Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Herstellung von Mikromuster-Hydrogelen für 2D-Zugkraftmikroskopie-Studien. Dies wird erreicht, indem zuerst eine methacrylierte Glasabdeckung rutscht und die erste Schicht eines Polyacrylamid-Hydrogels darauf gebildet wird. Der zweite Schritt besteht darin, eine weitere Hydrogelschicht mit fluoreszierenden Kügelchen für die Zugkraftmikroskopie zu erzeugen.
Das Hydrogel ist mit einem Mikromuster-Deckmantel darauf eingeklemmt, was zur Übertragung der Mikromustermatrixproteine auf die Hydrogeloberfläche führt. Als nächstes wird das Polyacrylamid-Hydrogel bei Raumtemperatur für 45 Minuten polymerisiert. Der obere Bezugsslip wird dann vorsichtig entfernt.
Fluoreszenzmikroskopische Bildgebung wird verwendet, um das Vorhandensein der Kügelchen und den erfolgreichen Transfer von mikrostrukturierten extrazellulären Matrixproteinen zu zeigen. Diese Methode hilft, mehrere Zugkräfte effizient und präzise zu messen, indem sie das Licht nutzt und die Freisetzung von Zellen nutzt. Ermöglicht es, eine höhere Anzahl experimenteller Beobachtungen aus derselben Probe zu erhalten.
Joel Christian, ein Doktorand aus meinem Labor, wird das Verfahren demonstrieren. Fügen Sie 10 Milliliter doppelt destilliertes Wasser in ein Becherglas hinzu. Danach werden 18,75 Milliliter Essigsäure, 18,75 Milliliter 3-Propylmethacrylat und 252,5 Milliliter Ethanol in die Lösung gegeben.
Wenn die Lösung fertig ist, übertragen Sie sie in eine kristallisierende Schale. Nehmen Sie runde 24-Millimeter-Abdecktücher, reinigen Sie sie mit einem Präzisionswischtuch und legen Sie sie in ein maßgefertigtes Teflon-Rack. Dann tauchen Sie es in die Lösung ein und inkubieren Sie es für 15 Minuten.
Nehmen Sie das Gestell und spülen Sie es mit Ethanol ab. Trocknen Sie die Abdeckung rutscht unter Luftstrom. Methacrylierte Abdeckzettel können bis zu einem Monat bei Raumtemperatur gelagert werden.
Nehmen Sie einen runden 15-Millimeter-Deckzettel und legen Sie ihn auf eine Petrischale. Verwenden Sie einen Diamantstift, um die Oberseite des Deckzettels zu markieren. Fahren Sie dann mit der Reinigung mittels Sauerstoffplasmabehandlung fort.
Der Abdeckschein ist mit 0,4 Millibar und 200 Watt zwei Minuten lang sauber. 100 Mikroliter 0,01% Poly-L-Lysin-Lösung auf die Oberfläche des Deckschlickers pipettieren und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Danach waschen Sie den Bezugsslip mit 10 Millimolar bei einem pH-Wert von 8,5.
Nehmen Sie die überschüssige Flüssigkeit heraus, aber halten Sie die Oberfläche nass. 100 Mikroliter à 50 Milligramm pro Milliliter mPEG-SVA in 10-Millimolar-pH 8,5-Lösung auf die Oberfläche des Deckschlickers pipettieren und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Danach spülen Sie die Abdeckzettel mit einem pH-Wert von 10 Millimolar 8,5 ab.
Dann fügen Sie zwei Mikroliter PLPP-Gel hinzu, gefolgt von 40 Mikroliter Ethanol auf die Oberfläche. Kippen Sie die Petrischale vorsichtig, um die Lösung zu homogenisieren. Warten Sie fünf Minuten, bis die Lösung polarisiert ist.
Legen Sie den Deckel in eine 35-Millimeter-Petrischale mit Bodenloch. Stellen Sie die Petrischale mit dem Deckschein auf das Mikroskoptisch. Stellen Sie den Fokus auf die Oberfläche des Glases ein.
Laden und sperren Sie das vorgezeichnete Muster. Beginnen Sie die Strukturierung mit einer UV-Dosis von 30 Millijoule pro Quadratmillimeter. NachDem Sie den Musterschritt abgeschlossen haben, nehmen Sie den Musterabdeckungsschlupf heraus und spülen Sie die Oberfläche mit PBS ab.
Inkubieren Sie die Probe mit einer 100-Mikroliter-Mischung aus 25 Mikrogramm pro Milliliter Fibronektin und 25 Mikrogramm pro Milliliter Fibrinogen konjugiert mit Alexa 488, gelöst in PBS für eine Stunde bei Raumtemperatur. Um das Hydrogelsubstrat vorzubereiten, beginnen Sie damit, den methacrylierten Deckmantel in eine Petrischale zu geben. Bereiten Sie zunächst eine frische oxidierte AgA-Lösung vor, indem Sie 9,55 Milliliter doppelt destilliertes Wasser in ein 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen geben.
