The authors would like to thank Dr. George Gittes for advice and expertise throughout this study. SSL was supported by an American Heart Association fellowship (11POST7330002). Further to this SSL and this study was supported by an NIDDK Mentored Research Scientist Development Award (DK096996) and by the Children&#8217;s Hospital of Pittsburgh.

HINWEIS: Die Universität von Pittsburgh Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt alle Experimente. 1. Herstellung von Ultraschall-Mikroinjektion Instrumente und Embryonen <ol><li> Up-Phase, Berg und Sonde (Abbildung 1) sowie chirurgische Instrumente (Abbildung 2) ein. Statt phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) (pH 7,4) in einem 37 ° C Wärmebad. Füllen Mikroinjektionsnadel vollständig mit Mineralöl, mit 1 ml Spritze auf eine zweite flexible 25 G Nadel befestigt, über seine Basis. </li><li> Fix Nadel auf Drehhalterung Arm und leere Nadel des Mineralöllösung. Re-fill mit 2,5 ul TL Lösung. Sicherzustellen, daß keine Luftblasen innerhalb der Injektionsnadel vorhanden sind. Drehen Nadel Arm in Richtung Wand, weg von der Bühne. </li><li> Anesthetize die schwangere Mutter in der Anästhesie Kammer über eine kontinuierliche Infusion von Isofluran. Als Mutter ist bewusstlos, übertragen Sie die Narkose zu Nasenschlauch auf der c positioniertaudal Seite der Bühne und Ort Mutter in Rückenlage mit der Schnauze in Nasenschlauch, eine Fortsetzung einer vollständig betäubt Zustand ermöglichen. </li><li> Band Gliedmaßen in 45 ° Winkel oder mit Händen und Füßen ausgeruht und positioniert overtop ECG / Temperaturwächter Registerkarten. Wichtig ist, dass die schwangere Damm wird kontinuierlich überwacht, um sicherzustellen, dass die Anästhesie reicht und Salbe in angewandter für die Augen, um das Trocknen zu reduzieren. </li><li> Übernehmen Haarentfernung Produkt in Unterleib der Mutter, wischen Sie mit einem trockenen Wattestäbchen, und dann noch einmal mit 70% Ethanol-gesättigte Wattestäbchen, um überschüssiges Produkt und Haare zu entfernen. Achten Sie darauf, um Bauchhaut sauber aus aller Haare an der Stelle der Inzision (Abbildung 3). </li><li> Führen Sie eine Laparotomie auf der schwangeren Mutter mit feinen chirurgischen Pinzette und Schere. Achten Sie darauf, um zu vermeiden, schneiden keine großen Gefäße oder inneren Organen. Stellen Sie zuerst, gerade Schnittführung der Epidermis 1,5-2 cm über Vagina und weiter in Richtung Rippen für approximat geschnittenely 2-3 cm. Setzen Sie das Unterhautmembran, suchen Sie die Linea alba (&quot;weiße Linie&quot;) (Abbildung 3) und parallel zur anfänglichen Schnitt geschnitten, entlang der gleichen Länge, zu entlarven interne Eingeweide und Gebärmutter Säckchen. </li></ol> 2. Gewinnung von Embryonen <ol><li> Verwenden Sie 6-Zoll-Wattestäbchen, um Mutter und Embryonen zu manövrieren. Drücken Sie vorsichtig (nicht mit Gewalt) auf der Haut mit Applikator zum ersten Embryo aus Schnitt Öffnung manipulieren. Nach der Extraktion der ersten Embryo Sacculus, langsam und vorsichtig ziehen Sie den Rest der Uterushorn durch und auf Außen der Mutter. Vermeiden Sie es, Darm und andere Organe durch Einschnitt in dieser Phase. </li><li> Quantifizieren Embryonen und schonend zu platzieren linken Uterushorn wieder in die Mutter. Dann beginnen Platzierung der rechten Uterushorn wieder in die Mutter mit dem Embryo Sacculus weitesten von der Scheide auf dem Horn und nach unten bewegt. Setzen Sie diesen, bis nur noch zwei Embryonen bleiben ausgesetzt (FiAbbildung 4). Schließlich Position Embryonen in einer Säule über und parallel zur Schnittführung, wird bewusst nicht abzuschneiden Gebärmutterblutung. </li><li> Zeigen Mauerziegel und Position zwischen Armen und Körper sowie Beine und Schwanz. Stellen Sie sicher, dass die Ton-Oberflächen sind etwa in Höhe Laparotomieschnitts. Befeuchten Sie die gefenstert Petrischale mit 37 ° C PBS. </li><li> Fassen Erweiterung Zange mit der rechten Hand und gefenstert Petrischale mit der linken Hand (Fenster parallel Embryonen), und bringen geschlossenen Pinzette ~ 5 cm durch Fenster, von der Spitze der Petrischale. Offene Zange komplett ohne zu reißen Fenstergitter. </li><li> Manövrieren Sie die Hände über Embryonen und konzentrieren Blick auf die beiden Embryo Säckchen. Ohne (oder leicht) berühren Säckchen mit Fenster Vernetzung oder Zangen, schieben Sie sie durch den Schlitz und legen Petrischale auf Bauch der Mutter. Mit einer Pinzette noch erweitert, manipulieren gefenstert Mesh, um es auf beiden Seiten und am Boden jeder Embryo zu setzen (Abbildung 5 </strong&gt;) und aus der Schlitzöffnung ziehen Pinzette. </li><li> Als nächstes legen blauen Gummi Umfassungswand in Petrischale, ohne zu drücken oder zu verletzen Embryonen (Abbildung 6). Stellen Sie sicher, Mauerziegel fest Ausgleich Petrischale, Embryo