Diese Arbeit wurde durch den National Institutes of Health Grant GM118085 und teilweise durch die Robert Welch Foundation (Grant F-1811 an R.M.H.) unterstützt.

1. Isolierung von Suppressormutanten in motilitätsarmen Stämmen
HINWEIS: Verwenden Sie diese Methode als umfassenden "Catch-All", um die allgemeine Art des Motilitätsdefekts zu identifizieren.
<ol><li>Soft-Agar-Plattenzubereitung HINWEIS: Weich-Agar, auch als Motilitäts- oder Schwimm-Agar bezeichnet, ist ein Agar mit niedrigem Prozentsatz (~ 0,2-0,35% w / v), das seit langem zur Untersuchung von Chemotaxis31,32verwendet wird.<ol>
<li>3 g Bacto-Agar (0,3% w/v) und 20 g LB in einen 2 L Rundkolben geben. 1 L ddH2O (doppelt destilliertes Wasser) in denKolbengeben und die Suspension mit einem Rührstab und einer magnetischen Rührplatte gleichmäßig mischen.</li>
		<li>Autoklav für 20 min bei 121 °C.</li>
		<li>Mit der Stange/Platte wie oben beschrieben mit sanftem Rühren abkühlen lassen. Wenn die Temperatur etwa 50 °C erreicht, gießen Sie 25 ml in sterile Petrischalen (100 mm x 15 mm) und lassen Sie das geschmolzene Agar mindestens 1 h lang mit Deckel einstellen, um es innerhalb von 16 h zu verwenden.</li>
	</ol></li>
	<li>Kulturvorbereitung, Impfung und Isolierung von Suppressormutanten HINWEIS: E. coli, die in der Mitte nährstoffreicher Medien geimpft sind, die mit weichem Agar verfestigt sind, verbrauchen Nährstoffe lokal und erzeugen einen Nährstoffgradienten, dem sie folgen. Wenn sie sich nach außen bewegen, erscheinen definierte "Ringe" (Abbildung 1A), die mit bestimmten Chemoattraktantien verwandt sind, auf die die Bakterien reagieren. Defekte im Chemotaxis-System oder in strukturellen Komponenten des Flagellenmotors können die Leistung in diesem Assay beeinträchtigen. Oft entstehen Mutanten mit einem Motilitätsvorteil während des Screenings und können von einzelnen oder von mehreren Punkten entlang der Peripherie des Rings gesehen werden, von wo aus sie "ausflackern"(Abbildung 1C). Man wird feststellen, dass der äußerste Rand der Schwimmfront leicht mit dem unbesiellten jungfräulichen weichen Agar kontrastiert.<ol>
<li>Über Nacht Kulturen des gewünschten motilitätsarmen Stammes in 5 ml Lennoxbrühe (LB; 10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt und 5 g/L NaCl, Materialtabelle)bei horizontalem Schütteln (220 U/a.m) züchten. Am folgenden Tag Subkultur (1:100 Verdünnung) in frischer LB, unter den gleichen Bedingungen bis zur exponentiellen Phase (OD600 von 0,6) wachsend.</li>
		<li>6 μL der Kultur werden mit einer Pipette in die Mitte einer Soft-Agar-Platte (1.1) geimpft und die beladene sterile Spitze in das Agar gedrückt, um den Inhalt vorsichtig auszustoßen. Übergabe auf 30 °C und Inkubation (Abbildung 1B), bis Motilitäts-"Fackeln" sichtbar sind, die vom Impfpunkt oder der Peripherie der Motilitätsringe ausgehen, typischerweise in 24-36 h (Abbildung 1C). HINWEIS: Bei Motilitätstests wird ein Wildtypstamm neben den mutierten Isolaten zum Vergleich geimpft. Dieser Wildtyp-Stamm zeigt die charakteristischen konzentrischen chemotaktischen Ringe (Abbildung 1A) und füllt die Platte innerhalb von 8-10 h.</li>
		<li>Verwenden Sie eine sterile Drahtschlaufe, um die Zellen aus der "Flare" -Region zu heben und einzelne Kolonien auf eine LB-Hartagarplatte zu reinigen (LB wie oben vorbereitet, erstarrt mit 15 g / L Bacto-Agar).</li>
		<li>Wählen Sie einzelne Kolonien mit einer sterilen Drahtschlaufe aus der Streifenplatte und reinigen Sie sie erneut, indem Sie für einzelne Kolonien streifen, um die Isolierung eines "reinen" Kolonieisolats zu gewährleisten.</li>
