestellt als synthetische DNA; Maus CstF-64 (mCstF-64). Blue - offene Leserahmen. Violet - virale und nicht-virale Promotoren. Grün -. Spaltung und Polyadenylierung Regionen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52235/52235fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52235/52235fig3highres.jpg" width="650" /> Abbildung 3: Aufbau des Gibson Montage CstF-64-Plasmid. Schwarz Kästchen stellen die DNA-Fragmente, die für einen einzelnen Gibson Montage CstF-64 in silico Sequenz entwerfen waren. Anschließend wurde die Sequenz in vier DNA-Stücken, die durch PCR amplifiziert wurden aufgeteilt. Beachten Sie, dass aufgrund der geringen Größe des 3xFLAG-Tag die Sequenz als sDNA zusammen mit dem hEF1α pr konzipiert<html> omoter Teil 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52235/52235fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52235/52235fig4highres.jpg" width="650" /> Abbildung 4. PCR der DNA-Fragmente in den Klonen Reaktionen und Vertreter Restriktionsenzymverdau der erhaltenen Plasmide (A) Vertreter PCRs mit heißem starten High-Fidelity-2x Mastermix für die DNA-Fragmente in der Montage Reaktionen eingesetzt:. (B) Vertreter Plasmide hEF1α, in voller Länge CstF-64, pcDNA 3.1-Konstrukt (PGA-CstF-64) und hEF1α, mutierte CstF-64, pcDNA 3.1-Konstrukt (PGA-mutCstF-64) mit NheI und NotI verdaut. (C) die gleichen Plasmide wie in B, gespalten mit HindIII und NotI Enzyme.&quot;_blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Namen von DNA-Fragmenten </td><td> Erwartete Größe (bp) </td><td> Konz. (Ng / ul) </td><td> Verdünnt (ng / ul) </td><td> ul in GA CstF-64 verwendet, von verwässerte </td><td> ul verwendet in GA mutCstF-64, aus verdünnten </td><td> Molverhältnis (Ins: vec) </td></tr><tr><td> pcDNA 3.1 (Vektor) </td><td> 4618 </td><td> 158 </td><td> unverdünnt </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td></td></tr><tr><td> hEF1_ Promoter Teil 1 </td><td> 825 </td><td> 213 </td><td> 75 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 3: 1 </td></tr><tr><td> hEF1_ Promoter Teil 2 für CstF-64 </td><td> 516 </td><td> 229 </td><td> 50 </td><td> 1 </td><td></td><td> 3: 1 </td></tr><tr><td> CstF-64 </td><td> 1796 </td><td> 161 </td><td> unverdünnt </td><td> 1 </td><td></td><td> 3: 1 </td></tr><tr><td> hEF1_ Promoter Teil 2 für die Mutante CstF-64 </td><td> 516 </td><td> 199 </td><td> 50 </td><td></td><td> 1 </td><td> 3: 1 </td></tr><tr><td> Mutante CstF-64 </td><td> 1448 </td><td> 201 </td><td> 171 </td><td></td><td> 1 </td><td> 3: 1 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Ausbeute von DNA-Fragmenten nach der Konzentration auf magnetische Kügelchen, Verdünnung und aus der Montage Reaktionen einstellen.

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Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&amp;#945; Promoter Using Gibson Assembly

Synthesis of custom plasmids is labor and time consuming. This protocol describes the use of Gibson assembly cloning to reduce the work and duration of custom DNA cloning procedure. The protocol described also produces reliable tagged protein constructs for mammalian expression at similar cost to the traditional cut-and-paste DNA cloning.

Erzeugung von Plasmid-Vektoren, die FLAG-markierten Proteine ​​Nach der Verordnung der Menschen Elongation Factor-1α Promoter Mit Gibson Assembly

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized ...

generation-plasmid-vectors-expressing-flag-tagged-proteins-under

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

36.7K Aufrufe.  Texas Tech University Health Sciences Center. Synthesis of custom plasmids is labor and time consuming. This protocol describes the use of Gibson assembly cloning to reduce the work and duration of custom DNA cloning procedure. The protocol described also produces reliable tagged protein constructs for mammalian expression at similar cost to the traditional cut-and-paste DNA cloning. 

Serie: Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit

Plasmid DNA purification from E. coli is a core technique for molecular cloning. Small scale purification (miniprep) from less than 5 ml of bacterial culture is a quick way for clone verification or DNA isolation, followed by further enzymatic reactions (polymerase chain reaction and restriction enzyme digestion). Here, we video-recorded the general procedures of miniprep through the QIAGEN's QIAprep 8 Miniprep Kit, aiming to introducing this highly efficient technique to the general beginners for molecular biology techniques. The whole procedure is based on alkaline lysis of E. coli cells followed by adsorption of DNA onto silica in the presence of high salt. It consists of three steps: 1) preparation and clearing of a bacterial lysate, 2) adsorption of DNA onto the QIAprep membrane, 3) washing and elution of plasmid DNA. All steps are performed without the use of phenol, chloroform, CsCl, ethidium bromide, and without alcohol precipitation. It usually takes less than 2 hours to finish the entire procedure.