und kautschukhaltige Wand. Schließlich füllen Petrischale mit 37 ° C PBS bis Embryonen vollständig eingetaucht ist (Abbildung 6), bei der Kontrolle auf Dichtheit bei gefenstert Vernetzung. </li></ol> 3. Injektionsverfahren <ol><li> Niederinjektionsstufe mit Mutter und Embryonen nach unten mit Z-Ebene Einstellknopf (Bild 1) und drehen Injektionsnadel und montieren Arm und richten Sie direkt mit Ultraschallsonde, mit Nadel ½ cm nach links und unter der Sondenspitze (Abbildung 7) . Schieben nadel Arm (nicht Nadel) 45 ° von der Sonde. Darauf achten, dass die Spitze der Nadel mit der Schale oder Ultraschallsonde getroffen. </li><li> Heben Injektionsstufe zurück zur ursprünglichen Höhe, mit Ultraschall pBademantel direkt über Embryonen Probe muss leicht eingetaucht werden und innerhalb von 3-4 mm der embryonalem Gewebe. Verwenden Sie X &amp; Y-Tisch Einstellknöpfe (Abbildung 8), um den Embryo / Mutter / Tischposition systematisch suchen Sie das Schlagen embryonalen Herzen ändern. </li><li> Direkt Zentrum von Ultraschall-Bildschirm beobachten ein schwarzes Zentrum Zielmarkierung gezeichnet (*). Suchen linken Herzkammer (empfohlen) oder den Vorhof über die Bühne Einstellknöpfe X &amp; Y (Bild 8) und dann nach oben oder unten die Bühne mit Drehknopf auf der Bühne, um Einspritzziel genau über der schwarzen Mittelmarkierung auf dem Ultraschallbildschirm zu positionieren. </li><li> Verwenden Sie X Bühne Einstellknopf, um Embryos nach rechts zu bewegen, aus der Ultraschall-Bildschirm. Repositionieren Mikroinjektionsnadel und wieder an seinen Platz zu bewaffnen, ½ cm von 90 ° zu der Ultraschallsonde (7). </li><li> Mit Hilfe der Mikroinjektion montieren Einstellknöpfe (9C-G), Position Nadel mit der Spitze deutlich almit der Mittenmarkierung igned. Einstellen Injektionswinkel (mit Noppen in 9C &amp; EG), und X, Y und Z Vektoren Mikronadel sicherzustellen Nadelspitze in der richtigen Ebene fokussiert. Einfahren Mikroinjektionsnadel mit ausschließlich den &quot;Einspritzen&quot; Knopf (9F), darauf achten, nicht zu anderen Dimensionen anzupassen. </li><li> Auch ausschließlicher Verwendung des X Feineinstellung der Bühne Knopf bewegen Embryo wieder unter die Sonde mit Ziel genau auf dem Mittelpunkt auf dem Ultraschallbildschirm. Sicherzustellen, dass die linke Herzkammer ist nun genau auf der gleichen X, Y und Z-Ebene. </li><li> Als nächstes wird mit nur der &quot;Injektion&quot; Knopfes auf der Mikroinjektion zu montieren, langsam stechen Embryo mit der Mikroinjektionsnadel und allmählich Spitze in die linke Herzkammer zu bringen. Injizieren Sie den vollen 2,5 ul TL-Lösung in die linke Herzkammer oder, bis die Leermeldung ertönt ein Signalton, indem &quot;leer&quot; und tippen Sie &quot;füllen&quot; einmal (2A &amp; B). Zu diesem ZeitpunktInjektions beobachten einen Schatten von der Spitze der Nadel, die der TL Eintritt in die Herzkammer (10) ist ausgeht. In umgekehrter Richtung, schnell zurückzuziehen Mikroinjektionsnadel Drehen des &quot;Einspritzen&quot; Knopf (9F) auf der Mikroinjektion zu montieren, wenn die Einspritzung abgeschlossen ist. </li><li> Weiter geht es zum nächsten Embryo und wiederholen Sie den Vorgang für die restlichen Embryonen nach dieser Reihe von Schritten, anschließend noch die letzten Embryonen wieder in der Mutterleib. Schalten Narkose Kammer Box und sanft bewegen Mutter hier für 15 Minuten vom Zeitpunkt der letzten Injektion. </li></ol> 4. Ernten Embryonen und Analyse <ol><li> Sacrifice Damm über Genickbruch. Erweitern Sie den Laparotomieschnitts leicht zu entfernen Uterushörner von der Mutter. Halten Sie die Embryonen im Uterus-sac. Zeigen Embryonen in PBS gekühlt. </li><li> Sezieren Embryonen aus Gebärmuttersack (ggf. sammeln Gewebe für die Genotypisierung) und setzen Sie die gesamte Embryo in 4% Paraformaldehyd (PFA) über Nacht, dann in 30% Saccharose über Nacht gefrier in Kryostaten Schnitt Medium. Dann schneiden Sie die Kryoschnitt und legen Sie sie auf Objektträger für die immunhistochemische Analyse. Optional können Gewebe für ganze Montage durch Dehydratisierung in 100% Methanol, nach Fixierung in 4% PFA. </li><li> Für immunhistochemische Analyse legen Sie die Gefrierschnitte in PBS, um die OCT entfernen. Dann blockieren die Schnitte mit 10% normalem Eselserum für 30 min. Dann fügen Sie PECAM primären Antikörper bei 1: 100 Verdünnung über Nacht bei 4 ° C. Am nächsten Tag, waschen Sie die Folien in PBT 3 mal für 10 Minuten jeweils, und fügen Sie Esel-anti Ratte 594 sekundäre und Inkubation für 1 h bei RT. Anmerkung: Dies ist eine sehr anspruchsvolle Technik zur Optimierung und Koordinierung von Ultraschall und Mikroinjektion erfordern. Es gibt eine sehr steile Lernkurve, um diese Technik verwandt und benötigt vier bis sechs Wochen von Mentor-Injektionen vor wird man kompetent. </li></ol>