	</ol></li>
	<li>Bestätigung und Charakterisierung von Suppressormutanten
	<ol>
<li>Vergewissern Sie sich, dass die isolierte(n) Suppressormutante(n) die Motilität wiederhergestellt haben. Bereiten Sie Weichagarplatten (1.1) und Kulturen für interessante Stämme (wie in 1.2.1) vor, einschließlich Wildtyp und des beginnenden "Motilitätsmangel"-Stammes zum Vergleich.</li>
		<li>Die Platten impfen (wie in 1.2.2) und bei 30 °C für 8-10 h inkubieren.</li>
		<li>Zeichnen Sie den Durchmesser des äußersten Rings (Rand des Kreises) auf und vergleichen Sie, um festzustellen, welche der Isolate die Motilität im Wesentlichen wiederhergestellt haben. HINWEIS: Es wird empfohlen, Platten während des gesamten Zeitraums des Experiments zu fotografieren. Für beste Ergebnisse verwenden Sie ein "Eimer Licht" Gerät30, wo eine Digitalkamera über einer Lichtquelle für eine bessere Beleuchtung montiert ist, um den Durchmesser der Schwimmkolonie zu messen und sie von unkolonisiertem Agar zu unterscheiden.</li>
		<li>Die Probanden verifizierten Isolate für WGS nach Bedarf, was eine ausreichende "Sequenzabdeckung" ermöglicht, um die Mutationen, die die Wildtypfunktion wiederherstellten, positiv zu identifizieren.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Quantifizierung des motorischen Verhaltens von Flagellen durch Zellanbindeung
HINWEIS: Verwenden Sie diese Methode, wenn das normale Run-Tumble-Verhalten (Chemotaxis) beeinträchtigt zu sein scheint.
<ol><li>
Kulturvorbereitung und Flagellenscherung
	<ol>
<li>Bereiten Sie eine exponentielle Phasenkultur des interessierenden Stammes vor, wie in Schritt 1.2.1 beschrieben.</li>
		<li>Pellet 10 mL Zellen durch Zentrifugation bei 2.000 x g für 3 min vor dem Wiederauffüllen in 10 mL filtersterilisiertem Motilitätspuffer (MB; 10 mM Kaliumphosphatpuffer [0,0935 MK2HPO4,0,0065 M KH2PO4, pH 7,0], 0,1 mM EDTA [pH 7,0], 10 mM NaCl, 75 mM KCl). HINWEIS: MB unterstützt die Motilität, aber nicht das Bakterienwachstum</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 2.1.2 noch zwei weitere Male, bevor Sie das endgültige Pellet in 1 ml MB erneut verwenden.</li>
		<li>Die Zellsuspension in eine 1-ml-Spritze überführen und am Ende eine 23G-Nadel befestigen. Stellen Sie eine identische Spritze / Nadelvorrichtung zusammen und befestigen Sie die beiden zusammen über 6 Zoll Polyethylenschlauch (Innendurchmesser von 0,58 mm), der fest über jeder Nadelspitze ummantelt ist.</li>
		<li>Scheren Sie die Flagellen (sie sind zerbrechlich und brechen leicht), indem Sie die Zellsuspension sanft von einer Spritze zur anderen 50x hin und her geben, mit 1 Min. Pausen zwischen 10 Durchgängen.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die scherten Zellen bei 2.000 x g für 3 min und resuspendieren Sie in einem Endvolumen von 500 μL MB.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Diavorbereitung und Zellanbindeung
	<ol>
<li>Bereiten Sie eine Zellfixierkammer vor, indem Sie einen 18 mm x 18 mm abdeckungsartigen Abdeckr über einen 3 Zoll x 1 Zoll x 1 mm Glasmikroskopobjektträger stapeln, der durch doppelseitiges Klebeband getrennt ist (Abbildung S1).</li>
		<li>Spülen Sie die Kammer mit 0,01% (w/v) Polylysinlösung, indem Sie sie auf die Oberseite der Kammer auftragen. Neigen Sie den unteren Rand (den Abdeckrbündchen bündig mit dem Objektträger) auf einen Taskwischer (Seidenpapier), um die Lösung durch die Kammer zu ziehen (Abbildung S1). Dann bei Raumtemperatur für 10 min inkubieren.</li>
		<li>Waschen Sie die Kammer dreimal mit 40 μL MB wie in Schritt 2.2.2 beschrieben</li>