Dann fügen Sie 0,5 Milliliter AgA hinzu. Dann fügen Sie 42 Milligramm Natriummeteolith zur Lösung hinzu. Stellen Sie die Lösung für vier Stunden auf den Shaker.
Bereiten Sie dann die Stammlösung vor, indem Acrylamid, Bisacrylamid und doppelt destilliertes Wasser gemäß Tabelle 1 gemischt werden. Die Stammlösung kann bis zu einem Jahr bei vier Grad Celsius aufbewahrt werden. Bereiten Sie die Arbeitslösung für die unterste Schicht vor, indem Sie 99,3 Mikroliter Stammlösung mit 0,5 Mikrolitern Ammoniumpersulfat 1% und 0,2 Mikroliter TEMED mischen.
Nehmen Sie 10 Mikroliter aus der Lösung und pipettieren Sie tropfenweise auf den methacrylierten Abdeckzettel. Legen Sie vorsichtig einen 15 Millimeter langen runden Deckschein auf den Tröpfchen und warten Sie 45 Minuten, bis er polymerisiert ist. Als nächstes lösen Sie den oberen Abdeckungsslip mit dem Skalpell.
Bereiten Sie dann die Arbeitslösung für die oberste Schicht vor, indem Sie 93,3 Mikroliter Stammlösung mit einem Mikroliter oxidiertem HEA, fünf Mikroliter fluoreszierenden Kügelchen, 0,5 Mikroliter Ammoniumpersulfat 1% und 0,2 Mikroliter TEMED mischen. Nehmen Sie fünf Mikroliter aus der Lösung und pipettieren Sie sie tropfenweise auf das Hydrogel der unteren Schicht. Legen Sie vorsichtig einen Mikromuster-Abdeckungsslip auf das Tröpfchen.
Warten Sie 45 Minuten, bis es polymerisiert ist. Ziehen Sie den Bezugsslip vorsichtig mit einem Skalpell ab. Und kleben Sie den Abdeckungsschlitten auf die Unterseite einer speziell gebohrten Sechs-Well-Platte.
Fügen Sie PBS zu den Bohrlöchern hinzu. Um die Zellen zu sehen, saugen Sie das PBS von der Sechs-Well-Platte ab. Für Fibroblasten fügen Sie DMEM mit hohem Glukosegehalt, das L-Glutamin enthält, hinzu und ergänzen Sie es mit 10% FPS und 1% Penicillin und Streptomycin.
Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5% CO2. Schalten Sie das CO2 und die Heizung für die Mikroskopiestufe ein. Schalten Sie dann das Mikroskop ein und stellen Sie die Brunnenplatte auf die Bühne.
Richten Sie das Beleuchtungsmuster ein und markieren Sie die zellen von interesse. Konzentrieren Sie sich wieder auf die Oberfläche des Hydrogels. Erfassen Sie das Bild der Zellen im Hellfeldkanal.
Um das Bild der Perlen im verformten Zustand aufzunehmen, wechseln Sie zum Kanal. Schalten Sie dann auf den Laserkanal um und beleuchten Sie die Zelle drei Minuten lang nach dem Muster. Dies entspricht einer Dosis von 6.000 Millijoule pro Quadratmillimeter.
Wechseln Sie anschließend den Kanal und erfassen Sie das Bild der Perlen im unverformten Zustand. Um die Zugkräfte zu berechnen, öffnen Sie die fluoreszierenden Perlenbilder, die bereits für die seitliche Drift korrigiert wurden. Die vollständige Analyse der Zugkräfte ist im beigefügten Skript detailliert beschrieben.
Um die selektive Adhäsion von Zellen an den mikrostrukturierten Regionen auf der Hydrogeloberfläche zu überprüfen, wurden Proben mit Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung vormarkierter Matrixproteine und mit Hellfeldmikroskopie zur Visualisierung von Zellen abgebildet. Die mechanischen Eigenschaften von Polyacrylamid-Hydrogelen wurden durch Mischen unterschiedlicher Mengen an Acrylamid und Bisacrylamid variiert. Die Steifigkeit des Hydrogels wurde mit Nanoindentationsexperimenten mittels Rasterkraftmikroskopie bewertet.
Die Zugkraftmessungen wurden durchgeführt, nachdem eine räumliche, zeitlich kontrollierte, ultraviolette Laserstrahlbeleuchtung angewendet wurde, um mikrometergroße Bereiche des Polyacrylamid-Hydrogels selektiv zu beleuchten. Die Zugkräfte wurden unter Verwendung von regularisiertem FTTC mit einem Regularisierungsparameter rekonstruiert, der durch verallgemeinerte Kreuzvalidierung ausgewählt wurde. Unser modularer Modellansatz, der auf der Anziehungskraftmikroskopie in Kombination mit Licht und der Freisetzung von Mikromusterzellen basiert, ist vielseitig und könnte mit anderen Mikroskopie- und Bildgebungs-Setups weiter genutzt werden, um seine Auflösung und Empfindlichkeit zu verbessern.
