We thank members of the UNC Zebrafish Aquaculture facility for maintenance of the zebrafish. We would also like to thank Diagnosys, LLC for assistance with the setup of the ERG apparatus. Additional thanks go to Dr. Portia McCoy and the laboratory of Dr. Ben Philpot for assistance with electrophysiological methods. We also wish to thank Lizzy Griffiths for her illustration of a larval zebrafish. This work was supported by National Institutes of Health awards F32 EY022279 (to J.D.C) and R21 EY019758 (to E.R.W).

Mantenimento degli animali e protocolli sperimentali sono stati approvati dalla cura e utilizzo dei Comitati animali istituzionale della University of North Carolina a Chapel Hill, e soddisfano tutte le esigenze dell&#39;Ufficio NIH di laboratorio Animal Welfare e l&#39;Associazione per la valutazione e l&#39;accreditamento del laboratorio Animal Care International. NOTA: Per ottenere le larve di analisi ERG, pubblicato protocolli per la zootecnia zebrafish norma e manutenzione sono stati impiegati 18. Le larve sono ottenuti attraverso l&#39;allevamento naturale e ospitato sotto una luce 14 ore / 10 ore ciclo scuro. Questo protocollo è stato ottimizzato per le larve in 5-7 giorni dopo la fecondazione (DPF), ma potrebbe essere idealmente eseguite sul pesce più vecchio con piccole modifiche alla procedura. Qui, utilizzare il ceppo TL di wild-type larve di zebrafish a 5 dpf. 1. Micropipetta Produzione <ol><li> Tirare diversi micropipette con 1,5 x 0,86 millimetri (diametro esterno da diametro interno) capillari in vetro borosilicato fuoco lucido confilamento (temperatura di fusione, 821 ° C) e un P-97 Flaming / Brown Micropipetta Estrattore dotato di filamento calore scatola. Utilizzare il programma per modellare micropipette descritti nella tabella 1. </li><li> Controllare ogni micropipetta al microscopio con un appropriato righello reticolo per garantire che suggerimenti sono di 10-15 micron di diametro ed ha un&#39;apertura punta liscia (cioè, senza bordi frastagliati). </li><li> Conservare con cura micropipette per evitare danni punta e l&#39;esposizione alla polvere. Le opzioni di memorizzazione includono piastre di Petri con del nastro di laboratorio, scatole di schiuma rivestita, o contenitori micropipetta disponibili in commercio. NOTA: Altri estrattori micropipetta di vetro e capillari possono essere usati fino a quando il corretto diametro della micropipetta e una punta di alta qualità è ottenuta. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Pressione </td><td> Calore </td><td> Tirare </td><td> Velocità </td&gt; <td> Tempo </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 560 </td><td> - </td><td> 30 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 450 </td><td> - </td><td> 30 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 410 </td><td> 55 </td><td> 40 </td><td> 200 </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Programma per la produzione di micropipette con un P-97 Flaming / marrone Micropipetta Estrattore dotato di un filamento di calore casella micropipette sono realizzati con 1,5 x 1,0 mm 2 (diametro esterno dal diametro interno) capillari di vetro borosilicato ribruciate con filamento. (temperatura di fusione, 821 ° C). 2. Buffer Preparazione <ol><li> Utilizzare filtrato, tampone ossigenato pesci rossi di Ringer 19 nella microelettrodo capillare e saturare la spugna alcool polivinilico (PVA) su cui le larve sono collocati per esperimenti. In alternativa, utilizzare E3<html> supporti embrione o soluzione salina bilanciata di Hank. </li><li> Preparare la soluzione 10x pesci rossi di Ringer, come descritto nella Tabella 2. Regolare a pH 7,8, e sterilizzare utilizzando un filtro 0,22 micron e conservare lo stock 10x a 4 ° C. </li><li> Creare una soluzione di lavoro il giorno dell&#39;esperimento diluendo la soluzione di Ringer 10x a 1x con deionizzata, acqua distillata. Filtrare su un filtro di 0,22 micron. Ossigenare insufflando 95% O 2/5% CO 2 gas per 10 minuti. Cap strettamente seguito per garantire che la soluzione rimane ossigenato. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> NaCl </td><td> 1.25 M </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 26 mm </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 25 MM </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> glucosio </td><td> 100 MM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 100 MM </td></tr></tbody></table>jove_content &quot;&gt; Tabella 2: Preparazione della soluzione di 10x pesci rossi di Ringer. 3. Elettroretinogramma Platform <ol><li> Eseguire esperimenti ERG su un tavolo antivibrante all&#39;interno di una gabbia di Faraday per migliorare il rapporto segnale-rumore. Allegare una piattaforma in acciaio personalizzato al tavolo anti-vibrazioni con dadi esagonali. Inserire una piattaforma mobile di plastica con un polimero uretanico ammortizzante inferiore viscoelastico sul tavolo sotto la sorgente luminosa. </li><li> Posizionare la fotocamera con uno stand magnetizzato, volto giù alla piattaforma mobile di plastica. Posizionare il micromanipolatore (che eserciterà la microelettrodo registrazione) con un secondo supporto magnetizzato alla destra della piattaforma mobile di plastica. Assicurarsi che la fotocamera e micromanipolatore non saranno disturbati dal movimento di altre apparecchiature e che non blocchino illuminazione dalla sorgente luminosa. </li><li> Collegare la fotocamera a un monitor video e posizionarla per visualizzare l&#39;occhio dellarva per collocare l&#39;elettrodo nella posizione corretta. </li><li> Assicurarsi che l&#39;impostazione sia collegato a terra con filo di rame. Per controllare il rumore, collocare l&#39;elettrodo di riferimento e punta del microelettrodo registrazione in una piastra di Petri 35 millimetri riempito con soluzione di Ringer. Controllare i livelli di rumore elettrici della configurazione con un oscilloscopio o una funzione incorporata dell&#39;apparato ERG. I livelli di rumore dovrebbero essere non più di ± 10 mV dal basale. </li></ol> 4. Sponge Preparazione <ol><li> Tagliare un piccolo rettangolo di spugna PVA secca che si inserisce perfettamente in una capsula di Petri da 35 mm. Lo spessore della spugna non deve essere maggiore della profondità del piatto. Usare un taglierino con una lama di rasoio pulito per il taglio. </li><li> Effettuare un taglio aggiuntivo nella spugna per accogliere l&#39;elettrodo di riferimento (un taglio superficiale longitudinale sul fondo della spugna o una farfalla tagliato verticalmente attraverso una delle estremità inferiori). </li><li> Utilizzare un marcatore resistente agli agenti chimiciper contrassegnare un puntino sulla spugna (dove verrà posizionata la larva) che può essere utilizzato per il