		<li>40 μL der scherten Zellsuspension (oben vorbereitet) an die Oberseite der Kammer geben und bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubieren, damit sich die Zellen am Abdeckr anheften können.</li>
		<li>Spülen Sie die Kammer vorsichtig mit 40 μL MB wie in 2.2.3, um nicht befestigte Zellen zu entfernen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aufzeichnung und Quantifizierung der Zellrotation
	<ol>
<li>Übertragen Sie den mit angebundenen Zellen beladenen Objektträger in den Mikroskopstand.</li>
		<li>Scannen Sie die Population mit Hilfe der Phasenkontrastmikroskopie und eines 100-fachen Objektivs nach Zellen, die an Ort und Stelle fixiert sind und sich um eine einzige Achse drehen, d. H. Glatte Rotationen an einem festen Punkt, anstatt sich in einem Winkel zu präsentieren, in dem sich die Zelle in und aus dem Fokus bewegt (Video 1).</li>
		<li>Verwenden Sie ein handelsübliches Mikroskop und die zugehörige Kamera. Öffnen Sie die zugehörige Software, stellen Sie sicher, dass die interessierendsten Zellen im Fokus sind, und klicken Sie auf die Videoaufnahme, um die Zellrotation für eine Minute (bei 10 Bildern pro Sekunde oder höher) aufzuzeichnen.</li>
		<li>Quantifizieren Sie bei der Videowiedergabe die Anzahl der vollständigen Umdrehungen pro Minute und die Häufigkeit, mit der die Zelle die Richtung ändert (Schaltfrequenz). HINWEIS: Rotationsgeschwindigkeiten und Schaltfrequenzen können zu schnell sein, um mit dem Auge gemessen zu werden, daher wird empfohlen, Videosoftware zu verwenden, die eine langsame / feine Wiedergabe bietet, oder ein automatisiertes Softwaresystem zur Quantifizierung von Rotationsmusternverwendet 33. Eine Alternative wäre, die Viskosität des MB mit Methylcellulose (oder einem ähnlichen Mittel) zu erhöhen, um die Rotation schnellerer Bakterien zu verlangsamen und aufzulösen oder zu kompensieren, wenn Kameras mit niedrigen Bildraten verwendet werden.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 2.3.2 mit biologischen Replikaten, um eine Darstellung der interessierenden Population zu erstellen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Vorbereitung von Schwärmen in einem grenzüberschreitenden Assay
HINWEIS: Verwenden Sie diese Methode, um die Auswirkungen einer Mutation oder eines Zustands auf die Gruppenmotilität zu bewerten. Schwarm-Agar bezieht sich auf Agar, bei dem der Prozentsatz typischerweise höher ist als der von Weichem Agar. Bei weichem Agar (0,3 %) schwimmen die Zellen einzeln im Inneren des Agars. Bei Schwarmagar (0,5% und mehr) bewegen sich Zellen als Gruppe auf der Oberfläche. Während Schwarmplatten wie hier beschrieben verwendet werden müssen, haben Schwimmplatten eine längere Haltbarkeit und können mehrere Tage verwendet werden. Unsere persönliche Präferenz ist es, in 1-2 Tagen zu verwenden.
<ol><li>
Zubereitung von Schwarmagar
	<ol>
<li>5 g Eiken-Agar (0,5 % w/v) und 20 g LB in einen 2-L-Rundkolben geben. 1 L ddH 2 O in denKolbengeben und die Suspension mit Rührstab und magnetischer Rührplatte gleichmäßig mischen.</li>
		<li>Autoklav für 20 min bei 121 °C.</li>
		<li>Mit sanftem Rühren abkühlen lassen, um Luftblasen mit der Stange / Platte wie oben beschrieben zu vermeiden. Bei ca. 50 °C filtersterilisierte Glukose für eine Endkonzentration von 0,5 % hinzufügen.</li>
		<li>25 ml in sterile Petrischalen (100 mm x 15 mm) gießen und mindestens 14 h und nicht mehr als 20 h auf Raumtemperatur einstellen lassen. Nicht für die zukünftige Verwendung aufbewahren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Impfung und Inkubation von Schwarmplatten
