We thank members of the UNC Zebrafish Aquaculture facility for maintenance of the zebrafish. We would also like to thank Diagnosys, LLC for assistance with the setup of the ERG apparatus. Additional thanks go to Dr. Portia McCoy and the laboratory of Dr. Ben Philpot for assistance with electrophysiological methods. We also wish to thank Lizzy Griffiths for her illustration of a larval zebrafish. This work was supported by National Institutes of Health awards F32 EY022279 (to J.D.C) and R21 EY019758 (to E.R.W).

동물 보수 및 실험 프로토콜은 채플 힐 노스 캐롤라이나 대학의 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인 및 실험 동물 복지의 NIH 사무실과 평가 및 실험 동물 관리 국제 인증 협회의 모든 요구 사항을 충족했다. 참고 : 표준 제브라 피쉬 사육 및 유지 보수 ERG 분석을위한 유충을 얻으려면, 출판 프로토콜 18을 사용 하였다. 애벌레는 자연 번식을 통해 구입해야하며 14 시간 조명 / 10 시간 어두운주기에 따라 보관되어 있습니다. 이 프로토콜은 포스트 수정 (DPF) 5-7일에서 유충에 최적화 된,하지만 이상적 절차에 작은 수정을 오래된 생선을 수행 할 수 있습니다. 여기, 5 DPF에서 야생 형 제브라 피쉬 애벌레의 TL 균주를 사용합니다. 1. 마이크로 피펫 생산 <ol><li> 화재 연마 붕규산 유리 모세관을 1.5 × 0.86 mm (내경에 의해 외경)를 사용하여 여러 개의 마이크로 피펫을 당겨필라멘트 (821 ° C, 용융 온도)와 P-97 불타는 / 브라운 마이크로 피펫 풀러 상자 열 필라멘트를 장착. 표 1에 설명 된 마이크로 피펫을 도운에 대한 프로그램을 사용하십시오. </li><li> 팁 직경이 10 ~ 15 μm의 것을 보장하기 위해 적절한 계수 선 통치자와 현미경 각 마이크로 피펫을 확인하고 부드러운 선단 구 (즉, 매끄러운 가장자리)가 있습니다. </li><li> 조심스럽게 먼지 팁 손상과 노출을 방지하기 위해 마이크로 피펫을 저장합니다. 스토리지 옵션은 실험실 테이프, 거품 늘어선 상자, 상업적으로 이용 가능한 마이크로 피펫 저장 용기와 배양 접시를 포함한다. 주의 : 다른 마이크로 피펫 풀러 유리 모세관은 정확한 마이크로 피펫의 직경 고품질 팁이 달성되는 한 사용될 수있다. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 압박 </td><td> 열 </td><td> 당기세요 </td><td> 속도 </tD&gt; <td> 시간 </td></tr><tr><td> (500) </td><td> (560) </td><td> - </td><td> (30) </td><td> (200) </td></tr><tr><td> (500) </td><td> (450) </td><td> - </td><td> (30) </td><td> (200) </td></tr><tr><td> (500) </td><td> (410) </td><td> (55) </td><td> (40) </td><td> (200) </td></tr></tbody></table> 표 1 : 상자 열 필라멘트가 장착 된 P-97 불타는 / 갈색 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 마이크로 피펫의 생산을위한 프로그램을 마이크로 피펫은 필라멘트에 불을 연마 붕규산 유리 모세관을 1.5 × 1.0 mm 2 (내경에 의해 외경)를 사용하여 만들어집니다. (용융 온도 821 ° C에서). 2. 버퍼 준비 <ol><li> 미세 모세관에서 산소화 금붕어 링거 완충액 (19)를 사용하고, 여과 유충을 실험에 배치되는 폴리 비닐 알코올 (PVA) 스펀지 포화. 또한, E3를 사용<html> 배아 매체 또는 행크의 균형 소금 솔루션. </li><li> pH를 7.8로 조정 한 0.22 μm의 필터를 사용하여 살균 및 4 ℃에서 10 배 주식을 저장 표 2에 설명 된대로 10 배 금붕어 링거액을 준비합니다. </li><li> 탈, 증류수로 1 배 10 배 링어의 솔루션을 희석하여 실험 당일 작업 솔루션을 만듭니다. 0.22 μm의 필터를 사용하여 필터링 시스템. 10 분 동안 95 %의 각 2 O / 5 % CO 2 가스를 버블 링함으로써 네이트. 