Diese Arbeit wurde durch Mittel aus Midwestern University College of Health Sciences Research Facilitation Grant EEH und Midwestern University Office of Research und Sponsored Programme Intramural Grant KJL verliehen unterstützt.

Dieses Protokoll entspricht den AVMA Tierschutzgrundsätze für die Pflege und Verwendung von Labortieren und wurde von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) an Midwestern University zugelassen. 1. Vorbereitung der Anästhesie, Ausstattung, &amp; Medien <ol><li> Entchloren ca. 1,5 l Leitungswasser entweder mit einem kommerziellen Entchlorungsmittel (erhältlich in Zoohandlungen) oder durch stehendes Wasser für 24 Stunden. Wenn Sie drei 1 l Becher und füllen jeweils mit 500 ml entchlortes Wasser. Beschriften Sie eine für das Halten von Fisch vor jedem Verfahren und eine für die Wiederherstellung. Zum dritten Becherglas 100 ug / ml Tricaine Methansulfonat; dies wird das Becherglas, in dem Fische betäubt werden. </li><li> Füllen Sie eine flache Schale mit Eis, warm das Kulturmedium (RPMI 1640, 10% FBS (fötales Rinderserum), 50 ug / ml Gentamycin, 100 ug / ml Kanamycin, 25 mM HEPES) auf RT und sammeln Pinzette sauber Juwelier. Saubere Pinzette durch immersingen die Tipps in 70% Ethanol und durch einen Bunsenbrenner, so dass das Ethanol zu verbrennen. </li><li> Entscheiden Sie, ob das Verfahren wird ohne Vergrößerung mit 2 durchgeführt werden, mit einem handelsüblichen, auf dem Tisch beleuchtete Lupe - 10-facher Vergrößerung oder Binokular (völlig abhängig von persönlicher Vorliebe). </li></ol> 2. Stellen Sie Explantatkulturen <ol><li> Fangen Sie die gewünschte Anzahl von Fischen und in einen Haltebecher. Übertragen einer einzigen Fisch auf die Anästhesie-Becher; ist es am besten, um Fische einzeln zu betäuben. </li><li> Überwachen Sie die Auswirkungen der Narkose durch Beobachtung der Schwimmen und Kiemen Bewegung des Fisches. Als Narkosefortschreiten verlangsamt Kiemen Bewegung und die Fische werden unregelmäßig und häufig auf den Kopf zu schwimmen; betrachten Fische betäubt, sobald Kiemen Bewegung aufhört. Haben die Fische verlassen nicht für längere Zeit in der Anästhesie Bad, da dies zu den Tod der Fische führen. </li><li> Fisch aus der Narkose Becher und Transfer entfernenEis, indem die Fische horizontal mit dem Schwanz vor der Hand, die Pinzette. Wenn mit der Technik und wenn erfahrene mehrere Fische verwendet werden, um Explantate zu machen, in Betracht ziehen, den nächsten Fisch im Narkose Becher zu diesem Zeitpunkt. </li><li> Um Schuppen zu entfernen, Position Pinzette parallel zum Fisch mit Spitze am Rand der Skala. Drücken Flachseite der Pinzette leicht in die Seite des Fisches zu bewirken, dass die Skala auf dem Körper des Fisches zu erhöhen. Fassen Skala mit einer Pinzette zupfen und Ort (ohne Inversion) in Gewebekulturschale. Wiederholen Sie das Verfahren, das Entfernen maximal 12 Waagen aus einer großen Erwachsenen (6 von jeder Seite), die Vermeidung der Kiemenregion, die Seitenlinie, und Flossen. </li><li> Den Fisch in die stabile Becher und zu überwachen, um sicherzustellen, dass sie von den Auswirkungen der Narkose erholt. Zu diesem Zeitpunkt können die Fische zurück zu einem einzelnen Tank überführt werden. Lassen Sie den Fisch, der für mindestens 21 Tage zu erholen, um eine vollständige Skala Regeneration zu ermöglichen. </li><li> Abhängig von derexperimentelles Design, legen Sie bis zu 20 Waagen pro Kunststoff 35 mm Gewebekultur-behandelte Schale oder 4-6 Skalen pro Glasbodenschale. Lassen Skalen auf dem Teller vor sanft Hinzufügen von Medien, um nicht Schuppen aus der Schale lösen haften. HINWEIS: Mit zunehmender Erfahrung kann mehrere Fisch verarbeitet werden, bevor Medien dem ersten Schale zugegeben. </li><li> Fügen Sie 1,2 ml Vollmedium (siehe 1.2) in jede 35-mm-Schale. </li><li> Explantatkulturen vorzugsweise inkubieren bei 28 ° C in 5% CO 2 für den gewünschten Zeitraum mit oder ohne