	<ol>
<li>Impfen Sie 6 μL einer mittel exponentiellen Kultur (vorbereitet wie in 1.2), indem Sie auf dem Agar aufflecken.</li>
		<li>Lassen Sie den Deckel für 5-10 min ab und ersetzen Sie ihn, wenn das Inokum in die Agaroberfläche getrocknet ist.</li>
		<li>Bei 30 °C für 8 h inkubieren. Vermeiden Sie die Versuchung, den Schwarmfortschritt zu überprüfen, indem Sie den Deckel entfernen, da dies zum Trocknen des Agars beiträgt und das Schwärmen beeinträchtigt. HINWEIS: Die Inkubationszeit kann je nach Stammphänotyp variieren. Einige isolierte Mutationen können die Schwarmfähigkeit beeinträchtigen und erfordern einen reduzierten Prozentsatz an Agar oder eine längere Inkubationszeit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Erstellung von grenzüberschreitenden Assay-Platten HINWEIS: Dieser Assay verwendet eine modifizierte Petrischale, bei der eine Kunststoffscheide (Grenze) zwei Kammern anstelle einer erzeugt(Abbildung 2A). Jede Kammer kann unabhängig von der anderen vorbereitet werden und bietet unterschiedliche Bedingungen für das Schwärmen, bevor die beiden "verbunden" werden. Je nach experimentellem Design kann die erste Kammer (links bezeichnet) entweder mit Schwimmagar (0,3% w/v) oder Schwarmagar (0,5% w/v) vorbereitet werden, von wo aus die Bakterien über die Grenze in die rechte Kammer wandern können, die Schwarmagar +/- jede erforderliche Ergänzung oder Herausforderung (z. B. Antibiotika) enthält. Die Migration auf beiden Agaren wird typischerweise gemessen / verglichen, indem der breiteste Durchmesser der Bakterienbesiedlung (von Rand zu Rand) vom ursprünglichen Impfpunkt aufgezeichnet wird.<ol>
<li>Bereiten Sie bei Bedarf Schwimmagar wie in 1.1 beschrieben vor.</li>
		<li>Bereiten Sie Schwarmagar wie in 3.1 beschrieben vor.</li>
		<li>Gießen Sie ~ 30 ml Schwarmagar (bei Bedarf mit gewünschter Ergänzung) in die rechte Kammer einer Petrischale mit zwei Fächern (100 mm x 15 mm), bis zu dem Punkt, an dem sie mit dem Kunststoffteiler zwischen den Kammern gleich ist, aber nicht in die linke überläuft (Abbildung 2B).</li>
		<li>Nachdem das Agar ausgehärtet ist, füllen Sie die linke Kammer mit ~ 30 ml Schwimm- oder Schwarmagar, wieder bis zur Kontaktstelle mit der Kunststoffscheide (Abbildung 2C). Bevor es sich festzieht, ziehen Sie das Agar vorsichtig über den Rand, um die beiden Seiten mit einer ~ 1 mm hohen Agarbrücke zu verbinden, die sich über die gesamte Länge der Trennlinie erstreckt (Abbildung 2D).</li>
		<li>Die Platte bei Raumtemperatur (3.1) trocknen lassen. HINWEIS: Eine alternative Methode zur Herstellung einer Brücke besteht darin, das linke Kammeragar trocknen zu lassen und dann langsam ~ 100 μL geschmolzenes Schwarmagar entlang des Kunststoffteilers zu pipetetten, um die beiden Kammern zu überbrücken (3.4). Impfen Sie die Platten in der linken Kammer wie oben beschrieben für Schwimm- (1.2.2) oder Schwarm-Agar (3.2), bevor Sie bei 30 °C für 12-16 h inkubieren oder bis die Schwärme über der rechten Kammer ausreichende Fortschritte gemacht haben, um Vergleiche zwischen interessierenden Stämmen zu ermöglichen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Die Isolierung und Charakterisierung von Suppressormutationen hat erfolgreich dazu beigetragen, Schlüsselkomponenten des Chemotaxis-Systems35,36,37sowie der Motormaschinen selbst zu identifizieren38,39,40. Bei der Verwendung von Protokoll 1 ist es wichtig, mehrere unabhängige Replikate einzubeziehen, um die Isolierung eines großen Sp...

