Diese Arbeit wurde durch Mittel aus Midwestern University College of Health Sciences Research Facilitation Grant EEH und Midwestern University Office of Research und Sponsored Programme Intramural Grant KJL verliehen unterstützt.

Dieses Protokoll entspricht den AVMA Tierschutzgrundsätze für die Pflege und Verwendung von Labortieren und wurde von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) an Midwestern University zugelassen. 1. Vorbereitung der Anästhesie, Ausstattung, &amp; Medien <ol><li> Entchloren ca. 1,5 l Leitungswasser entweder mit einem kommerziellen Entchlorungsmittel (erhältlich in Zoohandlungen) oder durch stehendes Wasser für 24 Stunden. Wenn Sie drei 1 l Becher und füllen jeweils mit 500 ml entchlortes Wasser. Beschriften Sie eine für das Halten von Fisch vor jedem Verfahren und eine für die Wiederherstellung. Zum dritten Becherglas 100 ug / ml Tricaine Methansulfonat; dies wird das Becherglas, in dem Fische betäubt werden. </li><li> Füllen Sie eine flache Schale mit Eis, warm das Kulturmedium (RPMI 1640, 10% FBS (fötales Rinderserum), 50 ug / ml Gentamycin, 100 ug / ml Kanamycin, 25 mM HEPES) auf RT und sammeln Pinzette sauber Juwelier. Saubere Pinzette durch immersingen die Tipps in 70% Ethanol und durch einen Bunsenbrenner, so dass das Ethanol zu verbrennen. </li><li> Entscheiden Sie, ob das Verfahren wird ohne Vergrößerung mit 2 durchgeführt werden, mit einem handelsüblichen, auf dem Tisch beleuchtete Lupe - 10-facher Vergrößerung oder Binokular (völlig abhängig von persönlicher Vorliebe). </li></ol> 2. Stellen Sie Explantatkulturen <ol><li> Fangen Sie die gewünschte Anzahl von Fischen und in einen Haltebecher. Übertragen einer einzigen Fisch auf die Anästhesie-Becher; ist es am besten, um Fische einzeln zu betäuben. </li><li> Überwachen Sie die Auswirkungen der Narkose durch Beobachtung der Schwimmen und Kiemen Bewegung des Fisches. Als Narkosefortschreiten verlangsamt Kiemen Bewegung und die Fische werden unregelmäßig und häufig auf den Kopf zu schwimmen; betrachten Fische betäubt, sobald Kiemen Bewegung aufhört. Haben die Fische verlassen nicht für längere Zeit in der Anästhesie Bad, da dies zu den Tod der Fische führen. </li><li> Fisch aus der Narkose Becher und Transfer entfernenEis, indem die Fische horizontal mit dem Schwanz vor der Hand, die Pinzette. Wenn mit der Technik und wenn erfahrene mehrere Fische verwendet werden, um Explantate zu machen, in Betracht ziehen, den nächsten Fisch im Narkose Becher zu diesem Zeitpunkt. </li><li> Um Schuppen zu entfernen, Position Pinzette parallel zum Fisch mit Spitze am Rand der Skala. Drücken Flachseite der Pinzette leicht in die Seite des Fisches zu bewirken, dass die Skala auf dem Körper des Fisches zu erhöhen. Fassen Skala mit einer Pinzette zupfen und Ort (ohne Inversion) in Gewebekulturschale. Wiederholen Sie das Verfahren, das Entfernen maximal 12 Waagen aus einer großen Erwachsenen (6 von jeder Seite), die Vermeidung der Kiemenregion, die Seitenlinie, und Flossen. </li><li> Den Fisch in die stabile Becher und zu überwachen, um sicherzustellen, dass sie von den Auswirkungen der Narkose erholt. Zu diesem Zeitpunkt können die Fische zurück zu einem einzelnen Tank überführt werden. Lassen Sie den Fisch, der für mindestens 21 Tage zu erholen, um eine vollständige Skala Regeneration zu ermöglichen. </li><li> Abhängig von derexperimentelles Design, legen Sie bis zu 20 Waagen pro Kunststoff 35 mm Gewebekultur-behandelte Schale oder 4-6 Skalen pro Glasbodenschale. Lassen Skalen auf dem Teller vor sanft Hinzufügen von Medien, um nicht Schuppen aus der Schale lösen haften. HINWEIS: Mit zunehmender Erfahrung kann mehrere Fisch verarbeitet werden, bevor Medien dem ersten Schale zugegeben. </li><li> Fügen Sie 1,2 ml Vollmedium (siehe 1.2) in jede 35-mm-Schale. </li><li> Explantatkulturen vorzugsweise inkubieren bei 28 ° C in 5% CO 2 für den gewünschten Zeitraum mit oder ohne zusätzliche Behandlung. Alternativ inkubieren Kulturen auf einem geheizten Mikroskoptisch oder in einem Live-Zellkulturkammer für Videomikroskopie. </li></ol> 3. Hellfeld und Videomikroskopie <ol><li> Position Schalen mit Zellschichten auf den Mikroskoptisch und zunächst mit dem Fokus 4X Objektiv. HINWEIS: Höhere Vergrßerungen können verwendet werden, je nach dem Experiment. Kennzeichnung die Positionjede Zellschicht und / oder Orientierung der Schale auf der Bühne erleichtert die Aufnahme von Bildern über die Zeit, wobei die Blätter in etwa gleicher Ausrichtung. </li><li> Gerichte aus dem Inkubator und fotografieren zu verschiedenen Zeitpunkten zu entfernen, nach jeder Versuchsprotokoll und legen Sie wieder in den Inkubator, wenn nur Standbilder werden über die Versuchszeitrahmen benötigt. </li><li> Bei der Durchführung von Videomikroskopie, achten Sie auf die folgenden: <ol><li> Positionieren der Skala / Schwellenzellschicht im Sichtfeld, so dass die Migration von Zellschicht in dem Sichtfeld für die Dauer des Video bleibt. Hinweis: Dies kann einige Erfahrung in der