단단히 나중에 캡 솔루션이 산소 유지되도록합니다. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 염화나트륨 </td><td> 1.25 M </td></tr><tr><td> 의 KCl </td><td> 26 mM의 </td></tr><tr><td> 염화칼슘 2 </td><td> 25 mM의 </td></tr><tr><td> 의 MgCl 2 </td><td> 10 mM의 </td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> 100 mM의 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 100 mM의 </td></tr></tbody></table>jove_content &quot;&gt; 표 2 : 10 배 금붕어 링거 용액의 조제. 3. 전위도 플랫폼 <ol><li> 신호 대 잡음비를 개선하기 위해 패러데이 케이지 안에 방진 테이블 ERG 실험을 수행한다. 육각 너트를 사용한 방진 테이블 정의 강철 플랫폼을 첨부. 광원 아래 테이블에 점탄성 우레탄 폴리머 충격 흡수 바닥으로 이동 플라스틱 플랫폼을 놓습니다. </li><li> 이동 플라스틱 플랫폼에서 아래로 목표 자화 스탠드와 카메라를 배치합니다. 이동 플라스틱 플랫폼의 오른쪽에 두 번째 자화 스탠드 (기록 미세 전극을 개최합니다) 미세 조작기를 놓습니다. 카메라와 미세 조작기가 다른 장비의 이동에 의해 방해되지 않습니다 그들이 광원으로부터 조명을 차단하지 않도록해야합니다. </li><li> 비디오 모니터에 카메라를 연결하고의 눈을 볼을 위치적절한 위치에 전극을 배치하기위한 충. </li><li> 설치가 제대로 구리 와이어 접지되어 있는지 확인합니다. 소음을 확인하려면, 링거액 가득 35mm 페트리 접시에 기록 미세 전극의 기준 전극 팁을 배치합니다. 오실로스코프 또는 ERG 장치의 내장 기능 설정의 전기 노이즈 레벨을 확인합니다. 소음 수준은 기준선 이하 ± 10 μV해야한다. </li></ol> 4. 스폰지 준비 <ol><li> 35mm 페트리 접시에 딱 맞는 건조 PVA 스폰지의 작은 사각형을 잘라. 스폰지의 두께는 접시의 깊이보다 크지 않아야한다. 절단 깨끗한 면도날 유틸리티 나이프를 사용합니다. </li><li> (스폰지의 바닥 또는 작은 끝 중 하나를 통해 수직으로 잘라 나비 길이 중 하나 얕은 컷) 기준 전극을 수용하기 위해 스펀지에 추가 컷을 확인합니다. </li><li> 화학적 내성 마커를 사용하여카메라를 위치에 사용할 수있는 스폰지 (유충이 배치 될 위치)에 작은 점을 표시합니다. </li><li> 포화 될 때까지 링거액에 PVA 스폰지 십니다. 2 ~ 3 회를 제거하고 종이 타월에 신속시킨다. 깨끗한 35mm 페트리 접시에 스폰지를 놓습니다. </li><li> 마크가 카메라에 의해 가시화 될 수 있도록 플라스틱 플랫폼을 포함하는 스폰지 페트리 접시를 배치. </li></ol> 5. 전극 준비 주 : 피쉬 설치 링거액 포화 PVA 스폰지와 각막에 접촉 기록 전극과 접촉 기준 전극으로 구성. 기준 전극의 Ag / AgCl로 구성되어 펠릿. 기록 전극은 와이어의 Ag를 함유하는 미세 전극 홀더에 의해 링거액 채우고 유지 뽑아 유리 마이크로 피펫이다. <ol><li> 5 분 (기록 MICR 6-9 %의 차아 염소산 나트륨 (표백제)에서 그들을 담가 전극 클로라이드oelectrode 와이어) 또는 15 분 (기준 전극). 5 분 킴에 공기 건조. <ol><li> 단계 4.2에서 만든 컷의 스타일에 따라, 스폰지 (하단에 세로로 얕은 인하) (수직 나비 인하) 또는 아래에 기준 전극의 자세 / AgCl을 펠렛을 배치합니다. 기록 시스템에 기준 전극 리드를 부착. </li><li> ERG 설치 공간의 제약이 있거나의 Ag / AgCl을 전극으로부터 특히 강한 태양 광 인공물이있는 경우 또는, 광로 밖으로 전극을 이동 한천 염다리 통하여 스폰지에 기준 전극을 연결한다. </li></ol></li><li> 5 ml의 비 루어 잠금 주사기 ~ 적당한 크기의 튜브 40cm를 연결합니다. 링거액과 주사기를 입력합니다. 