Bakterien verwenden viele Anhängsel zur Bewegung und Ausbreitung in ihren ökologischenNischen 1. Flagellengetriebene Motilität ist die schnellste von diesen, fördert die Besiedlung günstiger Orte als Reaktion auf Umweltsignale und trägt wesentlich zur pathogenen Fähigkeit einiger Artenbei 2,3. Gegeißelte Bakterien können einzeln in flüssiger Schüttung schwimmen oder als Kollektiv über eine halbfeste Oberflächeschwärmen 4. Extrazelluläre Flagellen haften an und werden von in die Membran eingebetteten Rotationsmotoren angetrieben, die die Kraft der Ionengradienten nutzen, um ein Drehmoment zu erzeugen, das eine Rotation1,2,4,5,6,7,8verursacht . Bei E. coli, deren Motoren mit einem konstanten Drehmoment9laufen , kann die Motorleistung in Bezug auf Drehzahl und Umschaltung des Rotors zwischen gegen den Uhrzeigersinn (CCW) und im Uhrzeigersinn (CW) kategorisiert werden. Die CCW-Rotation fördert die Bildung eines kohärenten Flagellenbündels, das die Zelle vorwärts treibt (Run), während ein transienter Schalter in Rotationsrichtung (CW) dazu führt, dass sich das Bündel entweder teilweise oder vollständig10zerlegt und die Zelle ihre Schwimmrichtung neu ausspricht (Tumble). E. coli laufen typischerweise für eine Sekunde und taumeln für eine Zehntelsekunde. Die Schaltfrequenz des Rotors oder "Tumble Bias" wird durch das Chemotaxis-Signalsystem gesteuert, wobei Transmembran-Chemorezeptoren externe chemische Signale erkennen und über Phosphorelay an den Flagellenmotor übertragen, um Läufe als Reaktion auf Lockstoffe zu verlängern oder sie als Reaktion auf toxische Chemikalien zu unterdrücken11,12. Die Schwimmmotilität wird in 0,3% weichem Agar untersucht.
Während des Schwärmens navigieren Bakterien auf einer halbfesten Oberfläche als dichtes Kollektiv, wo Bakterienpackungen in einer kontinuierlichen Wirbelbewegungströmen 2,13,14,15. E. coli-Schwärme zeigen eine veränderte chemosensorische Physiologie (niedrigere Tumble-Bias), höhere Geschwindigkeiten und eine höhere Toleranz gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen über Zellen, die in flüssiger Schüttung schwimmen16,17. Schwärme unterscheiden sich in der Anwendung einer Vielzahl von Strategien, die die Bewegung unterstützen, einschließlich Tensidproduktion, Hyperflagellation und Zelldehnung2. Schwärmen bietet Bakterien einen Wettbewerbsvorteil sowohl im ökologischen als auch im klinischen Umfeld18,19,20. Es gibt zwei Kategorien von Schwarmbakterien: gemäßigte Schwärme, die nur auf Medien schwärmen können, die mit 0,5-0,8% Agar erstarrt sind, und robuste Schwärmer, die über höhere Agarkonzentrationen navigieren können21.
Es gibt eine Vielzahl von Assays, um die Schwimmmotilität und ihre Regulierung zu untersuchen. Wenn sie durch Mutationen oder Umweltbedingungen beeinträchtigt wird, bietet die Motilität selbst eine starke Auswahl für die Identifizierung von Gain-of-Function-Suppressor-Mutationen. Diese Suppressoren können echte Revertanten der ursprünglichen Mutation oder Pseudo-Revertanten sein, bei denen eine zweite Mutation die Funktionalität wiederherstellt. Solche Mutanten können durch Whole Genome Sequencing (WGS) identifiziert werden. Eine Alternative zur unvoreingenommenen Suppressorauswahl ist eine verzerrte gezielte Mutagenesestrategie (z. B. PCR-Mutagenese). Diese Methoden beleuchten oft die Funktion oder Umweltregulation des Motilitätsapparates. Wenn das Ziel darin besteht, die motorische Funktion zu untersuchen, bedeutet die Wiederherstellung der Wildtyp-Motilität, wie sie in weichem Agar gemessen wird, nicht unbedingt auf die Wiederherstellung der Wildtyp-Motorleistung. Der Cell-Tethering-Assay, bei dem Zellen durch ein einzelnes Flagellum an einer Glasoberfläche befestigt werden und anschließend die Rotation des Zellkörpers überwacht wird, kann der erste Assay der Wahl zur Beurteilung des motorischen Verhaltens sein. Obwohl heute ausgefeiltere Methoden zur Überwachung der Motoreigenschaften zur Verfügung stehen, begrenzen die erforderliche Einrichtung von Hochgeschwindigkeitskameras und die Anwendung von Softwarepaketen für die Bewegungsanalyse ihre weit verbreitete Verwendung22,23,24,25. Der Zell-Tethering-Assay erfordert nur, dass die Flagellen geschert werden, so dass die kurzen Filamente an einem Glasobjektträger anhaften, gefolgt von einer Videoaufzeichnung der Rotation des Zellkörpers. Obwohl die aufgezeichneten Motordrehzahlen in diesem Assay aufgrund der hohen Belastung, die der Zellkörper auf das Flagellum ausübt, niedrig sind, hat dieser Assay dennoch zu wertvollen Erkenntnissen über chemotaktische Reaktionen26,27,28,29beigetragen und bleibt ein gültiges Untersuchungsinstrument, wie unten beschrieben.
Die Schwarmmotilität stellt Forscher vor andere Herausforderungen. Die Auswahl von Gain-of-Function-Suppressoren funktioniert nur in Schwärmen, die reichlich Tenside produzieren und leichtschwärmen 13. Tensid-Nichtproduzenten wie E. coli sind anspruchsvoll in Bezug auf die Wahl des Agars, die Medienzusammensetzung und die Feuchtigkeit der Umgebung2,13,14,21. Sobald die Schwarmbedingungen festgelegt sind, ist der Grenzübergangsassay17 eine nützliche Methode, um die Fähigkeit eines Schwarms zu untersuchen, sich unter neuen/rauen Bedingungen zurechtzufinden. Obwohl sich die unten vorgestellten Protokolle auf E. colibeziehen, können sie leicht für die Anwendung bei anderen Arten angepasst werden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Dehydrated Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0140-15-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-002-786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eiken agar</td>
			<td>Eiken Chemical Co. Japan</td>
			<td>E-MJ00</td>
			<td>Essential for E. coli swarming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose D (+)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>410955000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB (Lennox) Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1427-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine Solution (0.1%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-605-496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSense microscope imaging software (V. 1.6)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Or equivalent software for microscope used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-285-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted microscope slides 3x1x1mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX53 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td>Any upright or inverted phase microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (100 mm diameter)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>For soft-agar assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>9908265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Petri Dish with 2 Compartments</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89200-944</td>
			<td>For border-crossing assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety Hypodermic Needles (23G)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Syringe - 1 mL</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-955-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Task/Tissue wipes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>Or equivalent single use tissue wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR micro cover-glass 18x18mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XM10 camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XM10</td>
			<td>Or equivalent microscope camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating flagella-driven motility in escherichia coli by applying three established techniques in a series