posizionamento della telecamera. </li><li> Immergere la spugna PVA in soluzione di Ringer fino a saturazione. Rimuovere e asciugare rapidamente su un tovagliolo di carta 2-3 volte. Posizionare la spugna in un ambiente pulito 35 millimetri piastra di Petri. </li><li> Posizionare il piatto Petri contenente la spugna sulla piattaforma di plastica in modo che il marchio può essere visualizzata dalla telecamera. </li></ol> 5. elettrodi Preparazione NOTA: La configurazione zebrafish è costituito da un elettrodo di riferimento in contatto con la soluzione satura di PVA spugna del Ringer e un elettrodo di registrazione a contatto con la cornea. L&#39;elettrodo di riferimento costituito da un pellet Ag / AgCl. L&#39;elettrodo di registrazione è una micropipetta di vetro tirato riempito con soluzione di Ringer e tenuto da un supporto microelettrodo contenente un filo di Ag. <ol><li> Cloruro gli elettrodi, mettetelo a bagno in 6-9 ipoclorito% di sodio (candeggina) per 5 min (il MICR registrazioneoelectrode fili) o 15 minuti (l&#39;elettrodo di riferimento). Aria secca su un Kimwipe per 5 min. <ol><li> A seconda dello stile di taglio effettuato nel passo 4.2, posizionare il pellet Ag / AgCl dell&#39;elettrodo di riferimento in (per la farfalla taglio verticale) o sotto (per il taglio superficiale longitudinalmente sul fondo) la spugna. Attaccare il cavo elettrodo di riferimento al sistema di registrazione. </li><li> In alternativa, se l&#39;impostazione ERG ha vincoli di spazio o ci sono particolarmente forti artefatti fotovoltaici dall&#39;elettrodo Ag / AgCl, collegare l&#39;elettrodo di riferimento sulla spugna attraverso un ponte salino agar per spostare l&#39;elettrodo dal percorso ottico. </li></ol></li><li> Attaccare ~ 40 cm di tubo di dimensioni appropriate per una siringa da 5 ml di blocco non-Luer. Riempire la siringa con soluzione di Ringer. Titolari di microelettrodi possesso prese di pressione vengono spediti con adattatori per ospitare tubi con diametri interni di 1/16 &quot;, 3/32&quot;, 1/8 &quot;o 5/32&quot;. </li><li> Riempire un 1 ml non Luer Siringa serratura conSoluzione di Ringer e, utilizzando un Micro-fil, riempire accuratamente il supporto microelettrodo. Evitare la formazione di bolle. </li><li> Attaccare la siringa da 5 ml di porta di pressione del titolare microelettrodo con tubi e utilizzarla per garantire che il titolare microelettrodo è pieno di soluzione di Ringer. Utilizzando il Micro-fil e la siringa da 1 ml riempita con soluzione di Ringer, riempire il bicchiere micropipetta dalla punta e accertarsi che non siano presenti bolle. </li><li> Fissare la micropipetta di vetro al titolare microelettrodo, facendo attenzione a mantenere il dritto filo elettrodo. Una volta fissato, utilizzare la siringa 5 ml di forzare accuratamente soluzione di Ringer attraverso il microelettrodo fino ad una piccola quantità di soluzione è visibile sulla punta. Applicazione occasionale della pressione alla siringa (quando non è applicata alla cornea) impedirà la formazione di bolle d&#39;aria, nonché occlusioni dovute alla polvere o accumulo di sali, nella punta micropipetta. <ol><li> Se la soluzione viene fuori come un flusso, sostituire la gmicropipetta lass, come l&#39;apertura punta è troppo grande o è danneggiato. </li></ol></li><li> Posizionare con cura il microelettrodo registrazione nel micromanipolatore e collegare il cavo al sistema di registrazione. </li></ol> 6. Analisi Elettroretinogramma NOTA: A causa del predominio cono della retina larvale, risultati di ERG di alta qualità possono essere ottenuti quando i preparativi per la registrazione vengono eseguite sotto bassi livelli di luce bianca indiretta (&lt;1 lux) o con brevi periodi (&lt;1 min) di maggiore intensità ( ≤250 lux) Luce di lavoro. È quindi richiesto un breve periodo di adattamento al buio prima della registrazione (vedere il passaggio 6.7). Tuttavia, gli esperimenti possono essere eseguiti in fioca luce rossa o infrarossa utilizzando una telecamera a raggi infrarossi sensibile. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in (0,22 micron) di acqua sistema di filtraggio-sterilizzato dal Fondo UNC Zebrafish acquacoltura, i media alternativi di embrioni possono essere utilizzati. <ol><li> Tagliare asciugamani di carta quadrato di misura di circa 1cm 2. </li><li> Se misurazione isolato potenziale recettore massa cono, incubare 3-5 larve in acqua sistema con 500 pM (±) -2-Amino-4-fosfonobutirrico acido (APB) per 5 min. NOTA: Mentre APB è una miscela racemica di attivo (L) e inattive (R) forme di AP4, è efficace come L-AP4 ed è meno costoso. </li><li> Anestetizzare 3-5 larve in acqua sistema con 0,02% (w / v) Tricaine fino risponde, circa 1-2 min. </li><li> Utilizzare una pompa pipetta e pipetta Pasteur per trasferire con attenzione larve individuale su carta assorbente quadrati sotto uno stereoscopio dissezione con illuminazione minima (≤250 lux per &lt;1 min). Controllare la posizione di ogni larva e scegliere un candidato che è dorsale verso l&#39;alto con un occhio non occluse. <ol><li> Per le registrazioni estese (&gt; 30 min), mantenere la larva umido dal vetro il corpo fino a, ma non compresa la testa con 3% metilcellulosa con un pennello fine di peli di cammello. </li></ol></li><li> Utilizzando pinze, trasferire il tovagliolo di carta piae con la larva alla spugna umida PVA. <ol><li> Per le registrazioni estese (&gt; 30 min), applicare un flusso continuo di saturo d&#39;acqua 100% O 2 gas sopra la larva facendo gorgogliare il gas attraverso una pietra porosa in un pallone braccio laterale contenente acqua distillata. Posizionare il tubo uscita dal braccio laterale pallone che convoglia l&#39;ossigeno umidificato vicino alla testa del larva. NOTA: Passo 6.4.1 e 6.5.1 passo sarà prolungare la vita dei pesci 16. </li></ol></li><li> Sotto illuminazione minima, utilizzare il micromanipolatore e fotocamera per posizionare la punta microelettrodo a metà tra il nasale e le estremità caudale dell&#39;occhio e premere delicatamente sul limite dorsale della cornea. NOTA: smarrimento della punta dell&#39;elettrodo alle zone distali lontano della cornea può provocare ERG forme d&#39;onda di polarità invertita. </li><li> Lasciare larva di dark-adattamento per 5-10 min. </li><li> Registra le risposte di prova in flash per luce fornita da una sorgente luminosa a LED o stimolatore ottico utilizzando il Available stimolazione e registrazione attrezzature. Regolare i parametri del protocollo come l&#39;intensità del flash, lunghezza flash, il colore del flash, l&#39;intensità e il colore di sfondo e filtro impostazioni per adattarsi l&#39;esperimento. </li><li> Al termine con l&#39;esperimento, eutanasia larve secondo le linee guida AVMA / IACUC. </li></ol>