Purifying Plasmid-DNA aus Bakterien-Kolonien mit dem Qiagen Miniprep Kit

Plasmid DNA purification from E. coli is a core technique for molecular cloning. Small scale purification (miniprep) from less than 5 ml of bacterial ...

Forschung

Biologie

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign plasmid or ligation product into bacteria. This video protocol describes the traditional method of transformation using commercially available chemically competent bacteria from Genlantis. After a short incubation in ice, a mixture of chemically competent bacteria and DNA is placed at 42&deg;C for 45 seconds (heat shock) and then placed back in ice. SOC media is added and the transformed cells are incubated at 37&deg;C for 30 min with agitation. To be assured of isolating colonies irrespective of transformation efficiency, two quantities of transformed bacteria are plated. This traditional protocol can be used successfully to transform most commercially available competent bacteria. The turbocells from Genlantis can also be used in a novel 3-minute transformation protocol, described in the instruction manual.

Transformation von Plasmid-DNA in E. coli mit dem Hitzeschock-Methode

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

Primäre Kultur und Plasmid Elektroporation der Murine Corti-Organ.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

Generation of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit dem STEMCCA Lentivirusvektor

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the cell is affected by external signals (e.g. drug treatment), or how cells differ between a healthy state and a diseased state. With the advent and continuous refinement of next-generation DNA sequencing technology, RNA-sequencing (RNA-seq) has become an increasingly popular method of transcriptome analysis to catalog all species of transcripts, to determine the transcriptional structure of all expressed genes and to quantify the changing expression levels of the total set of transcripts in a given cell, tissue or organism1,2 . RNA-seq is gradually replacing DNA microarrays as a preferred method for transcriptome analysis because it has the advantages of profiling a complete transcriptome, providing a digital type datum (copy number of any transcript) and not relying on any known genomic sequence3.
Here, we present a complete and detailed protocol to apply RNA-seq to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is based on our recent published study entitled "RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin,"4 in which we successfully performed the first complete transcriptome analysis of human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin using RNA-seq. It yielded unprecedented resources for further experimentation to gain insights into molecular mechanisms underlying thrombin-mediated endothelial dysfunction in the pathogenesis of inflammatory conditions, cancer, diabetes, and coronary heart disease, and provides potential new leads for therapeutic targets to those diseases.
The descriptive text of this protocol is divided into four parts. The first part describes the treatment of human pulmonary microvascular endothelial cells with thrombin and RNA isolation, quality analysis and quantification. The second part describes library construction and sequencing. The third part describes the data analysis. The fourth part describes an RT-PCR validation assay. Representative results of several key steps are displayed. Useful tips or precautions to boost success in key steps are provided in the Discussion section. Although this protocol uses human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin, it can be generalized to profile transcriptomes in both mammalian and non-mammalian cells and in tissues treated with different stimuli or inhibitors, or to compare transcriptomes in cells or tissues between a healthy state and a disease state.

This protocol presents a complete and detailed procedure to apply RNA-seq, a powerful next-generation DNA sequencing technology, to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is generalizable to various cells or tissues affected by different reagents or disease states.

RNA-seq Analyse Transkriptomen Thrombin-behandelt und Control Human Pulmonary mikrovaskulären Endothelzellen

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually untranslated &#8212; first exons. Bcrp1 (Abcg2), the murine orthologue of the ABC transporter Breast Cancer Resistance Protein (BCRP, ABCG2), has at least four alternative promoters that are designated by the corresponding four alternative first exons produced: E1U, E1A, E1B, and E1C. Herein, in-silico protocols are presented to predict alternative promoter usage for Bcrp1. Furthermore, reporter assay methods are described to produce reporter constructs for alternative promoters and to determine the functionality of putative promoters upstream of the alternative first exons that are identified.

With the murine ABC transporter Bcrp1 (Abcg2) as an example, in-silico protocols are presented to detect alternative promoter usage in genes expressed in mouse tissues, and to evaluate the functionality of the alternative promoters identified using reporter assays.

Methoden Alternative Promoter Verwendung und Transkriptions-Verordnung von Murine Bcrp1 zu entdecken

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually ...

Rapid Verification of Terminators Using the pGR-Blue Plasmid and Golden Gate Assembly

The goal of this protocol is to allow for the rapid verification of bioinformatically identified terminators. Further, the plasmid (pGR-Blue) is designed specifically for this protocol and allows for the quantification of terminator efficiency. As a proof of concept, six terminators were bioinformatically identified in the mycobacteriophage Bernal13. Once identified, terminators were then made as oligonucleotides with the appropriate sticky ends and annealed together. Using Golden Gate Assembly (GGA), terminators were then cloned into pGR-Blue. Under visible light, false positive colonies appear blue and positively transformed colonies are white/yellow. After induction of an arabinose inducible promoter (pBad) with arabinose, colony strength can be determined by measuring the ratio of green fluorescent protein (GFP) produced to red fluorescent protein (RFP) produced. With pGR-Blue, the protocol can be completed in as little as three days and is ideal in an educational setting. Additionally, results show that this protocol is useful as a means for understanding in silico predictions of terminator efficiency related to the regulation of transcription.