Die Motilität ist entscheidend für das Überleben und den Erfolg vieler Bakterienarten. Es gibt viele Methoden, um die Motilität zu nutzen, um Signalwege zu verstehen, die Funktion und den Aufbau von Flagellenteilen aufzuklären und Bewegungsmuster zu untersuchen und zu verstehen. Hier demonstrieren wir eine Kombination von drei dieser Methoden. Die Motilität in weichem Agar ist die älteste und bietet eine starke Auswahl für die Isolierung von Gain-of-Function-Suppressor-Mutationen in motilitätseingeschränkten Stämmen, bei denen die Motilität durch eine zweite Mutation wiederhergestellt wird. Die Zellanbindetechnik, die zuerst verwendet wurde, um die rotierende Natur des Flagellenmotors zu demonstrieren, kann verwendet werden, um den Einfluss von Signaleffektoren auf die Motordrehzahl und ihre Fähigkeit, die Drehrichtung zu wechseln, zu bewerten. Der "Grenzübertritts"-Assay ist neuer, bei dem schwimmende Bakterien darauf vorbereitet werden können, sich kollektiv als Schwarm zu bewegen. In Kombination stellen diese Protokolle einen systematischen und leistungsfähigen Ansatz dar, um Komponenten der Motilitätsmaschinerie zu identifizieren und ihre Rolle in verschiedenen Facetten des Schwimmens und Schwärmens zu charakterisieren. Sie können leicht angepasst werden, um die Motilität bei anderen Bakterienarten zu untersuchen.