<ol>
	<li>Abrahamson, D. R., Robert, B., Hyink, D. P., St John, P. L., Daniel, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+formation+of+microvasculature+in+the+developing+kidney.">Origins and formation of microvasculature in the developing kidney.</a> Kidney international. Supplement. 67, S7-S11 (1998).</li><li>Sims-Lucas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Progenitors+Exist+within+the+Kidney+and+Lung+Mesenchyme.">Endothelial Progenitors Exist within the Kidney and Lung Mesenchyme.</a> PloS one. 8 (6), e65993 (2013).</li><li>Dressler, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+early+kidney+specification,+development+and+patterning.">Advances in early kidney specification, development and patterning.</a> Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).</li><li>Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+controls+and+cellular+behaviors+in+branching+morphogenesis+of+the+renal+collecting+system.">Genetic controls and cellular behaviors in branching morphogenesis of the renal collecting system.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (5), 693-713 (2012).</li><li>Costantini, F., Kopan , R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+a+complex+organ:+branching+morphogenesis+and+nephron+segmentation+in+kidney+development.">Patterning a complex organ: branching morphogenesis and nephron segmentation in kidney development.</a> Dev Cell. 18 (5), 698-712 (2010).</li><li>Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-epithelial+crosstalk+regulates+kidney+progenitor+cell+differentiation.">Stromal-epithelial crosstalk regulates kidney progenitor cell differentiation.</a> Nat Cell Biol. 15 (9), 1035-1044 (2013).</li><li>Rymer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+blood+flow+and+oxygenation+drive+nephron+progenitor+differentiation.">Renal blood flow and oxygenation drive nephron progenitor differentiation.</a> Am J Physiol Renal Physiol. , (2014).</li><li>Shah, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+mouse+blood+flow+and+oxygen+correlate+with+early+pancreatic+differentiation.">Embryonic mouse blood flow and oxygen correlate with early pancreatic differentiation.</a> Developmental biology. 349 (2), 342-349 (2011).</li><li>Andres, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphB4+receptor+tyrosine+kinase+transgenic+mice+develop+glomerulopathies+reminiscent+of+aglomerular+vascular+shunts.">EphB4 receptor tyrosine kinase transgenic mice develop glomerulopathies reminiscent of aglomerular vascular shunts.</a> Mech Dev. 120 (4), 511-516 (2003).</li><li>Wagner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+kidney+vascular+corrosion+casts+with+Nano-CT.">High-resolution imaging of kidney vascular corrosion casts with Nano-CT.</a> Microsc Microanal. 17 (2), 215-219 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Mikroinjektionsanästhesie und Zeitrahmen Im Hinblick auf die Betäubung der Mutter, ist es wichtig, um den Luftstrom konstant (2-3 l / min) und bei niedrigen PSI halten. Die Strömung des Beruhigungs muß bei etwa 1,75-2 L / min gehalten werden. Gleichzeitig müssen Zeitrahmen, in dem die Injektionen erfolgen genau beobachtet und mit jedem Wurf gesteuert werden. Für jeden Wurf sollte das Injektionsverfahren unter 45 Minuten gehalten werden. Die Bedeutung dieser Frist ist ausschlaggebend f?...