압력 포트는 일반적으로 어댑터와 함께 제공 갖는 미세 전극 홀더, &quot;3/32&quot;1/8 1/16의 내부 직경을 갖는 튜브를 수용 &quot;또는 5/32&quot;합니다. </li><li> 함께 1 ml의 비 루어 로크 시린지를 채우기마이크로 FIL를 사용 링거액하고,주의 깊게 미세 전극 홀더를 입력합니다. 거품의 형성을 방지합니다. </li><li> 튜브와 미세 전극 홀더의 압력 포트에 5 ML의 주사기를 연결하고 미세 전극 홀더 링거액의 전체 있는지 확인하는 데 사용합니다. 링거액 가득 마이크로 FIL 1-ML의 주사기를 사용하여 끝에서 마이크로 피펫 유리를 작성하고 기포가 존재하지 않는 것을 확인합니다. </li><li> 전극 와이어를 똑바로되지 않도록 조심스럽게 미세 전극 홀더에 유리 마이크로 피펫을 연결합니다. 일단, 보안 솔루션의 작은 양 끝에 표시 될 때까지 조심스럽게 미세 전극을 통해 링거액을 강제로 5 ML의 주사기를 사용합니다. 마이크로 피펫 팁에서, 먼지 또는 염 축적으로 인한 기포뿐만 아니라 폐색의 형성을 방지한다 (각막에인가되지 않음) 주사기에 압력을 적용 수시. <ol><li> 이 솔루션은 스트림으로 나오는 경우, g 교체아가씨 마이크로 피펫, 선단 개구가 너무 크거나 손상 때문이다. </li></ol></li><li> 조심스럽게 미세 조작기의 기록 미세 전극을 배치하고 기록 시스템에 리드를 연결합니다. </li></ol> 6. 전위도 분석 참고 : 녹음을위한 준비가 간접 백색광의 낮은 수준에서 수행 할 때 애벌레 망막의 원추 지배력, 높은 품질의 ERG 결과를 얻을 수 인해 (&lt;1 룩스) 또는 짧은 기간에 높은 강도의 (&lt;1 분) ( ≤250 LUX) 작업 등. 어두운 적응의 짧은 기간이 여전히 기록하기 전에 필요합니다 (단계 6.7 참조​​). 그러나, 실험에 민감한 적외선 카메라를 사용하여 희미 적색 또는 적외선 광 하에서 수행 될 수있다. 모든 실험은 UNC Zebrafish의 양식 시설에서 멸균 필터 (0.22 μm의) 물 시스템에서 수행되었지만 대체 배아 매체가 사용될 수있다. <ol><li> 약 1 측정 잘라 종이 타월 사각형cm 2. </li><li> 절연 콘 질량 수용체 전위를 측정하는 경우, 5 분 동안 500 μM (±) -2- 아미노 -4- phosphonobutyric 산 (APB)으로 시스템 물 3-5 유충 부화. 참고 : APB는 활성 (L)의 라 세미 혼합물 및 AP4의 비활성 (R) 형태이지만, 그것은 L-AP4만큼 효과적이고 저렴합니다. </li><li> 0.02 % 응답, 1 ~ 2 분까지 (w / v)의 Tricaine와 시스템 물에 3-5 애벌레를 마취. </li><li> 신중하게 최소한의 조명 (&lt;1 분 ≤250 럭스)를 사용하여 해부 입체경에서 종이 타월 사각형에 개별 애벌레를 전송하는 파스퇴르 피펫과 피펫 펌프를 사용합니다. 각 유충의 위치를​​ 확인하고 가려지지 않은 눈을 가진 지느러미 쪽을 위로하는 후보를 선택합니다. <ol><li> 확장 된 기록 (&gt; 30 분)의 경우에 몸을 유약하지만 좋은 낙타 털 브러시를 사용하여 3 % 메틸 셀룰로오스와 머리를 포함하지 않음으로써 촉촉한 유충을 유지합니다. </li></ol></li><li> 집게를 사용하면 종이 타월의 오준석를 전송젖은 PVA 스폰지에 유충과 전자. <ol><li> 확장 된 기록 (&gt; 30 분)를 들면, 증류 물을 함유하는 부착 플라스크에 airstone 통해 가스를 버블 링시킴으로써 유충 위에 물 - 포화 된 100 % O 2 가스의 연속적인 흐름을 적용한다. 유충의 머리 근처 가습 된 산소를 전달하는 플라스크 사이드 암에서 나오는 튜브를 배치합니다. 참고 : 단계 6.4.1 단계 6.5.1 물고기 (16)의 수명을 연장합니다. </li></ol></li><li> 최소한의 조명 아래, 코와 눈의 꼬리 끝 사이의 중간 점에 미세 전극 팁의 위치를​​ 미세 조작기 카메라를 사용하여 각막의 등의 제한에 부드럽게 눌러줍니다. 참고 : 각막의 가장 먼 영역에 전극 팁의 오정렬이 반대 극성의 ERG 파형이 발생할 수 있습니다. </li><li> 에 유충 5 ~ 10 분 동안 어두운 - 적응 허용합니다. </li><li> 호 텔를 사용하여 LED 광원 또는 광 자극기에서 제공하는 빛에 기록 테스트 플래시 응답lable가 자극 및 녹음 장비. 이러한 플래시 광량, 플래시 길이 플래시 컬러, 강도와 배경 실험에 맞게 컬러 필터와 같은 설정 프로토콜 파라미터를 조정한다. </li><li> 실험이 완료되면, AVMA / IACUC 지침에 따라 유충을 안락사. </li></ol>