Die Isolierung von Pseudo-Revertanten in einem E. coli-Stamm, dessen Motilität durch hohe Konzentrationen des Signalmoleküls c-di-GMP beeinträchtigt wird, wurde in neueren Arbeiten aus unserem Labor34detailliert beschrieben. Dieser Stamm (JP1442) wies zwei Mutationen auf:Δ yhjH und ΔycgR. YhjH ist die aktivste Phosphodiesterase, die c-di-GMP in E. coliabbaut. Das Fehlen von YhjH führt zu erhöhten c-di-GMP-Spiegeln und einer Hemmung der Motilität. YcgR is...

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Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Viele Bakterien verwenden Flagellen-getriebene Motilität, um ihre Umgebung zu navigieren und eine günstige Umgebung sowohl einzeln als auch als Kollektiv zu besiedeln. Demonstriert wird hier die Verwendung von drei etablierten Methoden, die Die Motilität als Selektionswerkzeug nutzen, um Komponenten / Pfade zu identifizieren, die zur Schwimm- und Schwarmmotilität beitragen.

Untersuchung der Flagellen-getriebenen Motilität in Escherichia coli durch Anwendung von drei etablierten Techniken in einer Serie

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

investigating-flagella-driven-motility-escherichia-coli-applying

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

7.4K Aufrufe.  The University of Texas at Austin. Viele Bakterien verwenden Flagellen-getriebene Motilität, um ihre Umgebung zu navigieren und eine günstige Umgebung sowohl einzeln als auch als Kollektiv zu besiedeln. Demonstriert wird hier die Verwendung von drei etablierten Methoden, die Die Motilität als Selektionswerkzeug nutzen, um Komponenten / Pfade zu identifizieren, die zur Schwimm- und Schwarmmotilität beitragen.

Serie: Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

Ein Assay zur Messung der Aktivität von Escherichia coli Inducible Lysin Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Forschung

Biologie

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch-Clamp-und Perfusion Techniken zur Untersuchung von Ionenkanälen ausgedrückt in Xenopus Oozyten

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

High Throughput Screening von Fungal Endoglucanaseaktivität in Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

Mapping Bakterielle Functional Netzwerke und Pathways in<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Verwendung von Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identifizierung von Protein-Komplexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Mit Sequential Peptide Affinity Purification in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

Protokolle für die Implementierung einer<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Basierend TX-TL Zellfreie Expression System für Synthetische Biologie

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

Erkennung von Live-<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7-Zellen durch PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

Die vielfältigen Vorteile von Protein Co-expression in<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.

Methode zur Kennzeichnung Transkripte in einzelnen Escherichia coli Zellen für Einzelmolekül-Fluoreszenz In Situ Hybridisierung Experimente