Während der Embryonalentwicklung zwei diskrete, aber gleichzeitigen, vaskuläre Prozesse ab: Angiogenese, der Prozess, bei dem ein Schiff wächst aus einem großen bereits vorhandenen Behälter und Vaskulogenese, die eine Neubildung von Gefäßen aus Wohn endothelialen Vorläuferzellen 1,2 ist. Beziehungsweise die erstere auch mit dem Blutfluss, während die letzteren wird angenommen, dass in Abwesenheit von weitgehend übernehmen. Parallel zur Bildung von Blutgefäßen, beginnt ein zyklischer und dynamischer Prozess von Nierenvorläuferzellen Synthese, Proliferation und Differenzierung der embryonalen Tag 9.5 (E9.5) zu entfalten. An diesem Punkt der Ureterknospe (UB) dringt dorsal in das umgebende Mesenchym metanephrischen (MM), und wird fortgesetzt, bis der Geburt 3. Wiederholtes Verzweigung des UB in schnell Kondensieren metanephrischen Kappe Mesenchym beginnt somit die Bildung der funktionellen Einheiten der Niere, Nephron. Mit jeder neuen Generation von UB und nephron, werden die älteren Generationen in inneren kortikalen und medullären Regionen, in denen sie dann weitere Reifung und Differenzierung in erster Linie Gefäßreichen Umgebungen zu unterziehen verdrängt. Wie von Dressler et al. 3 hervorgeht, wird diese embryoProzess durch eine induktive Signalfällt, wie Übersprechen zwischen UB und M, und eine Vielzahl von extrazellulären Faktoren 3-6. Zwei vor kurzem untersuchten extrazellulären Faktoren innerhalb des Entwicklungs Bauchspeicheldrüse und Nieren gehören Sauerstoffdruck und Blutfluss 7,8. Letzteres wird in weiteren Einzelheiten nachstehend mit Bezug auf die Nierenentwicklung diskutiert. Um die induktive Rolle, Blutfluß potentiell spielt in Nephron Vorläuferzelldifferenzierung, sowie in anderen Organprozessen präzise und genaue Methoden der embryonalen Blutfluß Mapping belichten ist zwingend erforderlich. Alternative Methoden zur Messung des Blutflusses sind die Verschreibung von ultrasound Bildgebung und Harz wirft 9,10. Abschließend diese Modi wurde gezeigt, dass von Natur aus fehlen in ihrer Fähigkeit, gleichzeitig zu enthüllen zeitlichen und räumlichen Nebeneinander zwischen den Blutfluss und der Stammzelldifferenzierung. Harzabgüsse zum Beispiel geben Sie eine gültige Modell des Schiffes Strukturierung in adulten Geweben jedoch in unreifen Gefäße, wie zum Beispiel mit embryonalen Zeitpunkten, sind Gefäße stark unterentwickelt und undicht. Daher wirft Harz nicht innerhalb der winzigen, oft porös, Schiffe zu halten. Für diese offensichtliche Hindernisse, unter anderem, haben wir beschlossen, ultraschallgeführte in vivo intrakardiale embryonalen Tomaten Lektin (TL) Mikroinjektionen in unseren Untersuchungen der Nierenentwicklung zu integrieren. In diesem Verfahren verwenden wir eine Ultraschallsonde zum synchronen Führen eines montierten Mikro Nadel mit 2,5 ul TL Lösung gefüllt ist, in den linken Ventrikel von Mausembryonen an E11.5, E13.5, E15.5 und E17.5 Zeitpunkten. E17.5 Ist die letzte Entwicklungsalter, wenn die Nadeln sind nicht stark genug, um den weiter entwickelten Embryo eindringt. Die Vorteile dieser Methode der Mikroinjektion sind reichlich vorhanden. Ultraschall-gesteuerte Mikroinjektion ermöglicht präzise Positionierung einer Injektionsnadel in der embryonalen linken Herzkammer, passive und kontrollierte Vertreibung der Lösung in das schlagende Herz des Tieres, minimale Schäden an Herz und das umgebende Gewebe und die Vermeidung des plötzlichen Herzstillstand und Tod des Embryo vor der Ganzkörper-Durchblutung. Mit der Verwendung eines FITC-markierten TL wird jede perfundiert Vaskulatur der Marker entlang ihrer endothelialen apikalen Membran aufrechtzuerhalten. In Kombination mit Immunohistochemie unter Verwendung von PECAM (CD31, Platelet endothelial cell adhesion molecule) und verschiedene andere vaskuläre Marker sind wir in der Lage, klar zwischen perfundiert und un-durchbluteten Gefäße sowie charakterisieren anyaberrant Färbung der umgebenden Gewebe.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="981">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:292px;">Company</td>
			<td style="width:164px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:225px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>022M4004V</td>
			<td>concentration 1:5000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pecam</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553370</td>
			<td>concentration 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FITC-Tomato Lectin</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>FL-1321</td>
			<td>concentration 2.5&#181;L / embryo</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat )</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>712-585-150</td>
			<td>concentration 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjection Needle</td>
			<td>Origio Mid Atlantic Devices</td>
			<td>C060609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mineral Oil</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">BP26291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mL syringe</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">03-377-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;Clay Blocks</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">HR4-326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical Tape</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">18-999-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">NC9763655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hair Removal Product</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">NC0132811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical Scissors</td>
			<td style="width:292px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:164px;">14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:292px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:164px;">11064-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;Surgical Marking Pen</td>
			<td style="width:292px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:164px;">18000-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;Right angle forceps (for hysterectomy)</td>
			<td style="width:292px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:164px;">11151-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in utero intra-cardiac tomato-lectin injections on mouse embryos to gauge renal blood flow