Beobachtung, wie Zellen wandern unter dem Maßstab zu nehmen. Für kurze Videos, ist dies weniger ein Problem als für längere Videos. </li><li> Bei kürzeren Zeitrahmen, Inkubation bei RT. Bei längeren Zeitrahmen (18 + h), mit einem beheizten Stufe oder eine Inkubationskammer auf Temperatur zu halten, pH-Gleichgewicht, und das Verdampfen des Kultur m minimierenedium. </li></ol></li></ol> 4. Fixierung für Immunfluoreszenz-Mikroskopie <ol><li> Vorbereiten und pre-warmen alle Lösungen auf 28 ° C. Um Keratozyten unter Fluoreszenz anzuzeigen, Explantatkulturen wachsen wie oben mit Glasboden-35-mm-Gewebekulturschalen beschrieben. Alternativ können Sie auch Glaskammer gleitet. </li><li> Hinzufügen von 0,8 ml 4% Paraformaldehyd in 1,1 x PBS zu jeder Schale. Den Kulturmedien herausgezogen haben. Inkubiere bei Raumtemperatur für 5 min ansaugen dann zu der Lösung zu entfernen. </li><li> Hinzufügen von 0,8 ml 4% Paraformaldehyd in 1,1 x PBS zu jeder Schale. Inkubiere bei Raumtemperatur für 5 min ansaugen dann zu der Lösung zu entfernen. </li><li> Sofern nicht mit externen Liganden oder externen Epitope permeabilisieren Zellen durch Zugabe von 0,5 ml 0,2% Triton X-100 in PBS 1X. Inkubiere bei Raumtemperatur für 5 min ansaugen dann zu der Lösung zu entfernen. </li><li> 0,5 ml von 1% BSA in 1 × PBS und Inkubation für 1 Stunde (bei Raumtemperatur) oder O / N (bei 4 ° C). HINWEIS: Je nach Versuchsbedingungen phalloidin kann in diesem Schritt zugegeben werden. </li><li> Nach der Inkubation zum Ansaugen der Lösung zu entfernen und fahren Sie mit Antikörperfärbung. Alternativ speichern die Kulturschalen durch Zugabe von mindestens 1 bis 2 ml 1% BSA in 1 × PBS für 3-4 Wochen bei 4 ° C. </li></ol> 5. Immunfluoreszenz-Protokoll <ol><li> Bereiten primären und sekundären Antikörper-Lösungen gemäß den Empfehlungen des Herstellers. HINWEIS: Wenn die Empfehlungen des Herstellers verfügbar sind, ein guter Ausgangsverdünnung von primären Antikörpern (in 1% BSA in 1 × PBS) 1: 500 für polyklonale und 1: 1000 für monoklonale Antikörper; ein guter Ausgangsverdünnung für Sekundärantikörper 1: 1.000. Passen Sie diese Verdünnungen der ursprünglichen Bestand des Herstellers vorliegt höher, wenn das Signal schwach ist, geringer, wenn das Signal stark und Hintergrund ist ein Problem. </li><li> Saugen Sie das 1% BSA in 1x PBS-Lösung. 0,5 ml der primären Antikörperlösung, Inkubation für 1 Stunde (bei Raumtemperatur) oder O / N (bei 4 ° C). </li&gt; <li> Entfernen Sie den primären Antikörperlösung, legen Sie in eine saubere und etikettiert 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und bei -20 ° C. ANMERKUNG: Dies ermöglicht die Wiederverwendung des primären Antikörpers, wenn nötig. </li><li> Mit 1x PBS 5-mal, das Entfernen und Verwerfen des PBS nach jeder Wäsche - Waschen Sie die Teller 3. </li><li> 0,5 ml der sekundären Antikörper-Lösung. Wenn gewünscht, fügen fluoreszenzmarkierten Phalloidin (nach beliebiger Hersteller empfohlenen Konzentration) bei diesem Schritt. Inkubieren für 1 Stunde (bei Raumtemperatur) oder O / N (bei 4 ° C). HINWEIS: Die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Phalloidin erlaubt die Visualisierung von Aktin-Filamenten; Wir haben gefunden, daß 488-markiertem Phalloidin funktioniert am besten in unserer Zebrabärbling Keratozyten, aber auch andere Fluorophore verwendet werden. </li><li> Entfernen und entsorgen Sie die sekundäre Antikörperlösung. </li><li> Mit 1x PBS 5-mal, das Entfernen und Verwerfen des PBS nach jeder Wäsche - Waschen Sie die Teller 3. HINWEIS: Das Gericht kann gespeichert werden, von Licht bedeckt, bei 4 ° C, wenn nicht view sofort; stellen Sie sicher, 1x PBS wird vor dem Speichern, um sicherzustellen, dass die Zellen nicht austrocknen, aber warm auf RT in die Schale gegeben (20 - 30 min), und nehmen Sie die PBS kurz vor Sie mit dem nächsten Schritt. </li><li> Wenn Sie bereit sind, zu beobachten, fügen Sie 2-3 Tropfen einer Einschlussmittel, mit oder ohne DAPI, abhängig von den experimentellen Anforderungen, in die Schüssel und lassen Sie sich für 10 min bei RT. HINWEIS: Wir verwenden ein handelsübliches, Glycerinbasis Eindeckmedium mit DAPI, aber auch andere Befestigungsmittel können angewendet werden. Zulassen 10 min für das Fixiermittel in der Schale sitzen, erleichtert die Entfernung des Deckglases aus dem Boden der Schale. </li><li> Nach der Inkubation drücken Sie leicht auf die Seiten der Schale zu lösen und entfernen Sie das Deckglas. Fügen Sie einen zusätzlichen Tropfen Eindeckmittel auf einen Objektträger und legen Sie das Deckglas, Zellen nach unten, auf die Folie. HINWEIS: Betrachten Abdichtung der Deckglas auf den Objektträger mit klarem Nagellack, wenn der Schieber muss länger als 1 gehalten werden - 2 Tagen. </li><li> Beachten Sie die Objektträger unter einem Fluoreszenzmikroskop. HINWEIS: Die meisten unserer Bilder wurden mit einem 40X oder 63X Objektiv unter Ölimmersion genommen, aber die spezifischen verwendeten Objektivlinse wird auf dem Versuchsprotokoll ab. </li></ol>