zusätzliche Behandlung. Alternativ inkubieren Kulturen auf einem geheizten Mikroskoptisch oder in einem Live-Zellkulturkammer für Videomikroskopie. </li></ol> 3. Hellfeld und Videomikroskopie <ol><li> Position Schalen mit Zellschichten auf den Mikroskoptisch und zunächst mit dem Fokus 4X Objektiv. HINWEIS: Höhere Vergrßerungen können verwendet werden, je nach dem Experiment. Kennzeichnung die Positionjede Zellschicht und / oder Orientierung der Schale auf der Bühne erleichtert die Aufnahme von Bildern über die Zeit, wobei die Blätter in etwa gleicher Ausrichtung. </li><li> Gerichte aus dem Inkubator und fotografieren zu verschiedenen Zeitpunkten zu entfernen, nach jeder Versuchsprotokoll und legen Sie wieder in den Inkubator, wenn nur Standbilder werden über die Versuchszeitrahmen benötigt. </li><li> Bei der Durchführung von Videomikroskopie, achten Sie auf die folgenden: <ol><li> Positionieren der Skala / Schwellenzellschicht im Sichtfeld, so dass die Migration von Zellschicht in dem Sichtfeld für die Dauer des Video bleibt. Hinweis: Dies kann einige Erfahrung in der Beobachtung, wie Zellen wandern unter dem Maßstab zu nehmen. Für kurze Videos, ist dies weniger ein Problem als für längere Videos. </li><li> Bei kürzeren Zeitrahmen, Inkubation bei RT. Bei längeren Zeitrahmen (18 + h), mit einem beheizten Stufe oder eine Inkubationskammer auf Temperatur zu halten, pH-Gleichgewicht, und das Verdampfen des Kultur m minimierenedium. </li></ol></li></ol> 4. Fixierung für Immunfluoreszenz-Mikroskopie <ol><li> Vorbereiten und pre-warmen alle Lösungen auf 28 ° C. Um Keratozyten unter Fluoreszenz anzuzeigen, Explantatkulturen wachsen wie oben mit Glasboden-35-mm-Gewebekulturschalen beschrieben. Alternativ können Sie auch Glaskammer gleitet. </li><li> Hinzufügen von 0,8 ml 4% Paraformaldehyd in 1,1 x PBS zu jeder Schale. Den Kulturmedien herausgezogen haben. Inkubiere bei Raumtemperatur für 5 min ansaugen dann zu der Lösung zu entfernen. </li><li> Hinzufügen von 0,8 ml 4% Paraformaldehyd in 1,1 x PBS zu jeder Schale. Inkubiere bei Raumtemperatur für 5 min ansaugen dann zu der Lösung zu entfernen. </li><li> Sofern nicht mit externen Liganden oder externen Epitope permeabilisieren Zellen durch Zugabe von 0,5 ml 0,2% Triton X-100 in PBS 1X. Inkubiere bei Raumtemperatur für 5 min ansaugen dann zu der Lösung zu entfernen. </li><li> 0,5 ml von 1% BSA in 1 × PBS und Inkubation für 1 Stunde (bei Raumtemperatur) oder O / N (bei 4 ° C). HINWEIS: Je nach Versuchsbedingungen phalloidin kann in diesem Schritt zugegeben werden. </li><li> Nach der Inkubation zum Ansaugen der Lösung zu entfernen und fahren Sie mit Antikörperfärbung. Alternativ speichern die Kulturschalen durch Zugabe von mindestens 1 bis 2 ml 1% BSA in 1 × PBS für 3-4 Wochen bei 4 ° C. </li></ol> 5. Immunfluoreszenz-Protokoll <ol><li> Bereiten primären und sekundären Antikörper-Lösungen gemäß den Empfehlungen des Herstellers. HINWEIS: Wenn die Empfehlungen des Herstellers verfügbar sind, ein guter Ausgangsverdünnung von primären Antikörpern (in 1% BSA in 1 × PBS) 1: 500 für polyklonale und 1: 1000 für monoklonale Antikörper; ein guter Ausgangsverdünnung für Sekundärantikörper 1: 1.000. Passen Sie diese Verdünnungen der ursprünglichen Bestand des Herstellers vorliegt höher, wenn das Signal schwach ist, geringer, wenn das Signal stark und Hintergrund ist ein Problem. </li><li> Saugen Sie das 1% BSA in 1x PBS-Lösung. 