Die Bildung und die Durchblutung der Entwicklung von Nierenblutgefäße (abgesehen von Glomeruli) stark under. Als Gefäßsystem entwickelt über Angiogenese und Vaskulogenese (De-novo-Gefäßbildung), Perfusion Abbildungsverfahren wie Harzabgüsse, In-vivo-Ultraschallbildgebung und Mikrodissektion haben beim Nachweis der intimen Beziehungen zwischen beschränkt (das ist die Abzweigung der großen Gefäße ist) diese beiden Prozesse und Entwicklung von Nierenstrukturen im Embryo. Hier beschreiben wir das Verfahren der in utero intrakardialen Ultraschall-geführte FITC-markiertem Lektin Tomatenmikroinjektionen auf Mausembryonen, die Ontogenese der Nierendurchblutung zu messen. Tomaten-Lektin (TL) wurde während des gesamten Embryos und Nieren geerntet perfundiert. Nephron Vorfahren, Nephronstrukturen, Harnleiter Epithel und Gefäßsystem: für unterschiedliche Nierenstrukturen einschließlich Gewebe wurden zusammen gefärbt. Schon ab E13.5 großkalibrige Gefäße durchblutet jedoch PeripherieSchiffe blieb unperfused. Durch E15.5 und E17.5, kleinen peripheren Gefäße sowie Glomeruli begonnen, durchströmt wird. Dieses experimentelle Verfahren ist für die Untersuchung der Rolle der Vaskulatur und den Blutfluss während der embryonalen Entwicklung.