This protocol utilizes Golden Gate Assembly and the plasmid pGR-blue to rapidly quantify the strength of terminators found in silico.

Schnelle Überprüfung von Terminatoren Mit PGR-Blau Plasmide und Golden Gate Assembly

The goal of this protocol is to allow for the rapid verification of bioinformatically identified terminators. Further, the plasmid (pGR-Blue) is designed ...

CAPRRESI: Chimera Assembly by Plasmid Recovery and Restriction Enzyme Site Insertion

Here, we present chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion (CAPRRESI). CAPRRESI benefits from many strengths of the original plasmid recovery method and introduces restriction enzyme digestion to ease DNA ligation reactions (required for chimera assembly). For this protocol, users clone wildtype genes into the same plasmid (pUC18 or pUC19). After the in silico selection of amino acid sequence regions where chimeras should be assembled, users obtain all the synonym DNA sequences that encode them. Ad hoc Perl scripts enable users to determine all synonym DNA sequences. After this step, another Perl script searches for restriction enzyme sites on all synonym DNA sequences. This in silico analysis is also performed using the ampicillin resistance gene (ampR) found on pUC18/19 plasmids. Users design oligonucleotides inside synonym regions to disrupt wildtype and ampR genes by PCR. After obtaining and purifying complementary DNA fragments, restriction enzyme digestion is accomplished. Chimera assembly is achieved by ligating appropriate complementary DNA fragments. pUC18/19 vectors are selected for CAPRRESI because they offer technical advantages, such as small size (2,686 base pairs), high copy number, advantageous sequencing reaction features, and commercial availability. The usage of restriction enzymes for chimera assembly eliminates the need for DNA polymerases yielding blunt-ended products. CAPRRESI is a fast and low-cost method for fusing protein-coding genes.

Here, we present chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion (CAPRRESI), a protocol based on the insertion of restriction enzyme sites into synonym DNA sequences and functional plasmid recovery. This protocol is a fast and low-cost method for fusing protein-coding genes.

CAPRRESI: Chimären Assembly durch Plasmid Recovery und Restriktion Enzym Site Insertion

Here, we present chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion (CAPRRESI). CAPRRESI benefits from many strengths of the ...

Plant Promoter Analysis: Identification and Characterization of Root Nodule Specific Promoter in the Common Bean

The upstream sequences of gene coding sequences are termed as promoter sequences. Studying the expression patterns of promoters are very significant in understanding the gene regulation and spatiotemporal expression patterns of target genes. On the other hand, it is also critical to establish promoter evaluation tools and genetic transformation techniques that are fast, efficient, and reproducible. In this study, we investigated the spatiotemporal expression pattern of the rhizobial symbiosis-specific nodule inception (NIN) promoter of Phaseolus vulgaris in the transgenic hairy roots. Using plant genome databases and analysis tools we identified, isolated, and cloned the P. vulgaris NIN promoter in a transcriptional fusion to the chimeric reporter &#946;-glucuronidase (GUS) GUS-enhanced::GFP. Further, this protocol describes a rapid and versatile system of genetic transformation in the P. vulgaris using Agrobacterium rhizogenes induced hairy roots. This system generates &#8805;2 cm hairy roots at 10 to 12 days after transformation. Next, we assessed the spatiotemporal expression of NIN promoter in Rhizobium inoculated hairy roots at periodic intervals of post-inoculation. Our results depicted by GUS activity show that the NIN promoter was active during the process of nodulation. Together, the present protocol demonstrates how to identify, isolate, clone, and characterize a plant promoter in the common bean hairy roots. Moreover, this protocol is easy to use in non-specialized laboratories.

Promoter expression analyses are crucial to improving the understanding of gene regulation and the spatiotemporal expression of target genes. Herein we present a protocol to identify, isolate, and clone a plant promoter. Further, we describe the characterization of the nodule-specific promoter in the common bean hairy roots.

Pflanzenanalysen Promoter: Identifizierung und Charakterisierung der Root Knoten bestimmten Promoter in die Gartenbohne

The upstream sequences of gene coding sequences are termed as promoter sequences. Studying the expression patterns of promoters are very significant in ...

Erzeugung von Plasmid-Vektoren, die FLAG-markierten Proteine ​​Nach der Verordnung der Menschen Elongation Factor-1α Promoter Mit Gibson Assembly

Erzeugung von Plasmid-Vektoren, die FLAG-markierten Proteine Nach der Verordnung der Menschen Elongation Factor-1α Promoter Mit Gibson Assembly