0,5 ml der primären Antikörperlösung, Inkubation für 1 Stunde (bei Raumtemperatur) oder O / N (bei 4 ° C). </li&gt; <li> Entfernen Sie den primären Antikörperlösung, legen Sie in eine saubere und etikettiert 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und bei -20 ° C. ANMERKUNG: Dies ermöglicht die Wiederverwendung des primären Antikörpers, wenn nötig. </li><li> Mit 1x PBS 5-mal, das Entfernen und Verwerfen des PBS nach jeder Wäsche - Waschen Sie die Teller 3. </li><li> 0,5 ml der sekundären Antikörper-Lösung. Wenn gewünscht, fügen fluoreszenzmarkierten Phalloidin (nach beliebiger Hersteller empfohlenen Konzentration) bei diesem Schritt. Inkubieren für 1 Stunde (bei Raumtemperatur) oder O / N (bei 4 ° C). HINWEIS: Die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Phalloidin erlaubt die Visualisierung von Aktin-Filamenten; Wir haben gefunden, daß 488-markiertem Phalloidin funktioniert am besten in unserer Zebrabärbling Keratozyten, aber auch andere Fluorophore verwendet werden. </li><li> Entfernen und entsorgen Sie die sekundäre Antikörperlösung. </li><li> Mit 1x PBS 5-mal, das Entfernen und Verwerfen des PBS nach jeder Wäsche - Waschen Sie die Teller 3. HINWEIS: Das Gericht kann gespeichert werden, von Licht bedeckt, bei 4 ° C, wenn nicht view sofort; stellen Sie sicher, 1x PBS wird vor dem Speichern, um sicherzustellen, dass die Zellen nicht austrocknen, aber warm auf RT in die Schale gegeben (20 - 30 min), und nehmen Sie die PBS kurz vor Sie mit dem nächsten Schritt. </li><li> Wenn Sie bereit sind, zu beobachten, fügen Sie 2-3 Tropfen einer Einschlussmittel, mit oder ohne DAPI, abhängig von den experimentellen Anforderungen, in die Schüssel und lassen Sie sich für 10 min bei RT. HINWEIS: Wir verwenden ein handelsübliches, Glycerinbasis Eindeckmedium mit DAPI, aber auch andere Befestigungsmittel können angewendet werden. Zulassen 10 min für das Fixiermittel in der Schale sitzen, erleichtert die Entfernung des Deckglases aus dem Boden der Schale. </li><li> Nach der Inkubation drücken Sie leicht auf die Seiten der Schale zu lösen und entfernen Sie das Deckglas. Fügen Sie einen zusätzlichen Tropfen Eindeckmittel auf einen Objektträger und legen Sie das Deckglas, Zellen nach unten, auf die Folie. HINWEIS: Betrachten Abdichtung der Deckglas auf den Objektträger mit klarem Nagellack, wenn der Schieber muss länger als 1 gehalten werden - 2 Tagen. </li><li> Beachten Sie die Objektträger unter einem Fluoreszenzmikroskop. HINWEIS: Die meisten unserer Bilder wurden mit einem 40X oder 63X Objektiv unter Ölimmersion genommen, aber die spezifischen verwendeten Objektivlinse wird auf dem Versuchsprotokoll ab. </li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+fluid+flow+in+rapidly+moving+cells.">Intracellular fluid flow in rapidly moving cells.</a> Nature Cell Biology. 11, 1219-1224 (2009).</li><li>Bereiter-Hahn, J., Strohmeier, R., Kunzenbacher, I., Beck, K., Voth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotion+of+Xenopus+epidermis+cells+in+primary+culture.">Locomotion of Xenopus epidermis cells in primary culture.</a> Journal of Cell Science. 52, 289-311 (1981).</li><li>Nishikawa, A., Shimizu-Nishikawa, K., Miller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterization,+and+in+vitro+culture+of+larval+and+adult+epidermal+cells+of+the+frog+Xenopus+laevis.">Isolation, characterization, and in vitro culture of larval and adult epidermal cells of the frog Xenopus laevis.</a> In Vitro Cellula., &amp; Developmental Biology. 26, 1128-1134 (1990).</li><li>Schober, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+adhesion+kinase+modulates+tension+signaling+to+control+actin+and+focal+adhesion+dynamics.">Focal adhesion kinase modulates tension signaling to control actin and focal adhesion dynamics.</a> The Journal of Cell Biology. 176, 667-680 (2007).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Der entscheidende Schritt für den Erfolg der Keratozyten Explantatkultur wird kann die Waage in die Kulturschale für etwa 2 haften - 3 Minuten vor der Zugabe von dem Kulturmedium. Etwa 75% der Schuppen haften und wachsen Blätter (die Anzahl der Kulturen für jedes Experiment etabliert müssen entsprechend angepasst werden). Keratozyten Blätter sind nicht an jeder Waage aus dem Fisch herausgenommen und in der Kultur aus verschiedenen Gründen getätigt. Zuerst DAPI-Färbung von Explantaten auf, dass einige Skalen hab...

<html> Studium der Zellbewegung traditionell auf individuell wandernden Zellen konzentriert. Keratozyten von Fischen und Amphibien Explantate kultiviert haben sich als ein leistungsfähiges Modellsystem, um die Mechanismen der Zellbeweglichkeit Studie mit experimentellen und mathematischen Modellierung nähert 1-6 sein. Experimentelle Arbeiten auf individuell wandernden Zellen wird durch die schnelle, leichtgängige Bewegung der Zellen unterstützt, und gleichzeitig eine gleichmäßige Form, Geschwindigkeit und Richtung. In vivo werden Zellen kollektiv bewegen häufig während Zell-Zell-Junctions, insbesondere während der Embryogenese, Wundheilung und Metastase. So ist kollektive Zellmigration eine wachsende und immer wichtigere Forschungsgebiet im Bereich der Zellmigration. Die kollektive Migration dieser Zellen wurde vor kurzem beschrieben 7 und es hat viele einzigartige Eigenschaften, die es ein leistungsfähiges System zur kollektiven Zellmigration in einer Wundheilung Modell untersuchen zu machen. ove_content &quot;&gt; Beim Schuppen werden aus einem betäubten erwachsenen Zebrafisch gezupft bleibt etwas Epithelgewebe an der Unterseite des Umfangs angebracht ist. Wenn die Zellkulturmedium zugegeben wird, diese Epithelzellen oder Keratozyten, schnell wandern als Sammeleinheit von der Skala. Das Explantatkultur kann als epitheliale Wundheilung Modell, in dem die Zellen wandern vom Explantat wie sie es in der vorläufigen Matrix eines Wundbett um ein intaktes Epithel wiederherzustellen angesehen werden. Neuere Daten legen nahe, dass dieser ex vivo-Kultur imitiert viele Merkmale in vivo Wundheilung bei erwachsenen Zebrafisch. Wundverschlussraten 8 zu einer Wanderungsgeschwindigkeit ähnlich zu der in den ex-vivo-System 7 beobachtet übersetzen. Zusätzlich wird in einem in vivo-Wundheilungsmodell Behandlung mit Warfarin legt nahe, dass die Hämostase hat keine Auswirkung auf die Geschwindigkeit der Heilung, ist während der Behandlung mit Hydrocortison zur Immunantwort verringern nicht Reepithelialisierung 8 verzögern </sup&gt;. Da der Zebrafisch blutet nicht, wenn die Waage aus dem Tier entfernt wird, ist die Blutstillung nicht ein wichtiger Akteur. Obwohl wir Immunzellen im Explantate finden, haben wir nicht die Auswirkungen sie auf kollektive Zellmigration haben könnte untersucht. Die hier vorgestellte Protokoll beschreibt, wie Zebrafisch Keratozyten Explantatkulturen, die Konsistenz und Reproduzierbarkeit für den Einsatz in vielen biologischen Tests gewährleistet werden kann. Diese Explantatkulturen sind aus mehreren Gründen besonders überzeugende in-vitro-Modell für gemeinsame Zellmigration. Erstens sind die Zebrafisch-Keratozyten Primärzellen innerhalb weniger Stunden nach Gründung Explantatkulturen verwendet. Deshalb wurden diese Zellen nicht die morphologischen Veränderungen der Genexpression und mit dem Durchgang von primären Zellen assoziiert 9-13 unterzogen. Zweitens, stellt dieses System ein Modell für die Untersuchung der Reepithelialisierung in Antwort auf Verwundung 14 und, als Teil der Antwort auf Verwundung eines epithelialen mesenchymale transition Prozess (EMT) initiiert wird, wie Veränderungen in der Genexpression und der Umordnung des Cytoskeletts 14,15 belegt. Somit ändert sich der Hintergrund in der Genexpression und der Beweglichkeit, die in unbehandelten Zellen auftreten wurden charakterisiert und einen Rahmen, um Änderungen bei der Behandlung zu interpretieren. Darüber hinaus die Fische Keratozyten und die menschliche Keratinozyten sind funktionell gleichwertig; beide sind die primären Epithelzellen der jeweiligen Arten und spielen eine Schlüsselrolle in epithelialen Wundheilung. Drittens erwachsenen Zebrafisch werden zunehmend Anerkennung als ein Modellsystem für eine Vielzahl von Krankheiten beim Menschen 16-18 einschließlich Melanomen und anderen Krebs 19-21, kutane Wundheilung 8,14 und Geweberegeneration 22-24. Technische Vorteile dieses Modellsystems sind gleichermaßen überzeugend. Eine wachsende Zahl von Mutanten und transgenen Linien sind von Non-Profit, zentrale Einrichtungen. Insbesondere wird das Zebrafisch-Mutation Project (ZMP) Am Wellcome Trust Sanger Institute zielt darauf ab, einen KO-Allel in jedem Protein kodierenden Gens im Zebrafisch-Genom zu schaffen. Derzeit haben sie 11.892 Gene, etwa 45% des Genoms mutiert, mit 24.088-Allele aufweist. Darüber hinaus übernimmt ZMP Vorschläge und Knock-outs kostenlos zu generieren. Neue Methoden der Gen-Knockdown in Larven und erwachsenen Zebrafisch 25-28 bieten Flexibilität, um die Funktion von entwicklungspolitisch wichtige Gene für die transgene Ansätze problematisch oder unmöglich zu studieren. Durch ihre extrem schnelle Raten von Motilität von ~ 145 um / h kurz nach Gründung der Kulturen 29 können Assays schnell (in der Regel in 24 Stunden oder weniger) durchgeführt werden. Wie Versuche kann schnell abgeschlossen werden und Kulturen wachsen gut bei RT mehrere der technischen Hürden mit Säugerzellmigration Assays, die Videomikroskopie vermieden verbunden. Außerdem im Zeitalter der Anzugsforschungsbudgets, zebrafish sind einfach und kostengünstig gepflegt. Die Struktur und das Verhalten der Explantation ist komplex. Da die Fische nicht ausbluten, wenn die Waage entfernt wird, ist es unwahrscheinlich, dass viel mehr als die oberflächlichen Schichten der Epidermis mit der Waage entfernt. Keratozyten scheinen die vorherrschende Zelltyp in dem Explantat, wenn Skalen werden zunächst aus dem Fisch entfernt, da die große Mehrheit der Zellen scheinen mit einem Anti-E-Cadherin-Antikörper 14 zu färben. Darüber hinaus gibt es keine Hinweise auf Fibroblasten in der Vorkultur wie durch die Abwesenheit von Vimentin Färbung beurteilt durch Immunofluoreszenz 14. Aber mit wiederholter Steinentfernung scheint es zahlreiche Neutrophile in der Explantation (siehe Video 1). Wir haben diese Zellen wie Neutrophile, basierend auf morphologischen Beobachtungen ihrer Größe schnell Motilität und ihre Migration aus der Zelle ausgewiesenen, wenn sie LPS ausgesetzt (Ergebnisse nicht gezeigt). Zusätzlich werden diese Zellen zu färben hell Witzh ein Antikörper gegen Neutrophilen cytosolischen Faktor sowie mit einer Vielzahl von sekundären IgG-Antikörper, was darauf hinweist, dass sie reichlich FcRs auf ihrer Oberfläche haben (Daten nicht gezeigt). Mehrere Zellschichten sind in der Explantation vorhanden. Konfokale Mikroskopie zeigt die Anwesenheit einer einzigen Schicht in der Nähe der Vorderkante, um mehr als zwei Schichten von Keratozyten nahe der Skala mit Neutrophilen sichtbar oberhalb, unterhalb und zwischen den Zellen Keratozyten Blättern. Zu frühen Zeitpunkten, Zellen auf dem Rand des mehrschichtigen Explantat polarisieren, Initiieren kollektiven Migration Keratozyten aus dem Explantat mit anfänglichen Geschwindigkeiten von ~ 145 &amp; mgr; m / h beträgt. Das von dem Explantat abgedeckt schnell zunimmt, was zu Zellausbreitung, Spannung in dem Blatt, und eine verringerte Vorschubgeschwindigkeit von der Vorderkante. Rapid Umwandlungen zwischen führenden und folgenden Zellen werden an der Vorderkante während der Bildung und der Schließung von spontan gebildeten Löcher in der Folie 7 beobachtet. Wie dieEMT-Prozess mit dem Explantat initiiert weiterhin die Blattfragmente und die Keratozyten verlieren ihre spezielle, schnelle Beweglichkeit. Genexpression und morphologischen Veränderungen, die mit EMT, Wundheilung, und Entzündungsreaktionen auftreten, innerhalb von 7 Tagen Kultur mit Explantaten erwogen fähig ca. 10 Tage 14.

<table><tbody><tr><td>35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated)</td><td>MatTek</td><td>P35GC-1.5-14-C</td><td>1.5 mm thickness is best for coverslip removal. 14 mm diameter provides more culture area.</td></tr><tr><td>Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303</td><td>VWR</td><td>21909-460</td><td>We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal.</td></tr></tbody></table>

zebrafish keratocyte explants to study collective cell migration and reepithelialization in cutaneous wound healing

Aufgrund ihrer einzigartigen Eigenschaften motile dissoziierte Fisch Keratozyten aus Explantatkulturen werden seit langem verwendet, um die Mechanismen der einzelnen Zellwanderung zu untersuchen. Allerdings, wenn Explantate ansässig sind, diese Zellen zusammen bewegen sich auch, die Aufrechterhaltung viele der Funktionen, die einzelnen Keratozyten ein attraktives Modell, um die Migration zu studieren machen: schnelle Raten von Beweglichkeit, umfangreiche Aktin-reichen Lamellen mit einer senkrecht Aktin Kabel und relativ konstanter Drehzahl und Migrationsrichtung. In frühen Explantate, die rasche Umwandlung von Zellen einzeln Migration mit denen die Migration kollektiv ermöglicht die Untersuchung der Rolle der Zell-Zell-Adhäsionen bei der Bestimmung des Modus der Migration, und betont die molekularen Bindungen zwischen den beiden Betriebsarten der Migration. Zellen in späteren Explantate verlieren ihre Fähigkeit, rasch und gemeinsam wandern, wenn eine epitheliale mesenchymalen Übergang auftritt und Genen mit der Wundheilung und Entzündung verbunden sind, differentiell exprimierten. Somit kann Keratozyten Explantate als in vitro-Modell für die Reepithelialisierung die kutanen Wundheilung auftritt, und kann ein einzigartiges System zur Mechanismen kollektiver Zellmigration im Rahmen eines definierten Programms von Veränderungen der Genexpression zu studieren repräsentieren dienen. Eine Vielzahl von Mutanten und transgene Zebrafischlinien zur Verfügung, die Explantate von Fisch mit verschiedenen genetischen Hintergründen festgelegt werden kann. Dies ermöglicht es die Rolle von verschiedenen Proteinen innerhalb dieser Prozesse eindeutig adressiert werden. Die hier aufgeführten Protokolle beschreiben eine einfache und effektive Methode zur Festlegung dieser Explantatkulturen für den Einsatz in einer Vielzahl von Assays auf Kollektiv Zelle Migration.

Wie in Figur 1 dargestellt ist, können Blätter von Keratozyten Migration aus unter der Skala innerhalb von Stunden nach Errichtung der Explantatkultur beachten. Gelegentlich kann ein individuell Migration Keratozyten, die aus dem gemeinsam Migration Blatt weggebrochen wurde, einzuhalten ist. Zusätzlich, da das Explantat von einem Fisch, der zuvor gezupft worden hergestellt ist, gibt es reichlich Neutrophilen migrieren durch die Folie. Bei längeren Kulturzeiträume, die Keratozyten Blatt Fragmente al...

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Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Zebrabärbling Keratozyten migrieren in Zellschichten aus Explantaten und stellen eine in vitro-Modell für die Untersuchung der Mechanismen der kollektiven Zellmigration im Rahmen der epithelialen Wundheilung. Diese Protokolle Detail ein effektiver Weg zur primären Explantatkulturen für den Einsatz in kollektive Zellmigrationsassays herzustellen.

Zebrafisch Keratozyten Explantate auf Collective Zellmigration und Reepithelialisierung in kutane Wundheilung Studieren

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

zebrafish-keratocyte-explants-to-study-collective-cell-migration

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.9K Aufrufe.  Midwestern University.  Zebrabärbling Keratozyten migrieren in Zellschichten aus Explantaten und stellen eine in vitro-Modell für die Untersuchung der Mechanismen der kollektiven Zellmigration im Rahmen der epithelialen Wundheilung. Diese Protokolle Detail ein effektiver Weg zur primären Explantatkulturen für den Einsatz in kollektive Zellmigrationsassays herzustellen. 

Serie: Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.

Studying the earliest events of preneoplastic cell progression and innate immune cell interaction is pivotal to understand and treat cancer. Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformations and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells in zebrafish larvae.

Live-Imaging von angeborenen Immun und Präkanzeröse Zell-Interaktionen unter Verwendung eines induzierbaren Gal4 / UAS Expression System in Zebrafisch-Larven Haut

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

Mechanische Gefäßverletzung in Zebrafischembryonen

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Erfassen von Gewebereparatur in Zebrafisch-Larven mit Zeitrafferhellstereomikroskopie

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

Die Nutzung der Teton-System, um molekulare Mechanismen bei Zebrafisch Regeneration Studieren

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to follow and manipulate the wound response ex vivo in an environment that closely mimics that of epithelial tissue injury in vivo. This issue was addressed by creating a clinically relevant epithelial ex vivo injury-repair model based on cataract surgery. In this culture model, the response of the lens epithelium to wounding can be followed live in the cells&#8217; native microenvironment, and the molecular mediators of wound repair easily manipulated during the repair process. To prepare the cultures, lenses are removed from the eye and a small incision is made in the anterior of the lens from which the inner mass of lens fiber cells is removed. This procedure creates a circular wound on the posterior lens capsule, the thick basement membrane that surrounds the lens. This wound area where the fiber cells were attached is located just adjacent to a continuous monolayer of lens epithelial cells that remains linked to the lens capsule during the surgical procedure. The wounded epithelium, the cell type from which fiber cells are derived during development, responds to the injury of fiber cell removal by moving collectively across the wound area, led by a population of vimentin-rich repair cells whose mesenchymal progenitors are endogenous to the lens1. These properties are typical of a normal epithelial wound healing response. In this model, as in vivo, wound repair is dependent on signals supplied by the endogenous environment that is uniquely maintained in this ex vivo culture system, providing an ideal opportunity for discovery of the mechanisms that regulate repair of an epithelium following wounding.

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Described here is the establishment of a clinically relevant ex vivo mock cataract surgery model that can be used to investigate mechanisms of the injury response of epithelial tissues within their native microenvironment.

Einrichtung von einem klinisch relevanten<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mock Kataraktchirurgie Modell zur Untersuchung von epithelialen Wundheilung in einer nativen Mikromilieu

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for live high-resolution microscopic imaging of dynamic biological phenomena in space and time with cellular resolution. However, the traditional method of agarose encapsulation for live imaging can impede larval development and tissue regrowth. Therefore, this manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which was designed and fabricated as a functionally compartmentalized device to orient larvae for high-resolution microscopy while permitting caudal fin transection within the device and subsequent unrestrained tail development and re-growth. This device allows for wounding and long-term imaging while maintaining viability. Given that the zWEDGI mold is 3D printed, the customizability of its geometries make it easily modified for diverse zebrafish imaging applications. Furthermore, the zWEDGI offers numerous benefits, such as access to the larva during experimentation for wounding or for the application of reagents, paralleled orientation of multiple larvae for streamlined imaging, and reusability of the device.

This manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which is a compartmentalized device designed to orient and restrain zebrafish larvae. The design permits tail transection and long-term collection of high-resolution fluorescent microscopy images of wound healing and regeneration.

Langfristige Live Imaging-Gerät für verbesserte experimentelle Manipulation von Zebrafischlarven

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

Biotechnik

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function. Our studies have found that dying cells send signals to their live neighbors to form and contract a ring of actin and myosin that ejects it out from the epithelial sheet while closing any gaps that might have resulted from its exit, a process termed cell extrusion1. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe a method to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis. To visualize extrusion, we inject a red fluorescent protein labeled probe for F-actin into one-cell stage transgenic zebrafish embryos expressing green fluorescent protein in the epidermis and induce apoptosis by addition of G418 to larvae. We then use time-lapse imaging on a spinning disc confocal microscope to observe actin dynamics and epithelial cell behaviors during the process of apoptotic cell extrusion. This approach allows us to investigate the extrusion process in live epithelia and will provide an avenue to study disease states caused by the failure to eliminate apoptotic cells.

Dying cells are extruded from epithelial tissues by concerted contraction of neighboring cells without disrupting barrier function. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe methods to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis at cellular resolution.

Live-Bildgebung von Zell Extrusion aus der Epidermis der Entwicklung von Zebrafisch

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Biologie

<meta charset="utf8"></head><body>Robuste Zebrafischzelltransplantation für die Regenerations- und Entwicklungsforschung

High-resolution Cell Transplantation in Embryonic and Larval Zebrafish

Development and regeneration occur by a process of genetically encoded spatiotemporally dynamic cellular interactions. The use of cell transplantation between animals to track cell fate and to induce mismatches in the genetic, spatial, or temporal properties of donor and host cells is a powerful means of examining the nature of these interactions. Organisms such as chick and amphibians have made crucial contributions to our understanding of development and regeneration, respectively, in large part because of their amenability to transplantation. The power of these models, however, has been limited by low genetic tractability. Likewise, the major genetic model organisms have lower amenability to transplantation. 
The zebrafish is a major genetic model for development and regeneration, and while cell transplantation is common in zebrafish, it is generally limited to the transfer of undifferentiated cells at the early blastula and gastrula stages of development. In this article, we present a simple and robust method that extends the zebrafish transplantation window to any embryonic or larval stage between at least 1 and 7 days post fertilization. The precision of this approach allows for the transplantation of as little as one cell with near-perfect spatial and temporal resolution in both donor and host animals. While we highlight here the transplantation of embryonic and larval neurons for the study of nerve development and regeneration, respectively, this approach is applicable to a wide range of progenitor and differentiated cell types and research questions.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Kartierung der zellulären Konnektivität im Nervensystem des Zebrafisches während der Entwicklung und Regeneration

Here we present a protocol to transplant cells with high spatial and temporal resolution in zebrafish embryos and larvae at any stage between at least 1 and 7 days post fertilization.

Hochauflösende Zelltransplantation in embryonalen und larvalen Zebrafischen

Development and regeneration occur by a process of genetically encoded spatiotemporally dynamic cellular interactions. The use of cell transplantation ...

Zebrafisch Keratozyten Explantate auf Collective Zellmigration und Reepithelialisierung in kutane Wundheilung Studieren

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Live-Imaging von angeborenen Immun und Präkanzeröse Zell-Interaktionen unter Verwendung eines induzierbaren Gal4 / UAS Expression System in Zebrafisch-Larven Haut

Mechanische Gefäßverletzung in Zebrafischembryonen

Erfassen von Gewebereparatur in Zebrafisch-Larven mit Zeitrafferhellstereomikroskopie

Die Nutzung der Teton-System, um molekulare Mechanismen bei Zebrafisch Regeneration Studieren

Einrichtung von einem klinisch relevanten

Langfristige Live Imaging-Gerät für verbesserte experimentelle Manipulation von Zebrafischlarven

Live-Bildgebung von Zell Extrusion aus der Epidermis der Entwicklung von Zebrafisch

Hochauflösende Zelltransplantation in embryonalen und larvalen Zebrafischen

Hochauflösende Zelltransplantation in embryonalen und larvalen Zebrafischen

Hochauflösende Zelltransplantation in embryonalen und larvalen Zebrafischen