Gefäßbildung vorausgeht Fluss in Entwicklung von Nieren Ein Großteil der embryonalem Gewebe (einschließlich der Niere) enthält eine dichte Gefäß (beide unperfused und durchströmt), auch in frühen embryonalen Zeitpunkten. Um besseres Maß und Analyse des Blutflusses in der Entwicklung von Nieren wir verwendeten eine Methode der in utero embryonalen intraMikroInjektionen. Mit der Verwendung eines hochauflösenden Ultraschall die embryonalen Herzens bei E11.5 durch E17.5 identifizieren...

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In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

In Utero Intraherz Tomato Lektin-Injektionen auf Maus Embryonen zu Nierendurchblutung Messer

The formation and perfusion of developing renal blood vessels (apart from glomeruli) are greatly understudied. As vasculature develops via angiogenesis ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

9.6K Aufrufe.  Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC. This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

Serie: In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted applications, facilitate the detection and measure of vascular biomarkers at the molecular level. Within the mouse embryo, this noninvasive technique may be used to uncover basic mechanisms underlying vascular development in the early mouse circulatory system and in genetic models of cardiovascular disease. The mouse embryo also presents as an excellent model for studying the adhesion of microbubbles to angiogenic targets (including vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) or &#945;v&#946;3) and for assessing the quantitative nature of molecular ultrasound. We therefore developed a method to introduce ultrasound contrast agents into the vasculature of living, isolated embryos. This allows freedom in terms of injection control and positioning, reproducibility of the imaging plane without obstruction and motion, and simplified image analysis and quantification. Late gestational stage (embryonic day (E)16.6 and E17.5) murine embryos were isolated from the uterus, gently exteriorized from the yolk sac and microbubble contrast agents were injected into veins accessible on the chorionic surface of the placental disc. Nonlinear contrast ultrasound imaging was then employed to collect a number of basic perfusion parameters (peak enhancement, wash-in rate and time to peak) and quantify targeted microbubble binding in an endoglin mouse model. We show the successful circulation of microbubbles within living embryos and the utility of this approach in characterizing embryonic vasculature and microbubble behavior.