<ol>
	<li>Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The retina: an approachable part of the brain. , (1987).</li><li>Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inexpensive+device+for+non-invasive+electroretinography+in+small+aquatic+vertebrates.">An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates.</a> J Neurosci. Methods. 135, 205-210 (2004).</li><li>Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-evoked+responses+of+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium.</a> J Neurophysiol. 91, 1134-1142 (2004).</li><li>Heckenlively, J. R., Arden, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles and Practice of Clinical Electrophysiology of Vision. , (2006).</li><li>Perlman, I., Kolb, H., Nelson, R., Fernandez, E., Jones, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , (1995).</li><li>Fadool, J. M., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+a+model+system+for+the+study+of+eye+genetics.">Zebrafish: a model system for the study of eye genetics.</a> ProgRetin. Eye Res. 27, 89-110 (2008).</li><li>Doerre, G., Malicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+photoreceptor+cell+development+in+the+zebrafish+retina.">Genetic analysis of photoreceptor cell development in the zebrafish retina.</a> Mech. Dev. 110, 125-138 (2002).</li><li>Brockerhoff, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+stimulates+a+transducin-independent+increase+of+cytoplasmic+Ca2++and+suppression+of+current+in+cones+from+the+zebrafish+mutant+nof.">Light stimulates a transducin-independent increase of cytoplasmic Ca2+ and suppression of current in cones from the zebrafish mutant nof.</a> J Neurosci. 23, 470-480 (2003).</li><li>Rinner, O., Makhankov, Y. V., Biehlmaier, O., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+cone-specific+kinase+GRK7+in+larval+zebrafish+leads+to+impaired+cone+response+recovery+and+delayed+dark+adaptation.">Knockdown of cone-specific kinase GRK7 in larval zebrafish leads to impaired cone response recovery and delayed dark adaptation.</a> Neuron. 47, 231-242 (2005).</li><li>Harada, T., Harada, C., Parada, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+visual+system+development:+more+than+meets+the+eye.">Molecular regulation of visual system development: more than meets the eye.</a> Genes Dev. 21, 367-378 (2007).</li><li>Branchek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+photoreceptors+in+the+zebrafish,+brachydaniorerio.+II.+Function.">The development of photoreceptors in the zebrafish, brachydaniorerio. II. Function.</a> J Comp Neurol. 224, 116-122 (1984).</li><li>Schmitt, E. A., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+retinal+development+in+the+zebrafish,+Daniorerio:+light+and+electron+microscopic+analyses.">Early retinal development in the zebrafish, Daniorerio: light and electron microscopic analyses.</a> J Comp Neurol. 404, 515-536 (1999).</li><li>Bilotta, J., Saszik, S., Sutherland, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod+contributions+to+the+electroretinogram+of+the+dark-adapted+developing+zebrafish.">Rod contributions to the electroretinogram of the dark-adapted developing zebrafish.</a> Dev Dyn. 222, 564-570 (2001).</li><li>Wong, K. Y., Adolph, A. R., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+bipolar+cell+input+mechanisms+in+giant+danio.">Retinal bipolar cell input mechanisms in giant danio.</a> I. Electroretinographic analysis. J Neurophysiol. 93, 84-93 (2005).</li><li>Nelson, R. F., Singla, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spectral+model+for+signal+elements+isolated+from+zebrafish+photopicelectroretinogram.">A spectral model for signal elements isolated from zebrafish photopicelectroretinogram.</a> Vis Neurosci. 26, 349-363 (2009).</li><li>Korenbrot, J. I., Mehta, M., Tserentsoodol, N., Postlethwait, J. H., Rebrik, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EML1+(CNG-modulin)+controls+light+sensitivity+in+darkness+and+under+continuous+illumination+in+zebrafish+retinal+cone+photoreceptors.">EML1 (CNG-modulin) controls light sensitivity in darkness and under continuous illumination in zebrafish retinal cone photoreceptors.</a> J Neurosci. 33, 17763-17776 (2013).</li><li>Gurevich, L., Slaughter, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+waveforms+of+the+ON+bipolar+neuron+and+the+b-wave+of+the+electroretinogram.">Comparison of the waveforms of the ON bipolar neuron and the b-wave of the electroretinogram.</a> Vision Res. 33, 2431-2435 (1993).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Daniorerio). , (2007).</li><li>Kim, D. Y., Jung, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junction+contributions+to+the+goldfish+electroretinogram+at+the+photopic+illumination+level.">Gap junction contributions to the goldfish electroretinogram at the photopic illumination level.</a> Korean J PhysiolPharmacol. 16, 219-224 (2012).</li><li>Brockerhoff, S. E., Dowling, J. E., Hurley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+retinal+mutants.">Zebrafish retinal mutants.</a> Vision Res. 38, 1335-1339 (1998).</li><li>Naka, K. I., Rushton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-potentials+from+colour+units+in+the+retina+of+fish+(Cyprinidae).">S-potentials from colour units in the retina of fish (Cyprinidae).</a> J Physiol. 185, 536-555 (1966).</li><li>Naka, K. I., Rushton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-potentials+from+luminosity+units+in+the+retina+of+fish+(Cyprinidae).">S-potentials from luminosity units in the retina of fish (Cyprinidae).</a> J Physiol. 185, 587-599 (1966).</li><li>Shao, X. M., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-agar+salt+bridge+in+patch-clamp+electrode+holder+stabilizes+electrode+potentials.">Micro-agar salt bridge in patch-clamp electrode holder stabilizes electrode potentials.</a> J Neurosci. Methods. 159, 108-115 (2007).</li><li>Brockerhoff, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+behavioral+screen+for+isolating+zebrafish+mutants+with+visual+system+defects.">A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects.</a> ProcNatlAcadSci. U S A. 92, 10545-10549 (1995).</li><li>Fleisch, V. C., Jametti, T., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroretinogram+(ERG)+Measurements+in+Larval+Zebrafish.">Electroretinogram (ERG) Measurements in Larval Zebrafish.</a> CSH protocols. , (2008).</li><li>Seeliger, M. W., Rilk, A., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ganzfeld+ERG+in+zebrafish+larvae.">Ganzfeld ERG in zebrafish larvae.</a> Doc Ophthalmol. 104, 57-68 (2002).</li><li>Kainz, P. M., Adolph, A. R., Wong, K. Y., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lazy+eyes+zebrafish+mutation+affects+M&#252;ller+glial+cells,+compromising+photoreceptor+function+and+causing+partial+blindness.">Lazy eyes zebrafish mutation affects M&#252;ller glial cells, compromising photoreceptor function and causing partial blindness.</a> J Comp Neurol. 463, 265-280 (2003).</li><li>Lewis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Celsr3+is+required+for+normal+development+of+GABA+circuits+in+the+inner+retina.">Celsr3 is required for normal development of GABA circuits in the inner retina.</a> PLoS. genetics. 7, e1002239 (2011).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In questo protocollo una procedura semplice per ERG registrazioni di zebrafish larvale è dettagliata. Questa procedura consente una analisi rapida e completa di function.There visiva sono diversi passaggi critici della procedura che dovrebbe essere tenuto in considerazione. Le larve zebrafish deve essere in buona salute prima dell&#39;esperimento per evitare la morte durante i potenziali trattamenti farmacologici e garantire il sostentamento prolungata durante le registrazioni ERG. Inoltre, è importante che le larve u...

L&#39;elettroretinogramma (ERG) è un metodo elettrofisiologico invasivo che è stato ampiamente utilizzato in clinica per determinare la funzione della retina nell&#39;uomo. L&#39;attività elettrica in risposta ad uno stimolo luce viene misurata ponendo elettrodi di registrazione sulla superficie esterna della cornea. Le caratteristiche del paradigma stimolo e la forma d&#39;onda di risposta definiscono i neuroni retinici contribuiscono alla risposta. Questo metodo è stato adattato per l&#39;uso con un certo numero di modelli animali tra cui topi e zebrafish. La tipica risposta vertebrati ERG ha quattro componenti principali: l&#39;a-onda, che è un potenziale cornea-negative derivanti dall&#39;attività cellule fotorecettori; la b-wave, un potenziale positivo cornea derivato dal ON cellule bipolari; d-onda, un potenziale positivo cornea interpretato come l&#39;attività delle cellule bipolari OFF; e il c-onda, che si verifica alcuni secondi dopo la b-wave e riflette l&#39;attività in Müller glia e il retinale pigmento epitelio 1-4. Ulteriori riferimenti per la comprensione della storia e dei principi di analisi ERG negli esseri umani e modelli animali sono il libro di testo on line, WebVision, presso la University of Utah e testi, come i Principi e Pratica di Elettrofisiologia clinica di Vision 4, 5. Danio rerio (zebrafish) è stato a lungo favorita come un modello di sviluppo dei vertebrati, a causa della sua rapida maturazione e trasparenza, che permette l&#39;analisi morfologica non invasiva dei sistemi d&#39;organo, test comportamentali e sia in avanti e retromarcia schermi genetici (per la revisione, vedi Fadool e Dowling 6). Larve Zebrafish sono altamente suscettibili di manipolazione genetica e farmacologica, che, accoppiato con la loro alta fecondità, loro un ottimo modello animale per le analisi biologiche high-throughput fare. Il più alto rapporto di coni di canne in zebrafish larvale - circa 1: 1 rispetto ai topi (~ 3% a conos) - renderli particolarmente utile per lo studio della funzione cono 7-9. Nella retina dei vertebrati, coni sviluppano prima di aste 10. È interessante notare che, coni zebrafish sono operativi già dal 4 dpf, consentendo selettiva analisi elettrofisiologiche di coni in quella fase 6, 11,12. Al contrario, le risposte ERG a barre compaiono tra 11 e 21 dpf 13. Pertanto, larve di zebrafish 4-7 dpf servire funzionalmente come retina all-cono. Tuttavia, il nativo fotopico risposta ERG di 4-7 dpf larve è dominato dalla b-wave. Applicazione di agenti farmacologici, quali L - (+) - 2-ammino-4-fosfono-butirrico (L-AP4), un agonista per il glutammato metabotropici (mGluR6) recettore espresso dalla ON cellule bipolari, blocca efficacemente la generazione del B-wave e rivela il potenziale isolato massa cono recettore, (la &quot;a-wave&quot;) 14-17. Qui si descrive un semplice e reliablMetodo e per l&#39;analisi ERG utilizzando disponibili in commercio apparecchiature ERG progettato per l&#39;utilizzo con i topi che sono stati concepiti per essere utilizzati con le larve di zebrafish. Questo sistema può essere utilizzato su larve zebrafish di varia background genetici, così come quelli trattati con agenti farmacologici, per aiutare i ricercatori nella identificazione di vie di segnalazione che contribuiscono alla sensibilità visiva e adattamento alla luce 16. Le procedure sperimentali descritte in questo protocollo guideranno gli investigatori in uso dell&#39;analisi ERG per rispondere a una serie di domande biologiche relative alla visione, e dimostrare la costruzione di una configurazione flessibile, ERG.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2170">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"><a name="RANGE!A1:D30">Name of the Material/Equipment</a></td>
			<td style="width:168px;">Company</td>
			<td style="width:165px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:1504px;">Comments/ Description (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Faraday cage</td>
			<td>80/20 Inc</td>
			<td>custom</td>
			<td>Custom designed aluminum &#34;Industrial Erector Set&#34; for Cage framework</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PVA sponge</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B000ZOWG1C</td>
			<td>Provides a soft, moist platform for placement of zebrafish larvae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">150 ml Sterile Filter systems</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431154</td>
			<td>Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Espion E2</td>
			<td>Diagnosys, LLC</td>
			<td>contact</td>
			<td>Modular electrophysiology system capable of generating visual stimuli for any stimulator and digital recording and analysis of responses using propietary software, more information at http://www.diagnosysllc.com</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Colordome</td>
			<td>Diagnosys, LLC</td>
			<td>contact</td>
			<td>Light stimulator with RGB LED and Xenon light sources for Ganzfeld ERG, more information at http://www.diagnosysllc.com</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micromanipulator</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-024-R</td>
			<td>Holding and positioning the recording microelectrode</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnetic ring stand</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-025-MB</td>
			<td>Holding and positioning of the camera and refrence electrode</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lead extensions</td>
			<td>Grass Technologies</td>
			<td>F-LX</td>
			<td>Spare female to male 1.5 mm lead cables for connecting electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:333px;">Male Pin to Female SAFELEAD Adaptor</td>
			<td>Grass Technologies</td>
			<td>DF-215/10</td>
			<td>Connecting 2 mm pins to 1.5 headboard pins</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Window screen frame (metal) and spline</td>
			<td>Lowes or Home Depot</td>
			<td>various</td>
			<td>For attaching copper mesh to Faraday cage framework</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Steriflip 50 ml filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td>Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BNC adaptor</td>
			<td>Monoprice</td>
			<td>4127</td>
			<td>Connecting camera to BNC cable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BNC cable</td>
			<td>Monoprice</td>
			<td>626</td>
			<td>Connecting camera to video adaptor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Camera lens</td>
			<td>Navitar</td>
			<td>1582232</td>
			<td>Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Camera coupler</td>
			<td>Navitar</td>
			<td>1501149</td>
			<td>Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luna BNC to VGA + HDMI Converter</td>
			<td>Sewell</td>
			<td>SW-29297-PRO</td>
			<td>BNC to VGA adaptor allowing camera image to project on computer monitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">APB</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1910</td>
			<td>mGluR6 agonist, blocks b-wave allowing analysis of the isolated cone mass receptor potential</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Borosilicate glass</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BF-150-86-10</td>
			<td>Fire- polished borosilicate glass (metling temperature = 821&#176;C) with filament and dimensions of 1.5mm x 0.86 mm (outer diameter by inner diameter)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">P97 Flaming/Brown puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P97</td>
			<td>For pulling glass micropipettes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sorbothane sheet</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SB12A</td>
			<td>Synthetic viscoelastic urethane polymer, placed under Passive Isolation Mounts and ERG platform to absorb shock and prevent slipping, can be cut to size</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>B2436F</td>
			<td>Vibration isolation platfrom for ERG stimulator and zebrafish specimen</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Passive Isolation Mounts</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PWA074</td>
			<td>Provides vibration isolation to breadboard</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Copper mesh</td>
			<td>TWP</td>
			<td>022X022C0150W36T</td>
			<td>To line Faraday Cage</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53502-233</td>
			<td>Used with Pasteur pipettes to carefully transfer zebrafish larvae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-608</td>
			<td>Used with Pipette pump to carefully transfer zebrafish larvae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Camera</td>
			<td>Watec</td>
			<td>WAT-902B</td>
			<td>Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tricaine (MS-222)</td>
			<td>Western Chemical</td>
			<td>Tricaine-S</td>
			<td>Pharmaceutical-grade anesthetic,</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro-fil</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MF28G-5</td>
			<td>Filling microelectrode holder and microelectrode glass</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microelectrode holder</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MEH2SW15</td>
			<td>Holds glass microelectrode, connects to ERG equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reference Electrode</td>
			<td>WPI</td>
			<td>DRIREF-5SH</td>
			<td>Carefully break off last centimeter of casing to drain electrolyte and expose sintered Ag/AgCl pellet electrode</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reference Electrode (alternative)</td>
			<td>WPI</td>
			<td>EP1</td>
			<td>Alternative to DRIREF-5SH. Ag/AgCl electrode that must be wired/soldered to connecting lead</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Low-noise cable for Microelectrode holder</td>
			<td>WPI</td>
			<td>13620</td>
			<td>Connecting recording microelctrode holder to adaptor/headboard</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroretinogram analysis of the visual response in zebrafish larvae

L&#39;elettroretinogramma (ERG) è un metodo non invasivo per determinare elettrofisiologico funzione retinica. Attraverso il posizionamento di un elettrodo sulla superficie della cornea, attività elettrica generata in risposta alla luce può essere misurato e utilizzato per valutare l&#39;attività di cellule retiniche in vivo. Questo manoscritto descrive l&#39;uso della ERG per misurare la funzione visiva in zebrafish. Zebrafish sono stati a lungo utilizzato come modello per lo sviluppo vertebrato a causa della facilità di soppressione genica mediante oligonucleotidi morfolino e manipolazione farmacologica. A 5-10 dpf, solo coni sono funzionali nella retina larvale. Pertanto, il zebrafish, a differenza di altri animali, è un potente sistema modello per lo studio della funzione visiva cono in vivo. Questo protocollo utilizza l&#39;anestesia standard micromanipolazione e protocolli stereomicroscopia che sono comuni nei laboratori che eseguono la ricerca zebrafish. I metodi di cui fanno uso di eq elettrofisiologia normaAZIONE e una telecamera a bassa luce per guidare il posizionamento della microelettrodo di registrazione sulla cornea larvale. Infine, si dimostra come un disponibile in commercio ERG stimolatore / registratore originariamente progettato per l&#39;uso con i topi possono essere facilmente adattato per l&#39;uso con zebrafish. ERG di zebrafish larvale fornisce un metodo eccellente per saggiare cono funzione visiva in animali che sono stati modificati da morpholino iniezione oligonucleotide nonché nuove tecniche di ingegneria del genoma come zinco Finger nucleasi (ZFNs), Trascrizione Activator-Like Effector nucleasi (Talens), e cluster regolarmente intervallate brevi palindromo Ripete (CRISPR) / Cas9, i quali hanno notevolmente aumentato l&#39;efficienza e l&#39;efficacia del gene targeting in zebrafish. Inoltre, abbiamo approfittato della capacità di agenti farmacologici di penetrare larve zebrafish per valutare le componenti molecolari che contribuiscono alla fotorisposta. Questo protocollo delinea una configurazione che può essere modificato e utilizzato dai ricercatoricon diversi obiettivi sperimentali.

Tipicamente, ERG sono registrati da larve di zebrafish a 5 dpf, dal momento che un certo numero di studi hanno pubblicato le registrazioni ERG in questa fase 9, 16,20. Risposte larvali sono stati misurati in condizioni di oscurità adattato senza retroilluminazione utilizzando uno stimolo 20 msec di luce LED bianca. Abbiamo utilizzato un sistema di ERG disponibile in commercio costituito da uno stimolatore luce Ganzfeld e computer di controller / registratore. Lo stimolatore utilizza un sistema di modulazione...

Watch this Scientific Journal Video about Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae at JoVE.com

Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

Analisi elettroretinogramma della risposta visiva in Zebrafish larve

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

electroretinogram-analysis-of-the-visual-response-in-zebrafish-larvae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.5K Views.  University of North Carolina at Chapel Hill. We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

Video: Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualizzazione dei Propriorecettori in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve e pupe

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Ricerca

Neuroscienze

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the underlying neuronal components in the circuits1-6. Application of optogenetics7,8 in the larval neural circuit allows us to manipulate neuronal activity in spatially and temporally patterned ways9-13. Typically, specimens are broadly illuminated with a mercury lamp or LED, so specificity of the target neurons is controlled by binary gene expression systems such as the Gal4-UAS system14,15. In this work, to improve the spatial resolution to "sub-genetic resolution", we locally illuminated a subset of neurons in the ventral nerve cord using lasers implemented in a conventional confocal microscope. While monitoring the motion of the body wall of the semi-intact larvae, we interactively activated or inhibited neural activity with channelrhodopsin16,17 or halorhodopsin18-20, respectively. By spatially and temporally restricted illumination of the neural tissue, we can manipulate the activity of specific neurons in the circuit at a specific phase of behavior. This method is useful for studying the relationship between the activities of a local neural assembly in the ventral nerve cord and the spatiotemporal pattern of motor output.

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Here we describe a protocol for optogenetic manipulation of motoneuronal activity while monitoring changes in motor output (muscle contraction) in semi-intact Drosophila larvae using lasers within a conventional confocal microscope. This technique enables researchers to achieve local perturbation of neural activity in a few neuromeres to elucidate the dynamics of motor circuits.

Optogenetic Perturbazione di attività neurale con illuminazione laser in semi-intatte<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system measures spontaneous behaviors and the response to an aversive stimulus, which is shown to the larvae via a PowerPoint presentation. The recorded images are analyzed with an ImageJ macro, which automatically splits the color channels, subtracts the background, and applies a threshold to identify individual larvae placement in the lanes. We can then import the coordinates into an Excel sheet to quantify swim speed, preference for edge or side of the lane, resting behavior, thigmotaxis, distance between larvae, and avoidance behavior. Subtle changes in behavior are easily detected using our system, making it useful for behavioral analyses after exposure to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Our laboratory developed a novel high-throughput automated imaging system that is useful for the detection of several different behaviors in 7-day-old zebrafish larvae. The system can be used for detecting subtle changes in behavior after the larvae have been exposed to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Automatizzati high-throughput analisi comportamentali nelle larve Zebrafish

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

The Optokinetic Response as a Quantitative Measure of Visual Acuity in Zebrafish

Zebrafish are a proven model for vision research, however many of the earlier methods generally focused on larval fish or demonstrated a simple response. More recently adult visual behavior in zebrafish has become of interest, but methods to measure specific responses are new coming. To address this gap, we set out to develop a methodology to repeatedly and accurately utilize the optokinetic response (OKR) to measure visual acuity in adult zebrafish. Here we show that the adult zebrafish's visual acuity can be measured, including both binocular and monocular acuities. Because the fish is not harmed during the procedure, the visual acuity can be measured and compared over short or long periods of time. The visual acuity measurements described here can also be done quickly allowing for high throughput and for additional visual procedures if desired. This type of analysis is conducive to drug intervention studies or investigations of disease progression.

Zebrafish have been a valuable tool for many research areas. Here we demonstrate a method to elicit a visual response and calculate a functional visual acuity in the adult zebrafish.

La risposta Optokinetic come una misura quantitativa di acuità visiva in Zebrafish

Zebrafish are a proven model for vision research, however many of the  earlier methods generally focused on larval fish or demonstrated a simple  ...

Using the Electroretinogram to Assess Function in the Rodent Retina and the Protective Effects of Remote Limb Ischemic Preconditioning

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the retina. The ERG is a sensitive measure of changes in retinal function that are pan-retinal, but is less effective for detecting damage confined to a small area of retina. In the present work we describe how to record the &#8216;flash&#8217; ERG, which is the potential generated when the retina is exposed to a brief light flash. We describe methods of anaesthesia, mydriasis and corneal management during recording; how to keep the retina dark adapted; electrode materials and placement; the range and calibration of stimulus energy; recording parameters and the extraction of data. We also describe a method of inducing ischemia in one limb, and how to use the ERG to assess the effects of this remote-from-the-retina ischemia on retinal function after light damage. A two-flash protocol is described which allows isolation of the cone-driven component of the dark-adapted ERG, and thereby the separation of the rod and cone components. Because it can be recorded with techniques that are minimally invasive, the ERG has been widely used in studies of the physiology, pharmacology and toxicology of the retina. We describe one example of this usefulness, in which the ERG is used to assess the function of the light-damaged retina, with and without a neuroprotective intervention; preconditioning by remote ischemia.

The electroretinogram (ERG) is an electrical potential generated by the retina in response to light. This paper describes how to use the ERG to assess retinal function, in dark-adapted rats, and how it can be can be used to assess a neuroprotective intervention, in the present case remote ischemic preconditioning.

Utilizzando il Elettroretinogramma per valutare la funzione in roditori Retina e gli effetti protettivi del Remote Limb ischemico precondizionamento

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Simultaneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Test funzionale di due retine per<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Elettroretinogramma

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ablation of neurons is an effective method for this purpose when neurons are selectively labeled with fluorescent probes. In the present study, protocols for laser ablating a subpopulation of neurons using a two-photon microscope and testing of its functional and behavioral consequences are described. In this study, prey capture behavior in zebrafish larvae is used as a study model. The pretecto-hypothalamic circuit is known to underlie this visually-driven prey catching behavior. Zebrafish pretectum were laser-ablated, and neuronal activity in the inferior lobe of the hypothalamus (ILH; the target of the pretectal projection) was examined. Prey capture behavior after pretectal ablation was also tested.

Here, we present a protocol to ablate a genetically labeled subpopulation of neurons by a two-photon laser from Zebrafish larvae.

Ablazione di una popolazione neuronale utilizzando un Laser del due-fotone e sua valutazione usando formazione immagine del calcio e registrazione del comportamento nelle larve di Zebrafish

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

Using Optical Coherence Tomography and Optokinetic Response As Structural and Functional Visual System Readouts in Mice and Rats

Optical coherence tomography (OCT) is a fast, non-invasive, interferometric technique allowing high-resolution retinal imaging. It is an ideal tool for the investigation of processes of neurodegeneration, neuroprotection and neuro-repair involving the visual system, as these often correlate well with retinal changes. As a functional readout, visually evoked compensatory eye and head movements are commonly used in experimental models involving the visual function. Combining both techniques allows a quantitative in vivo investigation of structure and function, which can be used to investigate the pathological conditions or to evaluate the potential of novel therapeutics. A great benefit of the presented techniques is the possibility to perform longitudinal analyses allowing the investigation of dynamic processes, reducing variability and cuts down the number of animals needed for the experiments. The protocol described aims to provide a manual for acquisition and analysis of high quality retinal scans of mice and rats using a low cost customized holder with an option to deliver inhalational anesthesia. Additionally, the proposed guide is intended as an instructional manual for researchers using optokinetic response (OKR) analysis in rodents, which can be adapted to their specific needs and interests.

A detailed protocol for the assessment of structural and visual readouts in rodents by optical coherence tomography and optokinetic response is presented. The results provide valuable insights for ophthalmologic as well as neurologic research.

Tramite tomografia ottica di coerenza e risposta Optokinetic come strutturale e funzionale sistema visivo letture in topi e ratti

Optical coherence tomography (OCT) is a fast, non-invasive, interferometric technique allowing high-resolution retinal imaging. It is an ideal tool for ...

Using Zebrafish Larvae to Study the Pathological Consequences of Hemorrhagic Stroke

Despite being the most severe subtype of stroke with high global mortality, there is no specific treatment for patients with intracerebral hemorrhage (ICH). Modelling ICH pre-clinically has proven difficult, and current rodent models poorly recapitulate the spontaneous nature of human ICH. Therefore, there is an urgent requirement for alternative pre-clinical methodologies for study of disease mechanisms in ICH and for potential drug discovery.
The use of zebrafish represents an increasingly popular approach for translational research, primarily due to a number of advantages they possess over mammalian models of disease, including prolific reproduction rates and larval transparency allowing for live imaging. Other groups have established that zebrafish larvae can exhibit spontaneous ICH following genetic or chemical disruption of cerebrovascular development. The aim of this methodology is to utilize such models to study the pathological consequences of brain hemorrhage, in the context of pre-clinical ICH research. By using live imaging and motility assays, brain damage, neuroinflammation and locomotor function following ICH can be assessed and quantified.
This study shows that key pathological consequences of brain hemorrhage in humans are conserved in zebrafish larvae highlighting the model organism as a valuable in vivo&#160;system for pre-clinical investigation of ICH. The aim of this methodology is to enable the pre-clinical stroke community to employ the zebrafish larval model as an alternative complementary model system to rodents.

Here we present a protocol to quantify brain injury, locomotor deficits and neuroinflammation following bleeding in the brain in zebrafish larvae, in the context of human intracerebral hemorrhage (ICH).

Uso delle larve di zebrafish per studiare le conseguenze patologiche della corsa emorragica

Despite being the most severe subtype of stroke with high global mortality, there is no specific treatment for patients with intracerebral hemorrhage ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at cellular and subcellular resolution. Advances in molecular and imaging technologies have allowed us to gain numerous detailed insights into cellular and molecular mechanisms of brain development in the transparent zebrafish embryo. Recently, processes of refinement of neuronal connectivity that occur at later larval stages several weeks after fertilization, which are for example control of social behavior, decision making or motivation-driven behavior, have moved into focus of research. At these stages, pigmentation of the zebrafish skin interferes with light penetration into brain tissue, and solutions for embryonic stages, e.g., pharmacological inhibition of pigmentation, are not feasible anymore.
Therefore, a minimally invasive surgical solution for microscopy access to the brain of awake zebrafish is provided that is derived from electrophysiological&#160;approaches. In teleosts, skin and soft skull cartilage can be carefully removed by micro-peeling these layers, exposing underlying neurons and axonal tracts without damage. This allows for recording neuronal morphology, including synaptic structures and their molecular contents, and the observation of physiological changes such as Ca2+ transients or intracellular transport events. In addition, interrogation of these processes by means of pharmacological inhibition or optogenetic manipulation is feasible. This brain exposure approach provides information about structural and physiological changes in neurons as well as the correlation and interdependence of these events in live brain tissue in the range of minutes or hours. The technique is suitable for in vivo brain imaging of zebrafish larvae up to 30 days post fertilization, the latest developmental stage tested so far. It, thus, provides access to such important questions as synaptic refinement and scaling, axonal and dendritic transport, synaptic targeting of cytoskeletal cargo or local activity-dependent expression. Therefore, a broad use for this mounting and imaging approach can be anticipated.

Here we present a method to image the zebrafish embryonic brain in vivo upto larval and juvenile stages. This microinvasive procedure, adapted from electrophysiological approaches, provides access to cellular and subcellular details of mature neuron and can be combined with optogenetics and neuropharmacological studies for characterizing brain function and drug intervention.

Imaging in vivo del tessuto cerebrale completamente attivo in larve di zebrafish svegli e giovani mediante rimozione del cranio e della pelle

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...