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase-14+is+a+mechanically+regulated+activator+of+secreted+MMPs+and+invasion.">Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2014).</li><li>Sire, J. -. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+fluid+flow+in+rapidly+moving+cells.">Intracellular fluid flow in rapidly moving cells.</a> Nature Cell Biology. 11, 1219-1224 (2009).</li><li>Bereiter-Hahn, J., Strohmeier, R., Kunzenbacher, I., Beck, K., Voth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotion+of+Xenopus+epidermis+cells+in+primary+culture.">Locomotion of Xenopus epidermis cells in primary culture.</a> Journal of Cell Science. 52, 289-311 (1981).</li><li>Nishikawa, A., Shimizu-Nishikawa, K., Miller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterization,+and+in+vitro+culture+of+larval+and+adult+epidermal+cells+of+the+frog+Xenopus+laevis.">Isolation, characterization, and in vitro culture of larval and adult epidermal cells of the frog Xenopus laevis.</a> In Vitro Cellula., &amp; Developmental Biology. 26, 1128-1134 (1990).</li><li>Schober, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+adhesion+kinase+modulates+tension+signaling+to+control+actin+and+focal+adhesion+dynamics.">Focal adhesion kinase modulates tension signaling to control actin and focal adhesion dynamics.</a> The Journal of Cell Biology. 176, 667-680 (2007).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Der entscheidende Schritt für den Erfolg der Keratozyten Explantatkultur wird kann die Waage in die Kulturschale für etwa 2 haften - 3 Minuten vor der Zugabe von dem Kulturmedium. Etwa 75% der Schuppen haften und wachsen Blätter (die Anzahl der Kulturen für jedes Experiment etabliert müssen entsprechend angepasst werden). Keratozyten Blätter sind nicht an jeder Waage aus dem Fisch herausgenommen und in der Kultur aus verschiedenen Gründen getätigt. Zuerst DAPI-Färbung von Explantaten auf, dass einige Skalen hab...

<html> Studium der Zellbewegung traditionell auf individuell wandernden Zellen konzentriert. Keratozyten von Fischen und Amphibien Explantate kultiviert haben sich als ein leistungsfähiges Modellsystem, um die Mechanismen der Zellbeweglichkeit Studie mit experimentellen und mathematischen Modellierung nähert 1-6 sein. Experimentelle Arbeiten auf individuell wandernden Zellen wird durch die schnelle, leichtgängige Bewegung der Zellen unterstützt, und gleichzeitig eine gleichmäßige Form, Geschwindigkeit und Richtung. In vivo werden Zellen kollektiv bewegen häufig während Zell-Zell-Junctions, insbesondere während der Embryogenese, Wundheilung und Metastase. So ist kollektive Zellmigration eine wachsende und immer wichtigere Forschungsgebiet im Bereich der Zellmigration. Die kollektive Migration dieser Zellen wurde vor kurzem beschrieben 7 und es hat viele einzigartige Eigenschaften, die es ein leistungsfähiges System zur kollektiven Zellmigration in einer Wundheilung Modell untersuchen zu machen. ove_content &quot;&gt; Beim Schuppen werden aus einem betäubten erwachsenen Zebrafisch gezupft bleibt etwas Epithelgewebe an der Unterseite des Umfangs angebracht ist. Wenn die Zellkulturmedium zugegeben wird, diese Epithelzellen oder Keratozyten, schnell wandern als Sammeleinheit von der Skala. Das Explantatkultur kann als epitheliale Wundheilung Modell, in dem die Zellen wandern vom Explantat wie sie es in der vorläufigen Matrix eines Wundbett um ein intaktes Epithel wiederherzustellen angesehen werden. Neuere Daten legen nahe, dass dieser ex vivo-Kultur imitiert viele Merkmale in vivo Wundheilung bei erwachsenen Zebrafisch. Wundverschlussraten 8 zu einer Wanderungsgeschwindigkeit ähnlich zu der in den ex-vivo-System 7 beobachtet übersetzen. Zusätzlich wird in einem in vivo-Wundheilungsmodell Behandlung mit Warfarin legt nahe, dass die Hämostase hat keine Auswirkung auf die Geschwindigkeit der Heilung, ist während der Behandlung mit Hydrocortison zur Immunantwort verringern nicht Reepithelialisierung 8 verzögern </sup&gt;. Da der Zebrafisch blutet nicht, wenn die Waage aus dem Tier entfernt wird, ist die Blutstillung nicht ein wichtiger Akteur. Obwohl wir Immunzellen im Explantate finden, haben wir nicht die Auswirkungen sie auf kollektive Zellmigration haben könnte untersucht. Die hier vorgestellte Protokoll beschreibt, wie Zebrafisch Keratozyten Explantatkulturen, die Konsistenz und Reproduzierbarkeit für den Einsatz in vielen biologischen Tests gewährleistet werden kann. Diese Explantatkulturen sind aus mehreren Gründen besonders überzeugende in-vitro-Modell für gemeinsame Zellmigration. Erstens sind die Zebrafisch-Keratozyten Primärzellen innerhalb weniger Stunden nach Gründung Explantatkulturen verwendet. Deshalb wurden diese Zellen nicht die morphologischen Veränderungen der Genexpression und mit dem Durchgang von primären Zellen assoziiert 9-13 unterzogen. Zweitens, stellt dieses System ein Modell für die Untersuchung der Reepithelialisierung in Antwort auf Verwundung 14 und, als Teil der Antwort auf Verwundung eines epithelialen mesenchymale transition Prozess (EMT) initiiert wird, wie Veränderungen in der Genexpression und der Umordnung des Cytoskeletts 14,15 belegt. Somit ändert sich der Hintergrund in der Genexpression und der Beweglichkeit, die in unbehandelten Zellen auftreten wurden charakterisiert und einen Rahmen, um Änderungen bei der Behandlung zu interpretieren. Darüber hinaus die Fische Keratozyten und die menschliche Keratinozyten sind funktionell gleichwertig; beide sind die primären Epithelzellen der jeweiligen Arten und spielen eine Schlüsselrolle in epithelialen Wundheilung. Drittens erwachsenen Zebrafisch werden zunehmend Anerkennung als ein Modellsystem für eine Vielzahl von Krankheiten beim Menschen 16-18 einschließlich Melanomen und anderen Krebs 19-21, kutane Wundheilung 8,14 und Geweberegeneration 22-24. Technische Vorteile dieses Modellsystems sind gleichermaßen überzeugend. Eine wachsende Zahl von Mutanten und transgenen Linien sind von Non-Profit, zentrale Einrichtungen. Insbesondere wird das Zebrafisch-Mutation Project (ZMP) Am Wellcome Trust Sanger Institute zielt darauf ab, einen KO-Allel in jedem Protein kodierenden Gens im Zebrafisch-Genom zu schaffen. Derzeit haben sie 11.892 Gene, etwa 45% des Genoms mutiert, mit 24.088-Allele aufweist. Darüber hinaus übernimmt ZMP Vorschläge und Knock-outs kostenlos zu generieren. Neue Methoden der Gen-Knockdown in Larven und erwachsenen Zebrafisch 25-28 bieten Flexibilität, um die Funktion von entwicklungspolitisch wichtige Gene für die transgene Ansätze problematisch oder unmöglich zu studieren. Durch ihre extrem schnelle Raten von Motilität von ~ 145 um / h kurz nach Gründung der Kulturen 29 können Assays schnell (in der Regel in 24 Stunden oder weniger) durchgeführt werden. Wie Versuche kann schnell abgeschlossen werden und Kulturen wachsen gut bei RT mehrere der technischen Hürden mit Säugerzellmigration Assays, die Videomikroskopie vermieden verbunden. Außerdem im Zeitalter der Anzugsforschungsbudgets, zebrafish sind einfach und kostengünstig gepflegt. Die Struktur und das Verhalten der Explantation ist komplex. Da die Fische nicht ausbluten, wenn die Waage entfernt wird, ist es unwahrscheinlich, dass viel mehr als die oberflächlichen Schichten der Epidermis mit der Waage entfernt. Keratozyten scheinen die vorherrschende Zelltyp in dem Explantat, wenn Skalen werden zunächst aus dem Fisch entfernt, da die große Mehrheit der Zellen scheinen mit einem Anti-E-Cadherin-Antikörper 14 zu färben. Darüber hinaus gibt es keine Hinweise auf Fibroblasten in der Vorkultur wie durch die Abwesenheit von Vimentin Färbung beurteilt durch Immunofluoreszenz 14. Aber mit wiederholter Steinentfernung scheint es zahlreiche Neutrophile in der Explantation (siehe Video 1). Wir haben diese Zellen wie Neutrophile, basierend auf morphologischen Beobachtungen ihrer Größe schnell Motilität und ihre Migration aus der Zelle ausgewiesenen, wenn sie LPS ausgesetzt (Ergebnisse nicht gezeigt). Zusätzlich werden diese Zellen zu färben hell Witzh ein Antikörper gegen Neutrophilen cytosolischen Faktor sowie mit einer Vielzahl von sekundären IgG-Antikörper, was darauf hinweist, dass sie reichlich FcRs auf ihrer Oberfläche haben (Daten nicht gezeigt). Mehrere Zellschichten sind in der Explantation vorhanden. Konfokale Mikroskopie zeigt die Anwesenheit einer einzigen Schicht in der Nähe der Vorderkante, um mehr als zwei Schichten von Keratozyten nahe der Skala mit Neutrophilen sichtbar oberhalb, unterhalb und zwischen den Zellen Keratozyten Blättern. Zu frühen Zeitpunkten, Zellen auf dem Rand des mehrschichtigen Explantat polarisieren, Initiieren kollektiven Migration Keratozyten aus dem Explantat mit anfänglichen Geschwindigkeiten von ~ 145 &amp; mgr; m / h beträgt. Das von dem Explantat abgedeckt schnell zunimmt, was zu Zellausbreitung, Spannung in dem Blatt, und eine verringerte Vorschubgeschwindigkeit von der Vorderkante. Rapid Umwandlungen zwischen führenden und folgenden Zellen werden an der Vorderkante während der Bildung und der Schließung von spontan gebildeten Löcher in der Folie 7 beobachtet. Wie dieEMT-Prozess mit dem Explantat initiiert weiterhin die Blattfragmente und die Keratozyten verlieren ihre spezielle, schnelle Beweglichkeit. Genexpression und morphologischen Veränderungen, die mit EMT, Wundheilung, und Entzündungsreaktionen auftreten, innerhalb von 7 Tagen Kultur mit Explantaten erwogen fähig ca. 10 Tage 14.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="777">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:320px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">MatTek</td>
			<td style="width:119px;">P35GC-1.5-14-C</td>
			<td style="width:320px;">1.5 mm&#160; thickness is best for coverslip removal.&#160; 14 mm diameter provides more culture area.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21909-460</td>
			<td style="width:320px;">We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish keratocyte explants to study collective cell migration and reepithelialization in cutaneous wound healing

Aufgrund ihrer einzigartigen Eigenschaften motile dissoziierte Fisch Keratozyten aus Explantatkulturen werden seit langem verwendet, um die Mechanismen der einzelnen Zellwanderung zu untersuchen. Allerdings, wenn Explantate ansässig sind, diese Zellen zusammen bewegen sich auch, die Aufrechterhaltung viele der Funktionen, die einzelnen Keratozyten ein attraktives Modell, um die Migration zu studieren machen: schnelle Raten von Beweglichkeit, umfangreiche Aktin-reichen Lamellen mit einer senkrecht Aktin Kabel und relativ konstanter Drehzahl und Migrationsrichtung. In frühen Explantate, die rasche Umwandlung von Zellen einzeln Migration mit denen die Migration kollektiv ermöglicht die Untersuchung der Rolle der Zell-Zell-Adhäsionen bei der Bestimmung des Modus der Migration, und betont die molekularen Bindungen zwischen den beiden Betriebsarten der Migration. Zellen in späteren Explantate verlieren ihre Fähigkeit, rasch und gemeinsam wandern, wenn eine epitheliale mesenchymalen Übergang auftritt und Genen mit der Wundheilung und Entzündung verbunden sind, differentiell exprimierten. Somit kann Keratozyten Explantate als in vitro-Modell für die Reepithelialisierung die kutanen Wundheilung auftritt, und kann ein einzigartiges System zur Mechanismen kollektiver Zellmigration im Rahmen eines definierten Programms von Veränderungen der Genexpression zu studieren repräsentieren dienen. Eine Vielzahl von Mutanten und transgene Zebrafischlinien zur Verfügung, die Explantate von Fisch mit verschiedenen genetischen Hintergründen festgelegt werden kann. Dies ermöglicht es die Rolle von verschiedenen Proteinen innerhalb dieser Prozesse eindeutig adressiert werden. Die hier aufgeführten Protokolle beschreiben eine einfache und effektive Methode zur Festlegung dieser Explantatkulturen für den Einsatz in einer Vielzahl von Assays auf Kollektiv Zelle Migration.

Wie in Figur 1 dargestellt ist, können Blätter von Keratozyten Migration aus unter der Skala innerhalb von Stunden nach Errichtung der Explantatkultur beachten. Gelegentlich kann ein individuell Migration Keratozyten, die aus dem gemeinsam Migration Blatt weggebrochen wurde, einzuhalten ist. Zusätzlich, da das Explantat von einem Fisch, der zuvor gezupft worden hergestellt ist, gibt es reichlich Neutrophilen migrieren durch die Folie. Bei längeren Kulturzeiträume, die Keratozyten Blatt Fragmente al...

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Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Zebrabärbling Keratozyten migrieren in Zellschichten aus Explantaten und stellen eine in vitro-Modell für die Untersuchung der Mechanismen der kollektiven Zellmigration im Rahmen der epithelialen Wundheilung. Diese Protokolle Detail ein effektiver Weg zur primären Explantatkulturen für den Einsatz in kollektive Zellmigrationsassays herzustellen.

Zebrafisch Keratozyten Explantate auf Collective Zellmigration und Reepithelialisierung in kutane Wundheilung Studieren

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.9K Aufrufe.  Midwestern University.  Zebrabärbling Keratozyten migrieren in Zellschichten aus Explantaten und stellen eine in vitro-Modell für die Untersuchung der Mechanismen der kollektiven Zellmigration im Rahmen der epithelialen Wundheilung. Diese Protokolle Detail ein effektiver Weg zur primären Explantatkulturen für den Einsatz in kollektive Zellmigrationsassays herzustellen. 

Serie: Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.

The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

Optimierung der Wund Scratch Assay auf Änderungen in Murine mesenchymale Stromazellen Zellmigration Detect nach der Beschädigung durch lösliche Cigarette Smoke Extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

Stammzell-ähnlichen<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Explantate bis Früh Neurale Entwicklungs- Eigenschaften Studieren<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In-vivo-</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

Analyzing<em&gt; In Vivo</em&gt; Zellmigration unter Verwendung von Zelltransplantationen und Zeitraffer-Imaging in Zebrafischembryonen

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.

Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.

Entwicklung einer fibrotischen Leber Modell in Zebrabärbling Ethanol-induzierte zur Untersuchung Progenitor-vermittelte Zell Hepatozyten-Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene therapy in organ-cultured corneas. The diabetic corneal disease is a complication of diabetes with frequent abnormalities of corneal nerves and epithelial wound healing. We have also documented significantly altered expression of several putative epithelial stem cell markers in human diabetic corneas. To alleviate these changes, adenoviral gene therapy was successfully implemented using the upregulation of c-met proto-oncogene expression and/or the downregulation of proteinases matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) and cathepsin F. This therapy accelerated wound healing in diabetic corneas even when only the limbal stem cell compartment was transduced. The best results were obtained with combined treatment. For possible patient transplantation of normalized stem cells, an example is also presented of the optimization of gene transduction in stem cell-enriched cultures using polycationic enhancers. This approach may be useful not only for the selected genes but also for the other mediators of corneal epithelial wound healing and stem cell function.

An example of adenoviral gene therapy in the human diabetic organ-cultured corneas is presented towards the normalization of delayed wound healing and markedly reduced epithelial stem cell marker expression in these corneas. It also describes the optimization of this process in stem cell-enriched limbal epithelial cultures.

Adenoviralen Gentherapie für diabetische Keratopathie: Auswirkungen auf die Wundheilung und Zellmarker Expression in Human Organ kultivierten Hornhäute und Limbale Epithelial Stammzellen

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The M&#252;ller glia re-enter the cell cycle and produce neuronal progenitor cells that undergo subsequent rounds of cell divisions and differentiate into the lost neuronal cell types. Both M&#252;ller glia and neuronal progenitor cell nuclei replicate their DNA and undergo mitosis in distinct locations of the retina, i.e. they migrate between the basal Inner Nuclear Layer (INL) and the Outer Nuclear Layer (ONL), respectively, in a process described as Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM has predominantly been studied in the developing retina. To examine the dynamics of INM in the adult regenerating zebrafish retina in detail, live-cell imaging of fluorescently-labeled M&#252;ller glia/neuronal progenitor cells is required. Here, we provide the conditions to isolate and culture dorsal retinas from Tg[gfap:nGFP]mi2004 zebrafish that were exposed to constant intense light for 35 h. We also show that these retinal cultures are viable to perform live-cell imaging experiments, continuously acquiring z-stack images throughout the thickness of the retinal explant for up to 8 h using multiphoton microscopy to monitor the migratory behavior of gfap:nGFP-positive cells. In addition, we describe the details to perform post-imaging analysis to determine the velocity of apical and basal INM. To summarize, we established conditions to study the dynamics of INM in an adult model of neuronal regeneration. This will advance our understanding of this crucial cellular process and allow us to determine the mechanisms that control INM.

Zebrafish retinal regeneration has mostly been studied using fixed retinas. However, dynamic processes such as interkinetic nuclear migration occur during the regenerative response and require live-cell imaging to investigate the underlying mechanisms. Here, we describe culture and imaging conditions to monitor Interkinetic Nuclear Migration (INM) in real-time using multiphoton microscopy.

Kultur von Adult transgener Zebrafische Retinal Explantate für das Live-Cell-Imaging von Multiphotonen-Mikroskopie

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor metastasis. In this assay, cells are grown to form a confluent monolayer and a mechanical wound is created by scratching with a device. Then the migration rate of the cells towards the denuded area can be monitored by imaging. Our 8-channel mechanical wounder is designed to tackle most of the problems associated with the cell migration assay. Firstly, our wounder can be easily sterilized by autoclaving or with common disinfectants. Secondly, the individual adjustable pins allow even contact with the cell culture plate so that sharp and reproducible wounds can be created. Thirdly, the guiding bars on both sides of the wounder ensure consistent wounding position in each well. The use of disposable plastic pipette tips for wounding can further provide better handling of the wounder as well as to minimize cross-contamination. In conclusion, our cell wounder can provide researchers with a user friendly and reproducible device for performing the cell migration assay using the standard 96-well culture plate.

Here, we present a protocol to perform a semi-high throughput cell migration assay on a 96-well cell culture plate. This protocol is a fast, simple and economical method to create consistent scratch wounds on a cell monolayer.

Eine Vorrichtung zur Durchführung Zellmigration / Wundheilung in einer 96-Well-Platte

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

Ganz-Mount-In-Situ-Hybridisierung in Zebrafisch-Embryonen und Tube-Formations-Assay in iPSC-ECs zur Untersuchung der Rolle von Endoglin in der Gefäßentwicklung

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it contains more than the diploid copy of its chromosomes, which is a result of endoreplication or cell fusion. In tissue repair, wound-induced polyploidization (WIP) has been found to be a conserved healing strategy from fruit flies to vertebrates. WIP has several advantages over cell proliferation, including resistance to oncogenic growth and genotoxic stress. The challenge has been to identify why polyploid cells arise and how these unique cells function. Provided is a detailed protocol to study WIP in the adult fruit fly epithelium where polyploid cells are generated within 2 days after a puncture wound. Taking advantage of D. melanogaster&#39;s extensive genetic tool kit, the genes required to initiate and regulate WIP, including Myc, have begun to be identified. Continued studies using this method can reveal how other genetic and physiological variables including sex, diet, and age regulate and influence WIP&#39;s function.

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Wound-induced polyploidization is a conserved tissue repair strategy where cells grow in size instead of dividing to compensate for cell loss. Here is a detailed protocol on how to use the fruit fly as a model to measure ploidy and its genetic regulation in epithelial wound repair.

Ein Drosophila-Modell zur Untersuchung der Wund-induzierten Polyploidisierung

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it ...

Murine Excisional Wound Healing Model and Histological Morphometric Wound Analysis

The murine excisional wound model has been used extensively to study each of the sequentially overlapping phases of wound healing: inflammation, proliferation and remodeling. Murine wounds have a histologically well-defined and easily recognizable wound bed over which these different phases of the healing process are measurable. Within the field, it is common to use an arbitrarily defined &#8220;middle&#8221; of the wound for histological analyses. However, wounds are a three-dimensional entity and often not histologically symmetrical, supporting the need for a well-defined and robust method of quantification to detect morphometric defects with a small effect size. In this protocol, we describe the procedure for creating bilateral, full-thickness excisional wounds in mice as well as a detailed instruction on how to measure morphometric parameters using an image processing program on select serial sections. The two-dimension measurements of wound length, epidermal length, epidermal area, and wound area are used in combination with the known distance between sections to extrapolate the three-dimension epidermal area covering the wound, overall wound area, epidermal volume and wound volume. Although this detailed histological analysis is more time and resource consuming than conventional analyses, its rigor increases the likelihood of detecting novel phenotypes in an inherently complex wound healing process.

This protocol describes how to generate bilateral, full-thickness excisional wounds in mice and how to subsequently monitor, harvest, and prepare the wounds for morphometric analysis. Included is an in-depth description of how to use serial histological sections to define, precisely quantify and detect morphometric defects.