Here, we present a protocol to inject ultrasound microbubble contrast agents into living, isolated late-gestation stage murine embryos. This method enables the study of perfusion parameters and of vascular molecular markers within the embryo using contrast-enhanced high-frequency ultrasound imaging.

Contrast Imaging in Maus Embryonen Verwendung von Hochfrequenz-Ultraschall

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

Ex Utero Elektroporation und Organotypischen Kultur der Maus Hippocampus-Gewebe

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

Quantitative Analyse der Proteinexpression zu studieren Lineage Spezifikation in Maus Präimplantationsembryonen

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Verlust- und Gewinn-of-function-Ansatz Frühe Zellschicksal Bestimmungsfaktoren in Preimplantation Maus Embryonen zur Untersuchung

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of the cell and often consist of multiple functional domains, which can be influenced by posttranslational modifications. The depletion of the entire protein in conditional or constitutive knock-out (KO) mice does not take into account this functional diversity and regulation. An mESC line and a derived mouse model, in which a docking site for FLPe recombination-mediated cassette exchange (RMCE) was inserted within the ROSA26 (R26) locus, was previously reported. Here, we report on a structure-function approach that allows for molecular dissection of the different functionalities of a multidomain protein. To this end, RMCE-compatible mice must be crossed with KO mice and then RMCE-compatible KO mESCs must be isolated. Next, a panel of putative rescue constructs can be introduced into the R26 locus via RMCE targeting. The candidate rescue cDNAs can be easily inserted between RMCE sites of the targeting vector using recombination cloning. Next, KO mESCs are transfected with the targeting vector in combination with an FLPe recombinase expression plasmid. RMCE reactivates the promoter-less neomycin-resistance gene in the ROSA26 docking sites and allows for the selection of the correct targeting event. In this way, high targeting efficiencies close to 100% are obtained, allowing for insertion of multiple putative rescue constructs in a semi-high throughput manner. Finally, a multitude of R26-driven rescue constructs can be tested for their ability to rescue the phenotype that was observed in parental KO mESCs. We present a proof-of-principle structure-function study in p120 catenin (p120ctn) KO mESCs using endoderm differentiation in embryoid bodies (EBs) as the phenotypic readout. This approach enables the identification of important domains, putative downstream pathways, and disease-relevant point mutations that underlie KO phenotypes for a given protein.

Proteins often contain multiple domains that can exert different cellular functions. Gene knock-outs (KO) do not consider this functional diversity. Here, we report a recombination-mediated cassette exchange (RMCE)-based structure-function approach in KO embryonic stem cells that allows for the molecular dissection of various functional domains or variants of a protein.

Struktur-Funktions-Studien in embryonalen Maus-Stammzellen Rekombinase-vermittelten Kassettenaustausch

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

Visualisierung der Knoten und Notochordal Platte In Gastrulating Maus-Embryonen mittels Rasterelektronenmikroskopie und ganze Mount Immunfluoreszenz

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by Sertoli cell junctions at the blood-testis barrier (BTB), which is the tightest tissue barrier in the mammalian body and segregates the seminiferous epithelium into two compartments, a basal and an adluminal. The BTB creates a unique microenvironment for germ cells in meiosis I/II and for the development of postmeiotic spermatids into spermatozoa via spermiogenesis. Here, we describe a reliable assay to monitor BTB integrity of mouse testis in vivo. An intact BTB blocks the diffusion of FITC-conjugated inulin from the basal to the apical compartment of the seminiferous tubules. This technique is suitable for studying gene candidates, viruses, or environmental toxicants that may affect BTB function or integrity, with an easy procedure and a minimal requirement of surgical skills compared to alternative methods.