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 프로토콜에서 애벌레 제브라 피쉬의 ERG 녹음에 대한 간단한 절차를 자세히 설명되어 있습니다. 명심해야한다 절차를 통해 몇 가지 중요한 단계는이 절차는 시각 function.There의 신속하고 종합적인 분석이 가능하다. 실험이 잠재적 인 약물 치료 중에 죽음을 방지하고 ERG 녹음 중에 장시간 생활을 보장하기 위해 전에 제브라 피쉬의 유충이 건강해야합니다. 또한, 실험에 이용 유충 밀접 연령대 것?...

전위도 (ERG)은 인간의 망막 기능을 결정하기위한 임상에서 널리 사용되어 전기 생리 비 침습적 방법이다. 광 자극에 응답하여 전기적 활성도는 각막의 외부면에 기록 전극을 배치하여 측정된다. 자극 패러다임과 응답 파형의 특성이 반응에 기여하는 망막 신경 세포를 정의한다. 이 방법은 마우스와 관상어 동물 모델의 수와 함께 사용하도록되어왔다. 일반적인 척추 ERG 응답은 네 개의 주 성분 갖는다 : 시각 세포 유래의 활성 각막 마이너스 전위 파형 발생기; B-파도 극세포 ON으로부터 유도 각막 양의 전위; D-파도 OFF 쌍극 세포의 활동으로 해석 각막 양의 전위; 와 B 파 후 몇 초 발생하고 C-파, 뮐러 아교 세포와 RET 활동을 반영원고 판 색소 상피 1-4. 인간과 모델 동물에서 ERG 분석의 역사와 원리를 이해하기위한 추가 참조는 원칙과 비전 4, 5의 임상 전기 생리학의 연습으로 유타와 텍스트의 대학에서 온라인 교과서, WebVision을이다. 다니오의 레 리오 (rerio) (제브라 피쉬)는 긴 인해 기관 시스템, 행동 분석의 비 침습적 인 형태 학적 분석과 순방향 및 역방향 유전 화면 (검토를 위해, Fadool과를 볼 수 있습니다 급속한 성숙과 투명성에, 척추 개발을위한 모델로 선호되었다 다울 링 6). Zebrafish의 유충, 높은 생산력과 결합 할 때, 그 높은 처리량 생물학적 분석을위한 훌륭한 동물 모델 만드는 유전 및 약리 조작에 매우 의무가 있습니다. 애벌레 제브라 피쉬의 막대에 콘의 높은 비율 - 약 1 : 1 마우스 (~ 3 % 콘에 비해S) - 콘 기능 7-9의 연구에 특히 유용합니다. 척추 동물의 망막에서 콘로드 (10) 전에 개발. 흥미롭게도, 제브라 피쉬 콘은 그 단계 6, 11, 12에 콘의 선택적 전기 생리학 분석을 허용, 이르면 4 DPF로 동작한다. 반면, 막대의 ERG 응답은 11 21 13 DPF 사이에 나타납니다. 따라서, 4-7에서 제브라 피쉬의 유충은 DPF 모든 콘 망막으로 기능적 역할을한다. 그러나 4-7 DPF 유충의 기본 포토 픽 ERG 응답은 B 파에 의해 지배된다. (+) - - 2- 아미노 -4- 포스 포노 부티르산 (L-AP4), 대사성 글루타메이트에 대한 작용제 쌍극 세포에 의해 발현 (mGluR6) 수용체를 효과적으로 차단 예컨대 L로서 생성되는 약물의 응용 B 파의와 격리 된 콘 질량 수용체 가능성, ( &quot;파&quot;) 14 ~ 17을 보여준다. 여기에서 우리는 간단하고 reliabl을 설명제브라 피쉬 애벌레와 함께 사용하도록 적응 된 생쥐와 함께 사용하도록 설계 ERG 시판 장비를 이용하여 ERG의 전자 분석 방법. 이 시스템은 시각 감도 및 빛 적응에 기여 16 신호 전달 경로의 식별을 돕기 위해 연구자, 유전 배경 변화뿐만 아니라 약리학 적 제제로 처리 된 것과 같은 지브라 피쉬의 유충에 이용 될 수있다. 이 프로토콜에 설명 된 실험 절차는 비전에 관한 생물학적 다양한 질문에 대답 ERG 분석의 사용에 수사관을 안내하고, 유연한 ERG 설정의 건설을 시연 할 예정이다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2170">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"><a name="RANGE!A1:D30">Name of the Material/Equipment</a></td>
			<td style="width:168px;">Company</td>
			<td style="width:165px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:1504px;">Comments/ Description (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Faraday cage</td>
			<td>80/20 Inc</td>
			<td>custom</td>
			<td>Custom designed aluminum &#34;Industrial Erector Set&#34; for Cage framework</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PVA sponge</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B000ZOWG1C</td>
			<td>Provides a soft, moist platform for placement of zebrafish larvae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">150 ml Sterile Filter systems</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431154</td>
			<td>Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Espion E2</td>
			<td>Diagnosys, LLC</td>
			<td>contact</td>
			<td>Modular electrophysiology system capable of generating visual stimuli for any stimulator and digital recording and analysis of responses using propietary software, more information at http://www.diagnosysllc.com</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Colordome</td>
			<td>Diagnosys, LLC</td>
			<td>contact</td>
			<td>Light stimulator with RGB LED and Xenon light sources for Ganzfeld ERG, more information at http://www.diagnosysllc.com</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micromanipulator</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-024-R</td>
			<td>Holding and positioning the recording microelectrode</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnetic ring stand</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-025-MB</td>
			<td>Holding and positioning of the camera and refrence electrode</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lead extensions</td>
			<td>Grass Technologies</td>
			<td>F-LX</td>
			<td>Spare female to male 1.5 mm lead cables for connecting electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:333px;">Male Pin to Female SAFELEAD Adaptor</td>
			<td>Grass Technologies</td>
			<td>DF-215/10</td>
			<td>Connecting 2 mm pins to 1.5 headboard pins</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Window screen frame (metal) and spline</td>
			<td>Lowes or Home Depot</td>
			<td>various</td>
			<td>For attaching copper mesh to Faraday cage framework</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Steriflip 50 ml filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td>Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BNC adaptor</td>
			<td>Monoprice</td>
			<td>4127</td>
			<td>Connecting camera to BNC cable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BNC cable</td>
			<td>Monoprice</td>
			<td>626</td>
			<td>Connecting camera to video adaptor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Camera lens</td>
			<td>Navitar</td>
			<td>1582232</td>
			<td>Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Camera coupler</td>
			<td>Navitar</td>
			<td>1501149</td>
			<td>Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luna BNC to VGA + HDMI Converter</td>
			<td>Sewell</td>
			<td>SW-29297-PRO</td>
			<td>BNC to VGA adaptor allowing camera image to project on computer monitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">APB</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1910</td>
			<td>mGluR6 agonist, blocks b-wave allowing analysis of the isolated cone mass receptor potential</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Borosilicate glass</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BF-150-86-10</td>
			<td>Fire- polished borosilicate glass (metling temperature = 821&#176;C) with filament and dimensions of 1.5mm x 0.86 mm (outer diameter by inner diameter)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">P97 Flaming/Brown puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P97</td>
			<td>For pulling glass micropipettes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sorbothane sheet</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SB12A</td>
			<td>Synthetic viscoelastic urethane polymer, placed under Passive Isolation Mounts and ERG platform to absorb shock and prevent slipping, can be cut to size</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>B2436F</td>
			<td>Vibration isolation platfrom for ERG stimulator and zebrafish specimen</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Passive Isolation Mounts</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PWA074</td>
			<td>Provides vibration isolation to breadboard</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Copper mesh</td>
			<td>TWP</td>
			<td>022X022C0150W36T</td>
			<td>To line Faraday Cage</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53502-233</td>
			<td>Used with Pasteur pipettes to carefully transfer zebrafish larvae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-608</td>
			<td>Used with Pipette pump to carefully transfer zebrafish larvae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Camera</td>
			<td>Watec</td>
			<td>WAT-902B</td>
			<td>Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tricaine (MS-222)</td>
			<td>Western Chemical</td>
			<td>Tricaine-S</td>
			<td>Pharmaceutical-grade anesthetic,</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro-fil</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MF28G-5</td>
			<td>Filling microelectrode holder and microelectrode glass</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microelectrode holder</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MEH2SW15</td>
			<td>Holds glass microelectrode, connects to ERG equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reference Electrode</td>
			<td>WPI</td>
			<td>DRIREF-5SH</td>
			<td>Carefully break off last centimeter of casing to drain electrolyte and expose sintered Ag/AgCl pellet electrode</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reference Electrode (alternative)</td>
			<td>WPI</td>
			<td>EP1</td>
			<td>Alternative to DRIREF-5SH. Ag/AgCl electrode that must be wired/soldered to connecting lead</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Low-noise cable for Microelectrode holder</td>
			<td>WPI</td>
			<td>13620</td>
			<td>Connecting recording microelctrode holder to adaptor/headboard</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroretinogram analysis of the visual response in zebrafish larvae

전위도 (ERG)은 망막의 기능을 결정하기위한 비 침습적 전기 생리 학적 방법이다. 각막의 표면에 전극의 배치를 통해, 전기적 활성도를 측정하여 생체 내에서 망막 세포의 활성을 평가하기 위해 사용할 수있는 광에 응답하여 생성. 이 원고 지브라 피쉬의 시각 기능을 측정 ERG의 사용을 설명한다. Zebrafish의 긴 인해 모르 폴리 노 올리고 뉴클레오티드 및 약리학 적 유전자 조작에 의한 억제의 용이함 척추 개발을위한 모델로서 이용되어왔다. 5-10 DPF에서, 만 콘 애벌레 망막 기능입니다. 따라서, 제브라 피쉬는 다른 동물과 달리, 생체 내에서 콘 시각 기능의 연구를위한 모델 강력한 시스템이다. 이 프로토콜은 표준 마취, 미세 조작 및 제브라 피쉬의 연구를 수행 실험실에서 흔히 실체 현미경 프로토콜을 사용합니다. 설명 방법은 표준 전기 생리학 EQ를 사용합니다uipment과 저조도 카메라는 애벌레 각막에 기록 미세 전극의 위치를​​ 안내합니다. 마지막으로, 우리는 원래 쥐와 함께 사용하도록 설계된 시판 ERG 자극기 / 레코더 쉽게 지브라 피쉬 함께 사용하도록 적응 될 수있는 방법을 보여준다. 애벌레 제브라 피쉬의 ERG는 모르 폴리 노 올리고 뉴클레오타이드 주입에 의해 수정 된 동물에서 콘 시각​​ 기능을 분석의 우수한 방법뿐만 아니라 아연 핑거 뉴 클레아 제 (ZFNs) 같은 새로운 게놈 엔지니어링 기술을 제공, 전사 활성제와 같은 이펙터 클레아 제 (TALENs) 및 정기적으로 클러스터 Interspaced 짧은 회문 반복 (CRISPR) / 크게 효율성과 제브라 피쉬에서 대상 유전자의 효능을 증가 모두 Cas9. 또한, 우리는 광 응답에 기여하는 분자 성분을 평가하기 지브라 피쉬 유충 침투되는 약물의 능력을 이용한다. 이 프로토콜은 변형 된 연구자에 의해 사용될 수있는 설정을 간략다양한 실험 목표.

일반적으로, 망막 전위는 많은 연구가이 단계 9, 16, 20에서 ERG 녹음을 게시 한 이후, 5 DPF에서 zebrafish의 유충으로 기록됩니다. 유생 응답은 백색 LED 광의 20msec의 자극을 이용하여 설정된 배경 조명 암순응 조건으로 측정 하였다. 우리 Ganzfeld 광 자극기 및 컴퓨터 제어기 / 레코더 이루어진 시판 ERG 시스템을 이용했다. 자극기는 배경 및 플래시 자극 모두의 휘도를 제어하는​​ 고유 엄격하게...

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Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

Zebrafish의 애벌레에서 비주얼 응답의 전위도 분석

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

electroretinogram-analysis-of-the-visual-response-in-zebrafish-larvae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.5K 조회수.  University of North Carolina at Chapel Hill. We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

비디오: Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

의 Proprioceptors의 시각화<em&gt; Drosophila</em&gt; 애벌레와 Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

연구

신경과학

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the underlying neuronal components in the circuits1-6. Application of optogenetics7,8 in the larval neural circuit allows us to manipulate neuronal activity in spatially and temporally patterned ways9-13. Typically, specimens are broadly illuminated with a mercury lamp or LED, so specificity of the target neurons is controlled by binary gene expression systems such as the Gal4-UAS system14,15. In this work, to improve the spatial resolution to "sub-genetic resolution", we locally illuminated a subset of neurons in the ventral nerve cord using lasers implemented in a conventional confocal microscope. While monitoring the motion of the body wall of the semi-intact larvae, we interactively activated or inhibited neural activity with channelrhodopsin16,17 or halorhodopsin18-20, respectively. By spatially and temporally restricted illumination of the neural tissue, we can manipulate the activity of specific neurons in the circuit at a specific phase of behavior. This method is useful for studying the relationship between the activities of a local neural assembly in the ventral nerve cord and the spatiotemporal pattern of motor output.

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Here we describe a protocol for optogenetic manipulation of motoneuronal activity while monitoring changes in motor output (muscle contraction) in semi-intact Drosophila larvae using lasers within a conventional confocal microscope. This technique enables researchers to achieve local perturbation of neural activity in a few neuromeres to elucidate the dynamics of motor circuits.

세미 그대로의 레이저 조명과 신경 활동의 Optogenetic 섭동<em&gt; 초파리</em모션&gt; 유충

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system measures spontaneous behaviors and the response to an aversive stimulus, which is shown to the larvae via a PowerPoint presentation. The recorded images are analyzed with an ImageJ macro, which automatically splits the color channels, subtracts the background, and applies a threshold to identify individual larvae placement in the lanes. We can then import the coordinates into an Excel sheet to quantify swim speed, preference for edge or side of the lane, resting behavior, thigmotaxis, distance between larvae, and avoidance behavior. Subtle changes in behavior are easily detected using our system, making it useful for behavioral analyses after exposure to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Our laboratory developed a novel high-throughput automated imaging system that is useful for the detection of several different behaviors in 7-day-old zebrafish larvae. The system can be used for detecting subtle changes in behavior after the larvae have been exposed to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Zebrafish의 유충에 자동으로 높은 처리량 행동 분석

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

The Optokinetic Response as a Quantitative Measure of Visual Acuity in Zebrafish

Zebrafish are a proven model for vision research, however many of the earlier methods generally focused on larval fish or demonstrated a simple response. More recently adult visual behavior in zebrafish has become of interest, but methods to measure specific responses are new coming. To address this gap, we set out to develop a methodology to repeatedly and accurately utilize the optokinetic response (OKR) to measure visual acuity in adult zebrafish. Here we show that the adult zebrafish's visual acuity can be measured, including both binocular and monocular acuities. Because the fish is not harmed during the procedure, the visual acuity can be measured and compared over short or long periods of time. The visual acuity measurements described here can also be done quickly allowing for high throughput and for additional visual procedures if desired. This type of analysis is conducive to drug intervention studies or investigations of disease progression.

Zebrafish have been a valuable tool for many research areas. Here we demonstrate a method to elicit a visual response and calculate a functional visual acuity in the adult zebrafish.

Zebrafish의 시력의 정량적 측정과 Optokinetic 응답

Zebrafish are a proven model for vision research, however many of the  earlier methods generally focused on larval fish or demonstrated a simple  ...

Using the Electroretinogram to Assess Function in the Rodent Retina and the Protective Effects of Remote Limb Ischemic Preconditioning

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the retina. The ERG is a sensitive measure of changes in retinal function that are pan-retinal, but is less effective for detecting damage confined to a small area of retina. In the present work we describe how to record the &#8216;flash&#8217; ERG, which is the potential generated when the retina is exposed to a brief light flash. We describe methods of anaesthesia, mydriasis and corneal management during recording; how to keep the retina dark adapted; electrode materials and placement; the range and calibration of stimulus energy; recording parameters and the extraction of data. We also describe a method of inducing ischemia in one limb, and how to use the ERG to assess the effects of this remote-from-the-retina ischemia on retinal function after light damage. A two-flash protocol is described which allows isolation of the cone-driven component of the dark-adapted ERG, and thereby the separation of the rod and cone components. Because it can be recorded with techniques that are minimally invasive, the ERG has been widely used in studies of the physiology, pharmacology and toxicology of the retina. We describe one example of this usefulness, in which the ERG is used to assess the function of the light-damaged retina, with and without a neuroprotective intervention; preconditioning by remote ischemia.

The electroretinogram (ERG) is an electrical potential generated by the retina in response to light. This paper describes how to use the ERG to assess retinal function, in dark-adapted rats, and how it can be can be used to assess a neuroprotective intervention, in the present case remote ischemic preconditioning.

쥐 망막 및 원격 사지 허혈 양상의 보호 효과에 기능을 평가하기 위해 전위도를 사용하여

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

동시<em&gt; 생체</em두 망막의&gt; 기능 테스트로<em&gt; 생체</em&gt; 전위도 시스템

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ablation of neurons is an effective method for this purpose when neurons are selectively labeled with fluorescent probes. In the present study, protocols for laser ablating a subpopulation of neurons using a two-photon microscope and testing of its functional and behavioral consequences are described. In this study, prey capture behavior in zebrafish larvae is used as a study model. The pretecto-hypothalamic circuit is known to underlie this visually-driven prey catching behavior. Zebrafish pretectum were laser-ablated, and neuronal activity in the inferior lobe of the hypothalamus (ILH; the target of the pretectal projection) was examined. Prey capture behavior after pretectal ablation was also tested.

Here, we present a protocol to ablate a genetically labeled subpopulation of neurons by a two-photon laser from Zebrafish larvae.

두 광자 레이저와 Zebrafish 애벌레의 칼슘 이미징 및 행동 녹화를 사용 하 여 평가 사용 하 여 신경 인구의 제거

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

Using Optical Coherence Tomography and Optokinetic Response As Structural and Functional Visual System Readouts in Mice and Rats

Optical coherence tomography (OCT) is a fast, non-invasive, interferometric technique allowing high-resolution retinal imaging. It is an ideal tool for the investigation of processes of neurodegeneration, neuroprotection and neuro-repair involving the visual system, as these often correlate well with retinal changes. As a functional readout, visually evoked compensatory eye and head movements are commonly used in experimental models involving the visual function. Combining both techniques allows a quantitative in vivo investigation of structure and function, which can be used to investigate the pathological conditions or to evaluate the potential of novel therapeutics. A great benefit of the presented techniques is the possibility to perform longitudinal analyses allowing the investigation of dynamic processes, reducing variability and cuts down the number of animals needed for the experiments. The protocol described aims to provide a manual for acquisition and analysis of high quality retinal scans of mice and rats using a low cost customized holder with an option to deliver inhalational anesthesia. Additionally, the proposed guide is intended as an instructional manual for researchers using optokinetic response (OKR) analysis in rodents, which can be adapted to their specific needs and interests.

A detailed protocol for the assessment of structural and visual readouts in rodents by optical coherence tomography and optokinetic response is presented. The results provide valuable insights for ophthalmologic as well as neurologic research.

쥐와 쥐에 구조와 기능적 시각 시스템 판독으로 광학 일관성 단층 촬영 및 Optokinetic 응답을 사용 하 여

Optical coherence tomography (OCT) is a fast, non-invasive, interferometric technique allowing high-resolution retinal imaging. It is an ideal tool for ...

Using Zebrafish Larvae to Study the Pathological Consequences of Hemorrhagic Stroke

Despite being the most severe subtype of stroke with high global mortality, there is no specific treatment for patients with intracerebral hemorrhage (ICH). Modelling ICH pre-clinically has proven difficult, and current rodent models poorly recapitulate the spontaneous nature of human ICH. Therefore, there is an urgent requirement for alternative pre-clinical methodologies for study of disease mechanisms in ICH and for potential drug discovery.
The use of zebrafish represents an increasingly popular approach for translational research, primarily due to a number of advantages they possess over mammalian models of disease, including prolific reproduction rates and larval transparency allowing for live imaging. Other groups have established that zebrafish larvae can exhibit spontaneous ICH following genetic or chemical disruption of cerebrovascular development. The aim of this methodology is to utilize such models to study the pathological consequences of brain hemorrhage, in the context of pre-clinical ICH research. By using live imaging and motility assays, brain damage, neuroinflammation and locomotor function following ICH can be assessed and quantified.
This study shows that key pathological consequences of brain hemorrhage in humans are conserved in zebrafish larvae highlighting the model organism as a valuable in vivo&#160;system for pre-clinical investigation of ICH. The aim of this methodology is to enable the pre-clinical stroke community to employ the zebrafish larval model as an alternative complementary model system to rodents.

Here we present a protocol to quantify brain injury, locomotor deficits and neuroinflammation following bleeding in the brain in zebrafish larvae, in the context of human intracerebral hemorrhage (ICH).

출혈 성 뇌졸중의 병리학 적 결과를 연구 하기 위해 제 브라 피시 애벌레 사용

Despite being the most severe subtype of stroke with high global mortality, there is no specific treatment for patients with intracerebral hemorrhage ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at cellular and subcellular resolution. Advances in molecular and imaging technologies have allowed us to gain numerous detailed insights into cellular and molecular mechanisms of brain development in the transparent zebrafish embryo. Recently, processes of refinement of neuronal connectivity that occur at later larval stages several weeks after fertilization, which are for example control of social behavior, decision making or motivation-driven behavior, have moved into focus of research. At these stages, pigmentation of the zebrafish skin interferes with light penetration into brain tissue, and solutions for embryonic stages, e.g., pharmacological inhibition of pigmentation, are not feasible anymore.
Therefore, a minimally invasive surgical solution for microscopy access to the brain of awake zebrafish is provided that is derived from electrophysiological&#160;approaches. In teleosts, skin and soft skull cartilage can be carefully removed by micro-peeling these layers, exposing underlying neurons and axonal tracts without damage. This allows for recording neuronal morphology, including synaptic structures and their molecular contents, and the observation of physiological changes such as Ca2+ transients or intracellular transport events. In addition, interrogation of these processes by means of pharmacological inhibition or optogenetic manipulation is feasible. This brain exposure approach provides information about structural and physiological changes in neurons as well as the correlation and interdependence of these events in live brain tissue in the range of minutes or hours. The technique is suitable for in vivo brain imaging of zebrafish larvae up to 30 days post fertilization, the latest developmental stage tested so far. It, thus, provides access to such important questions as synaptic refinement and scaling, axonal and dendritic transport, synaptic targeting of cytoskeletal cargo or local activity-dependent expression. Therefore, a broad use for this mounting and imaging approach can be anticipated.

Here we present a method to image the zebrafish embryonic brain in vivo upto larval and juvenile stages. This microinvasive procedure, adapted from electrophysiological approaches, provides access to cellular and subcellular details of mature neuron and can be combined with optogenetics and neuropharmacological studies for characterizing brain function and drug intervention.

두개골과 피부 제거에 의해 깨어 얼룩말 물고기 애벌레와 청소년에서 완전히 활성 뇌 조직의 생체 내 이미징

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...