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Here, we present a protocol to assess the blood-testis barrier integrity by injecting inulin-FITC into testes. This is an efficient in vivo method to study blood-testis barrier integrity that can be compromised by genetic and environmental elements.

Eine In-Vivo -Methode, um die Maus Blut-Hoden-Schranke Integrität zu studieren

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational health hazard. Here, we demonstrate the exposure of primary stem cells from the mouse ocular surface to UV-C radiation. Reactive oxygen species (ROS) formation is the readout of the extent of oxidative stress/damage. In an experimental in vitro setting, it is also essential to assess the percentage of dead cells generated due to oxidative stress. In this article, we will demonstrate the 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) staining of UV-C exposed mouse primary ocular surface stem cells and their quantification based on the fluorescent images of DCFDA staining. DCFDA staining directly corresponds to ROS generation. We also demonstrate the quantification of dead and live cells by simultaneous staining with propidium iodide (PI) and Hoechst 3332 respectively and the percentage of DCFDA (ROS positive) and PI positive cells.

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

This protocol demonstrates the simultaneous detection of reactive oxygen species (ROS), live cells, and dead cells in live primary cultures from mouse ocular surface cells. 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodide, and Hoechst staining are used to assess the ROS, dead cells, and live cells, respectively, followed by imaging and analysis.

Bewertung von oxidativen Schäden in den primären Maus-Augen-Oberflächenzellen/Stammzellen als Reaktion auf Uv-C-Schäden (UV-C)

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

Ganz-Mount-In-Situ-Hybridisierung in Zebrafisch-Embryonen und Tube-Formations-Assay in iPSC-ECs zur Untersuchung der Rolle von Endoglin in der Gefäßentwicklung

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). This is a critical process that occurs throughout the lifespan of organisms, and disruption of the molecular pathways involved during embryogenesis can have catastrophic long-term consequences. For a multitude of reasons, zebrafish (Danio rerio) has become a model organism to study hematopoiesis. Zebrafish embryos develop externally, and by 7 days postfertilization (dpf) have produced most of the subtypes of definitive blood cells that will persist for their lifetime. Assays to assess the number of hematopoietic cells have been developed, mainly utilizing specific histological stains, in situ hybridization techniques, and microscopy of transgenic animals that utilize blood cell-specific promoters driving the expression of fluorescent proteins. However, most staining assays and in situ hybridization techniques do not accurately quantitate the number of blood cells present; only large differences in cell numbers are easily visualized. Utilizing transgenic animals and analyzing individuals with fluorescent or confocal microscopy can be performed, but the quantitation of these assays relies on either counting manually or utilizing expensive imaging software, both of which can make errors. Development of additional methods to assess blood cell numbers would be economical, faster, and could even be automated to quickly assess the effect of CRISPR-mediated genetic modification, morpholino-mediated transcript reduction, and the effect of drug compounds that affect hematopoiesis on a large scale. This novel assay to quantitate blood cells is performed by dissociating whole zebrafish embryos and analyzing the amount of fluorescently labelled blood cells present. These assays should allow elucidation of molecular pathways responsible for blood cell generation, expansion, and regulation during embryogenesis, which will allow researchers to further discover novel factors altered during blood diseases, as well as pathways essential during the evolution of vertebrate hematopoiesis.

This assay is a simple method to quantitate hematopoietic cells in developing embryonic zebrafish. Blood cells from dissociated zebrafish are subjected to flow cytometry analysis. This allows the detection of blood defects in mutant animals and after genetic modification.

Verwendung der Durchflusszytometrie zum Erkennen und Quantitieren veränderter Blutbildung in den sich entwickelnden Zebrafischen

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells ...