Diese Arbeit wurde von der Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada unterstützt. Mikrofabrikation wurde mit Unterstützung der McGill Nanotools Microfab Anlage an der McGill Universität und der Abteilung für Elektronik an der Carleton University durchgeführt.

Blut von gesunden Personen mit Zustimmung der Ethikkommission der Universität Ottawa (H11-13-06) gesammelt. 1. Mikrokanal Fabrication Die Mikrokanäle werden basierend auf den Standard-Photolithographieverfahren 18 hergestellt. <ol><li> Entwerfen Sie die Mikrokanalgeometrie mit einem Design-Software Computer Aided (CAD) und drucken Sie die Konfiguration auf einer Transparenz Photomaske. Diese Masken sind von entscheidender Bedeutung, da sie die Lichtpfad aufgrund während des Herstellungsprozesses. In diesem Fall sind die Mikrokanalabmessungen betragen 120 &amp; mgr; m in der Dicke, 60 &amp; mgr; m in der Tiefe und 7 mm in der Länge. </li><li> In einem Reinraum, Schleuderbeschichtung ein Epoxidharz auf der Basis negativer Photoresist auf einem Siliciumwafer bei 2000 Upm für 30 s, um die gewünschte Mikrokanaltiefe (60 um) zu erhalten. </li><li> Aussetzen des Wafers und der Photomaske unter einer UV-Lampe bei 650 mJ / cm 2 für 70 sec. Stellen Sie sicher, dass nur die transparenten Bereiche des ExposesPhotomaske auf die UV-Licht. Die Belichtung der lichtdurchlässigen Bereiche können für die Polymerisation der Ketten, was zu einer Härtung der Photolack. Tauchen Sie die Siliziumstück in einen Entwickler, um mehr als Photolack zu entfernen. </li><li> Sobald die Form gefertigt, Mix ein Siliciumbasiertes Elastomer und ein Härtungsmittel in einem Verhältnis von 10: 1, um eine Lösung von Poly-Dimethyl-Siloxan (PDMS) zu erstellen. Legen Sie die PDMS-Lösung in einer Vakuumkammer zu entgasen. Gieße es in die Form und erhitzt bei 60 ° C für 90 min, um Mikrokanäle zu schaffen. Dann binden die einzelnen Kanäle auf einem Glasobjektträger unter Verwendung von Sauerstoffplasma Ausgleich für 90 sec. HINWEIS: Die PDMS entgasen Vorgang ist notwendig, um die Luftblasen durch den Mischvorgang erzeugt beseitigen geführt. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Mikrokanalabmessungen ermöglichen die erfolgreiche Prüfung. In diesem Protokoll werden die Mikrokanäle einen rechteckigen Querschnitt von 120 x 60 um. Im Vergleich dazu hat eine durchschnittliche RBC einen Durchmesser von 8 um und einer Dicke von 2 um. DieDaher liegt der Mikrokanalbreite ausreichend, um angemessene Aggregation zu beobachten und genau zu bestimmen, die Geschwindigkeitsprofile. </li></ol> 2. Blut Vorbereitung <ol><li> Sammeln Blut von gesunden freiwilligen Spendern, nach Zustimmung einer Ethikkommission. Behandeln Sie das Blut mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in den Sammelröhrchen vorhanden (7,2 mg EDTA in 4 ml Blut). HINWEIS: Das EDTA wird verwendet, um die Blutgerinnung zu vermeiden. </li><li> Zentrifugieren Sie die Blutproben dreimal für 10 Minuten bei 1.400 xg (3000 rpm), um die Blutbestandteile zu trennen. Als Folge der Zentrifugation beobachten drei unterschiedliche Schichten. HINWEIS: Die drei Schichten sind die RBC-Schicht (an der Unterseite des Rohres angeordnet ist), der Leukozytenfilm (bestehend aus weißen Blutkörperchen und Blutplättchen auf der RBC-Schicht angeordnet ist) und der Plasmaschicht (über allen der anderen befindet Bestandteile). <ol><li> Nach der ersten Zentrifugation, sammeln Blutplasma mit Hilfe eines Blut Pipette. Vermeiden Sie contakt mit der Buffy-Coat. </li><li> Sammeln und entsorgen der Buffy-Coat in einem Behälter mit Bleichmittel auf 10% verdünnt. </li><li> 3 ml PBS, pH 7,4, zu jeder der Röhren mit dem restlichen RBC-Schicht und sorgen für die richtige Balance zwischen der Zentrifuge. Wieder sanft die Rohre und Zentrifuge bei 1.400 xg mischen (3.000 rpm) für 10 min. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die PBS-Lösung keine Magnesium oder Calcium enthalten, da sie die Zelladhäsion verändern könnten. </li><li> Entsorgen Sie die PBS in den Rohren nach der zweiten Zentrifugation und entfernen Sie die restlichen Speckhaut, falls vorhanden. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.3 und 2.2.4 für die dritte Zentrifugation, um saubere RBCs ergeben. </li></ol></li><li> Mischen Sie die erforderliche Menge (0,05, 0,1 und 0,15 ml) der Rein RBCs mit Plasma (0,95, 0,9 und 0,85 ml) in einem 1-ml-Röhrchen, um RBC-Suspensionen mit der entsprechenden (5% zu erhalten, 10% und 15% ) Hämatokrit. Überprüfen Hämatokritwerte mit einer Mikrozentrifuge. </li></ol> 3. Flüssigkeiten Vorbereitung <ol><li> In 60 ul des fluoreszierenden Tracerpartikel-Lösung (1% Feststoff, d Partikel = 0 ist. 86 &amp; mgr; m, ABS λ = 542 nm und λ = 612 nm Emissions) in die 1 ml RBC-Suspension Röhren. HINWEIS: Die fluoreszierenden Markierungspartikel (intern gefärbte Polystyrol-Partikel) verwendet werden, um die Geschwindigkeit der Strömung innerhalb des Mikrokanals zu messen. Diese Partikel fluoreszieren, wenn auf die entsprechende Wellenlänge des Laserstrahls (λ = 542 nm) belichtet. </li><li> Vorbereitung einer PBS pH 7,4-Lösung und mit 60 ul der gleichen fluoreszierenden Markierungspartikel-Lösung in 1 ml PBS-Lösung. </li></ol> 4. Aggregates Größenmessungen <ol><li> Um die Flüssigkeiten (RBC-Suspensionen und PBS) in den Mikrokanal einzufügen, verwenden Sie zwei Glasspritzen von 25 ul und 100 ul. Dies wirddazu beitragen, die Einhaltung des Systems zu verringern. Schließen Sie die Mikrokanal, um die Spritzen über Schläuche und Anschlüsse Montage der Eintrittslöcher. Füllen Sie die Glasspritzen mit der Druckdifferenz, die zwischen dem Flüssigkeitsbehälter und die Spritze. Achten Sie darauf, keine Luftblasen in dem System vorhanden sind. Als ein alternatives Verfahren ist ein Druckregelstrecke, beide Flüssigkeiten in den Mikrokanal zu treiben. </li><li> Setzen Sie den Mikrokanal auf einem inversen Mikroskop Bühne zu einer Hochgeschwindigkeitskamera und einem μPIV System verbunden. Programm die Spritzenpumpe mit den gewünschten Flussraten (beispielsweise Q = 2 &amp; mgr; l / h für Blut verleihen eine Strömungsrate von Q = 8 &amp; mgr; l / h für PBS). HINWEIS: Nur eine Spritzenpumpe verwendet wird. Verwendung von zwei unterschiedlichen Glasspritzen mit zwei verschiedenen Innendurchmessern, ist es möglich, auf die Strömungsrate der Eingabe jedes Zweig des Y-Mikrokanal zu variieren. </li><li> Stecken Sie die beiden Flüssigkeiten im Doppel Y-Mikrokanal jeweils von einem anderen Eintrag Zweig und bei verschiedenen Durchflussmengen, wie in <strong&gt; 1. Um die unterschiedlichen Schergeschwindigkeiten zu testen, ändern Sie den Pumpendurchfluss. Dies hält die gleichen geeigneten Verhältnis (4 in diesem Fall), die zwischen den beiden Zweigen 19 (2 und 3). Warten Sie auf den Fluss zu stabilen Zustand vor dem Erwerb der Messungen zu erreichen: Sichtprüfung der Hochgeschwindigkeitskamera Bilder für einen reibungslosen Ablauf. ANMERKUNG: Das Verhältnis ist wesentlich, um eine lineare Geschwindigkeitsprofil innerhalb des Blutschicht. </li><li> Visualisieren Sie die RBCs mit der Hochgeschwindigkeitskamera. Schließen Sie die Kamera an einen Computer zu steuern, aufnehmen und speichern Sie die Bilder der Fluidströmung. Sobald die beiden Flüssigkeitsströme zu erreichen steady state, starten Sie die Aufnahme. <ol><li> Erwerben Sie mehrere Bilder für eine bessere Bearbeitungsergebnisse. Bestimmen Sie die optimale Kamerabelichtungszeit für ein klares Bild der Aggregate. HINWEIS: Die Belichtungszeit der Kamera für diesen Fall beträgt 0,5 msec. Die Wahl des Zeitintervalls zwischen jedem Rahmen auf der Kamerageschwindigkeit und der Strömungsgeschwindigkeit in t basierender Mikrokanal. Die Zeit zwischen jeder in diesem Verfahren verarbeiteten Rahmen betrug 60 msec. Daher ist eine Kamera zum Aufzeichnen von 18 Bildern pro Sekunde ausreichend. Hinweis: Vermeiden Sie Blut Absetzen in dem Rohr und Spritze, die zu Fehlmessungen führen können. </li></ol></li><li> Verwendung von Bildverarbeitungstechniken (a MATLAB-Programm in diesem Fall), die Bildqualität zu verbessern, detektieren die Aggregate in jedem der Bilder basierend auf Pixelintensitäten (in 4 dargestellt), wie folgt: <ol><li> Verbessern Sie die Bilder mit Hilfe der Histogramm Kontrast Equalizer Methode, um eine bessere Bildqualität für jeden Rahmen erhalten. </li><li> Konvertieren Sie die Graustufenbilder in binäre Bilder. Zu diesem Zweck einen Schwellenwert, die von 0 bis 1, die die Umwandlung eines jeden Pixels bestimmt. Jeder Pixel in dem Bild unter dem Schwellenwert werden als schwarze Pixel erkannt werden, während die Bildelemente mit Werten größer als der Schwellenwert wird als weißes Pixel erkannt werden. </li><li> Füllen Sie dasLöcher (falls vorhanden und notwendig), die den Lücken in einem Aggregat für bessere Ergebnisse. </li><li> Detektieren die Zellen durch Bestimmen benachbarter weiße Pixel in dem binären Bild, so daß benachbarte Zellen als Aggregate verbunden. </li><li> Beschriften Sie die verschiedenen Aggregate detektiert und konvertieren Sie die binäre Bild in eine Rot-Grün-Blau (RGB) Bild zur besseren Visualisierung. Verbinden die Originalrahmen mit jeder der entsprechenden verarbeiteten Bilder, um die Effizienz der Bildverarbeitungstechnik zu überprüfen und sicherzustellen, dass alle Zellen in Betracht gezogen werden, wie in Figur 5 gezeigt ist. Die Schritte 4.5.1, 4.5.2, 4.5.3 , 4.5.4 und 4.5.5 für alle Frames eingefangen. </li><li> Berechnen der Fläche jeder der Rahmen basierend auf der Anzahl von Pixeln detektiert Aggregat. Auf der Basis der Linsenvergrößerung verwendet, berechnen Sie den Umrechnungsfaktor, mit Hilfe einer Eichfadenkreuz, und konvertieren Sie die Ergebnisse in &amp; mgr; m 2. Der Mittelwert der Aggregatgrößen in jeder erkanntRahmen und dann der Mittelwert der Ergebnisse für alle Rahmen, um die durchschnittliche Aggregatgröße für jede Aufnahme der RBC-Suspensionen zu erhalten. </li><li> Berechnung der Fläche eines RBC einen Vertreter geschätzte Anzahl von RBCs innerhalb jedes detektierten Gesamt bestimmen. Unter Verwendung dieser Ergebnisse, die Berechnung der Verteilung der Prozentsatz der RBCs innerhalb jedes Aggregats in Abhängigkeit von der Aggregatgrößen (durch die geschätzte Anzahl der Zellen in jeder Sammel dargestellt), wie in 6 gezeigt. ANMERKUNG: Um die RBC Aggregate zu messen, könnte ImageJ Software (anstelle von MATLAB) verwendet, um dieselben Aktionen für jeden Rahmen durchzuführen. </li></ol></li></ol> 5. Fluidgeschwindigkeit und Schergeschwindigkeit Messungen Bestimmen Sie die Strömungsgeschwindigkeit und damit die Schergeschwindigkeit mit einem μPIV System. <ol><li> Sobald die Daten unter Verwendung des Hochgeschwindigkeitskamera erfasst, schaltet der Doppelimpuls Kamera zum μPIV System verwendet. Verwenden Sie eine Bildverarbeitungssoftware für die BildwechselErwerb der Strömung und der Bildverarbeitung für die Feldgeschwindigkeitsbestimmung. </li><li> Nehmen Sie alle notwendigen Vorsichtsmaßnahmen, abhängig von der Klasse des Lasers, bevor Sie den Laser. Dann schalten Sie das System, die Kamera und den Laser. </li><li> Kalibrieren der Kamera auf der Basis der Linsenvergrößerung eingesetzt. Zu diesem Zweck verwenden Sie eine Mikro von 10 um Präzision unter dem Mikroskop und stellen Sie die Größe von 1 Pixel im Bild. </li><li> Starten Sie den Laser und visualisieren die Partikel in den beiden Flüssigkeiten. Suche nach der Mittelebene der Mikrokanal durch die Konzentration auf die schnellsten Teilchen in der Strömung (das heißt, die schnellste Partikel sollten das hellste sein). </li><li> Gesetzt den dt (Zeitintervall zwischen zwei aufeinanderfolgenden Frames), um die richtige Versetzung der Partikel zu gewährleisten. Die schnellsten Partikel sollten zwischen den beiden Bildern zu bewegen etwa 5 bis 10 Pixel. </li><li> Starten Sie die Aufnahme der Strömung. Legen Sie die Software auf 100 Bildpaare, 5 ms auseinander zu erwerben. Führen Sie die Schritte 5.4, 5.5 und 5.6 für die ganze difschiedlichen RBC-Suspensionen und für verschiedene Scherraten. HINWEIS: Weitere Details der Methode sind in der Studie von Pitts und Fenech 20 angegeben. </li><li> Verarbeiten Sie die mit dem Kreuzkorrelationsverfahren mit der Bildbearbeitungssoftware erworben Aufnahmen. ANMERKUNG: Diese besteht aus der Diskretisierung des Paares von Bildern in kleine Fenster von vorbestimmter Größe (bezogen auf den Fluidstrom und dem durch den Benutzer ausgewählten Zeitintervall) genannt Korrelationsfenstern und nach der Verschiebung der Teilchen in jedem Fenster. <ol><li> Erstens, festzustellen, ob die erfassten Bilder die Vorverarbeitung (einschließlich Hintergrundabzug, &quot;base-Clipping&quot; 21 oder überlappenden Bild 22,23) für eine bessere Datenverarbeitung. </li><li> Dann wählen Sie den Korrelationsfenster Größe und Form, sowie der Prozentsatz der Bilder überlappen. Eine detaillierte Studie wurde von Pitts et al 24 durchgeführt., Um die optimalen Parameter und Bildvorverarbeitung Techniken zum Blut zu bestimmenfließen in verschiedenen Kanalkonfigurationen. Die Ergebnisse sind als eine durchschnittliche Geschwindigkeitsfeld von den 100 Bildpaare und die Fehler Root Mean Square (RMS) in der Geschwindigkeit berechnet. </li></ol></li><li> Extrahieren eines Geschwindigkeitsprofils am Kanalausgang, aus den verarbeiteten Daten, wie in Abbildung 7 dargestellt. Für ein besseres Profil, ist der Mittelwert der Geschwindigkeitsfeld im Raum. HINWEIS: Die Balken Zusammensetzen des Geschwindigkeitsprofils entsprechen der relativ zu der Kanalbreite gewählt Korrelationsfenstergröße. Der Fehler in der Geschwindigkeit RMS ist auch in Figur 7 gezeigt, die den Fehler in der experimentellen Geschwindigkeitsschätzung. </li><li> Den Laser auszuschalten, wenn alle Messungen und die Verarbeitung durchgeführt werden ,. Beenden Sie alle Komponenten des Systems: Software, Kameras, Bewegung Bühne, Computer und Laser. </li><li> Um die Schergeschwindigkeit zu berechnen, zuerst erkennen und schätzen die Blutdicke in den Mikrokanal auf der Grundlage des Hochgeschwindigkeitskamera-Aufzeichnung. Zu diesem Zweck, ist der Mittelwert allerdie Rahmen in der spezifischen Aufzeichnungs ein Hintergrundbild des Videos zu erzielen. Begrenzen die Blutschicht (wie in Figur 8 für die RBC-Suspensionen bei 10 ul / h fließt, wenn bei 5%, 10% und 15% Hämatokrit suspendiert gezeigt). Besorgen Sie sich die Velocity-Wert für das entsprechende Blutschichtdicke und die Berechnung der Scherrate durch Teilen der Geschwindigkeitswert durch das Blut Schichtdicke. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Unter Verwendung der vorliegenden Methode ist es möglich, qualitativ und quantitativ analysiert die RBC-Aggregate unter verschiedenen Strömungsbedingungen und Hämatokritwerten. Für die erfolgreiche Prüfung und Aggregat Detektion ist es von entscheidender Bedeutung, um den entsprechenden Geschwindigkeitsverhältnis zwischen den beiden Fluiden an der Mikrokanaleintrag zu bestimmen. Dieses Verhältnis ist sehr wichtig, um eine optimale Blutschichtdicke, wo das Geschwindigkeitsprofil quasi lineare 19 erhalte...

An erratum was issue for <a href="http://www.jove.com/video/52719">Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation</a>. The introduction section was updated.

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52719">Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation</a>. The introduction section was updated.

Erratum: Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Rote Blutkörperchen (Erythrozyten) spielen eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung des rheologischen Verhaltens von Blut. Sie sind fast einzigartig für die besonderen Eigenschaften von Blut in vitro und in vivo verantwortlich ist. Unter physiologischen Bedingungen RBCs besetzen 40% bis 45% des Blutvolumens. Der Mikrozirkulation, RBCs nur besetzen bis zu 20% des Blutvolumens durch kleinere Gefäßdurchmesser und dem Plasma skimming effect 1. Dieses Phänomen der Plasmareduktion in der Mikrozirkulation als Fahraeus Wirkung bekannt. Bei niedrigen Schergeschwindigkeiten sind RBCs in der Lage über die Bridge und bilden eine oder dreidimensionale Strukturen genannt &quot;Geldrollen&quot; oder Aggregaten, die damit verbundenen Auswirkungen auf die nicht-Newtonsche Verhalten von Blut. Jedoch ist der Mechanismus der RBC Aggregation nicht vollständig verstanden. Zwei Theorien existieren, um die Aggregation von Erythrozyten zu modellieren: die Überbrückung von Zellen Theorie aufgrund der Quervernetzung der Makromoleküle 2 und dem Kraft attraktion Theorie durch Verarmung der Moleküle aufgrund der osmotischen Gradienten 3 verursacht. Typischerweise ist für menschliches Blut, Aggregate bilden bei sehr niedrigen Scherraten 4 im Bereich von 1 bis 10 s -1 aufweist. Oberhalb dieses Bereichs neigen Erythrozyten zu zerlegen und separat zu fließen innerhalb des Gefäßes. Das Verständnis der Bedingungen der Aggregate Bildung eines großen Wert auf die Hämorheologie Bereich in Bezug auf die Definition rheologische Verhalten Blut. Diese Aggregate werden oft an der Makrozirkulation Niveau (&gt; 300 &amp; mgr; m Durchmesser) 5 zu sehen. An diesem Maßstab wird Blut als Newtonsche Flüssigkeit und einer homogenen Mischung berücksichtigt. Jedoch werden diese Aggregate seltener im Kapillarebene (4-10 &amp; mgr; m im Durchmesser) zu sehen sind und in der Regel ein Hinweis auf pathologische Zustände wie Diabetes 6 und Fettleibigkeit. Andere pathologische Zustände, die verändern könnten RBC Aggregation gehören entzündlich oder infektiös Bedingungenkardiovaskuläre Erkrankungen wie Bluthochdruck oder Arteriosklerose, genetischen Erkrankungen und chronische Erkrankungen 7. Daher steht die RBC Aggregationsmechanismus und Analysieren dieser Entitäten (durch Definition einer Beziehung zwischen der Größe dieser Aggregate und der Strömungsverhältnisse) könnte zum Verständnis der microrheological Verhalten von Blut führen und somit in Beziehung zu klinischen Anwendungen. RBC Aggregate kann durch verschiedene Faktoren wie der Hämatokrit (Volumen von RBCs in Blut), der Scherrate, des Gefäßdurchmessers, der RBC-Membransteifigkeit und dem Suspendiermedium Zusammensetzung 8-10 verändert werden. Daher werden kontrollierten Bedingungen, um die RBC-Aggregate effektiv zu analysieren erforderlich. Mehrere Verfahren sind in der Lage, die Aggregatbildung durch statische Messungen Aggregation (Aggregationsindex) zu analysieren, die relevanten Informationen über Blut Verhalten bietet. Diese Verfahren umfassen unter anderem die BlutsenkungsgeschwindigkeitVerfahren 11, die Lichtübertragungsverfahren 12, die Lichtreflexionsverfahren 13 und die niedrige Scherviskosität Verfahren 14. Einige Studien haben versucht, RBC Aggregation untersuchen und bestimmen den Grad der Aggregation in kontrollierten Strömungsverhältnissen 15-17. Allerdings sind diese Studien indirekt untersuchen RBC Aggregatgrößen durch Bestimmen des Verhältnisses der belegten Raum in einem Schersystem gemessen basierend auf mikroskopische Blutbilder die Informationen über den Grad der Aggregation als auch der lokalen Viskosität. Wir stellen daher ein neues Verfahren, um direkt zu quantifizieren RBC-Aggregate in der Mikrozirkulation, dynamisch, unter kontrollierten und konstanten Scherraten. RBC-Suspensionen werden mitgerissen, in einem doppelten Y-Mikrokanal (wie in Figur 1 dargestellt), mit einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS) somit die Schaffung einer Scherströmung in der Blutschicht. Innerhalb dieser Blutschicht eine konstante Shear Rate erhalten werden kann. Die RBC-Suspensionen bei verschiedenen Hämatokrit (H) Ebenen (5%, 10% und 15%) und unter verschiedenen Scherraten (2-11 sec -1) getestet. Die Blutgeschwindigkeit und Schergeschwindigkeit werden mit einem Mikro Particle Image Velocimetry (μPIV) System, während die Strömung visualisiert mit einer Hochgeschwindigkeitskamera bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse werden dann mit einem MATLAB-Code basierend auf den Bildintensitäten, um die RBCs erfassen und Aggregatgrößen verarbeitet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>SU8-50 epoxy based negative Photo-resist</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8-50 developer</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Sylgard-184</td>
			<td>Dow-Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-50 series Plasma system&#160;</td>
			<td>Plasma Etch</td>
			<td>PE-50 series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes with K2 EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>B367861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>004260F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poshpate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tracer fluorescent particles solution (15 mL)</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>R800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aggregometer</td>
			<td>RheoMeditech</td>
			<td>Rheo Scan AnD300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringes (50 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing (Tygon)</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>AAA00001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed camera (Basler)</td>
			<td>Graftek Imaging Inc.</td>
			<td>basler acA2000-340km</td>
			<td>A camera capable of recording 18 frames per seconds could be used.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double pulsed camera&#160;</td>
			<td>LaVision</td>
			<td>Imager Intense</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope MITAS</td>
			<td>LaVision</td>
			<td>MITAS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nd:YAG laser</td>
			<td>New Wave Research</td>
			<td>Solo-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump (Nexus3000 and PicoPlus)</td>
			<td>Chemyx Inc. and Harvard Apparatus</td>
			<td>Nexus3000 and PicoPlus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DaVis software</td>
			<td>LaVision</td>
			<td>Davis</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

controlled microfluidic environment for dynamic investigation of red blood cell aggregation

Blut als nicht-Newtonsche Biofluid, stellt die Gegenstand zahlreicher Studien im Hämorheologie Feldes. Blutbestandteile sind rote Blutkörperchen, weiße Blutkörperchen und Blutplättchen, die im Blutplasma suspendiert sind. Aufgrund der Fülle der RBCs (40% bis 45% des Blutvolumens) diktiert ihr Verhalten, das rheologische Verhalten von Blut besonders in der Mikrozirkulation. Bei sehr niedrigen Scherraten werden RBCs gesehen zu montieren und Form Entitäten, die als Aggregate, die das nicht-Newtonsche Verhalten von Blut bewirkt. Es ist wichtig, die Bedingungen der Granulatbildung zu verstehen, um die Rheologie des Blutes in die Mikrozirkulation zu verstehen. Das hier beschriebene Protokoll beschreibt die experimentelle Vorgehensweise, um die RBC-Aggregate in der Mikrozirkulation unter konstanten Scherrate quantitativ zu bestimmen, basierend auf Bildverarbeitung. Zu diesem Zweck werden RBC-Suspensionen geprüft und 120 x 60 &amp; mgr; m Poly-Dimethyl-Siloxan (PDMS) Mikrokanäle analysiert. Die RBC-Suspensionen sind entregnete es mit einem zweiten Fluid, um eine lineare Geschwindigkeitsprofil innerhalb des Blutschicht zu erhalten und somit eine Vielzahl von konstanten Scherraten. Die Schergeschwindigkeit ist mit einem Mikro Particle Image Velocimetry (μPIV) Systems bestimmt, während RBC Aggregate werden mit einer Hochgeschwindigkeitskamera sichtbar gemacht. Die der RBC Aggregate aufgenommenen Videos unter Verwendung von Bildverarbeitungstechniken, um die Aggregatgrößen basierend auf den Bildern Intensitäten zu bestimmen.

Ein Beispiel der Zwei-Fluid-Strömung in der doppelten Y-Mikrokanal ist in Abbildung 2 für die menschliche RBCs bei 5%, 10% und 15% Hämatokrit suspendiert und bei 10 &amp; mgr; l / h fließt gezeigt ist. Figur 3 zeigt den Unterschied in der Aggregatgrößen, wenn die Strömung in dem Kanal wird aus 10 &amp; mgr; l / h bis 5 &amp; mgr; l / h für einen Hämatokrit von 10% reduziert. Dies ergibt eine qualitative Vorstellung von der Grße der Aggregate beim Variieren der Hämatokrit und ...

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Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Das Protokoll beschriebenen Einzelheiten ein experimentelles Verfahren, um rote Blutzellen (RBC) Aggregate unter einer kontrollierten und konstanten Scherrate zu quantifizieren, auf Basis von Bildverarbeitungstechniken. Das Ziel des Protokolls ist es, RBC Aggregatgrößen an den entsprechenden Schergeschwindigkeit kontrolliert mikrofluidischen Umwelt beziehen.

Controlled Environment Mikrofluidik für dynamische Untersuchung der Aggregation roter Blutzellen

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white ...

controlled-microfluidic-environment-for-dynamic-investigation-red

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.7K Aufrufe.  University of Ottawa.  Das Protokoll beschriebenen Einzelheiten ein experimentelles Verfahren, um rote Blutzellen (RBC) Aggregate unter einer kontrollierten und konstanten Scherrate zu quantifizieren, auf Basis von Bildverarbeitungstechniken. Das Ziel des Protokolls ist es, RBC Aggregatgrößen an den entsprechenden Schergeschwindigkeit kontrolliert mikrofluidischen Umwelt beziehen. 

Serie: Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Mikrofabrizierten Plattformen für Mechanisch Dynamische Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Forschung

Biotechnik

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

Korrelative Mikroskopie für 3D-Strukturanalyse von dynamischen Wechselwirkungen

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Verbesserte Methode zur Präparation einer menschlichen Zelle-basierte, Kontakt Modell der Blut-Hirn-Schranke

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher neutrophil counts in the blood are usually an indicator of ongoing infections, while low neutrophil counts are a warning sign for higher risks for infections. To accomplish their functions, neutrophils also have to be able to move effectively from the blood where they spend most of their life, into tissues, where infections occur. Consequently, any defects in the ability of neutrophils to migrate can increase the risks for infections, even when neutrophils are present in appropriate numbers in the blood. However, measuring neutrophil migration ability in the clinic is a challenging task, which is time consuming, requires large volume of blood, and expert knowledge. To address these limitations, we designed a robust microfluidic assays for neutrophil migration, which requires a single droplet of unprocessed blood, circumvents the need for neutrophil separation, and is easy to quantify on a simple microscope. In this assay, neutrophils migrate directly from the blood droplet, through small channels, towards the source of chemoattractant. To prevent the granular flow of red blood cells through the same channels, we implemented mechanical filters with right angle turns that selectively block the advance of red blood cells. We validated the assay by comparing neutrophil migration from blood droplets collected from finger prick and venous blood. We also compared these whole blood (WB) sources with neutrophil migration from samples of purified neutrophils and found consistent speed and directionality between the three sources. This microfluidic platform will enable the study of human neutrophil migration in the clinic and the research setting to help advance our understanding of neutrophil functions in health and disease.

This protocol details an assay designed to measure human neutrophil chemotaxis from one droplet of whole blood with robust reproducibility. This approach circumvents the need for neutrophil separation and requires only a few minutes of assay preparation time. The microfluidic chip enables the repeated measure of neutrophil chemotaxis over time in infants or small mammals, where sample volume is limited.

Mikrofluidik-Plattform zur Messung der Neutrophilen-Chemotaxis von Rohboden Vollblut

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

Wulst Aggregationsassays zur Charakterisierung von putativen Zelladhäsionsmoleküle

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

Mikrofluidik-Strömungskammern Mit Rekonstituierte Blut Hämostaseologie und Transfusions Platelet zu Modell<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO2 nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO2 NF mat; transfer-printing of TiO2 NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.

This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 &#181;L of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.

Vollautomatische Schleuder Mikrofluidik-Vorrichtung zur Ultrasensitive Proteindetektion aus Vollblut

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach recently explored for the development of autologous replacements involves the differentiation of stem cells into chondrocytes. To initiate this chondrogenesis, a degree of compaction of the stem cells is required; hence, we demonstrated the feasibility of magnetically condensing cells, both within thick scaffolds and scaffold-free, using miniaturized magnetic field sources as cell attractors. This magnetic approach was also used to guide aggregate fusion and to build scaffold-free, organized, three-dimensional (3D) tissues several millimeters in size. In addition to having an enhanced size, the tissue formed by magnetic-driven fusion presented a significant increase in the expression of collagen II, and a similar trend was observed for aggrecan expression. As the native cartilage was subjected to forces that influenced its 3D structure, dynamic maturation was also performed. A bioreactor that provides mechanical stimuli was used to culture the magnetically seeded scaffolds over a 21-day period. Bioreactor maturation largely improved chondrogenesis into the cellularized scaffolds; the extracellular matrix obtained under these conditions was rich in collagen II and aggrecan. This work outlines the innovative potential of magnetic condensation of labeled stem cells and dynamic maturation in a bioreactor for improved chondrogenic differentiation, both scaffold-free and within polysaccharide scaffolds.

Chondrogenesis from stem cells requires fine tuning the culture conditions. Here, we present a magnetic approach for condensing cells, an essential step to initiate chondrogenesis. In addition, we show that dynamic maturation in a bioreactor applies mechanical stimulation to the cellular constructs and enhances cartilaginous extracellular matrix production.

3D Magnetic Stem Cell Aggregation und Bioreactor Ausreifung für Knorpelregeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

Mehrstufige Höhenverstellbarem Lithografie für Valved Mehrschichtige Mikrofluidiksysteme

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is restricted to platelet deposition only. The intricate relationship between Ca2+-dependent coagulation and platelet function requires careful and controlled recalcification of blood prior to analysis. Our setup uses a Y-shaped mixing channel, which supplies concentrated Ca2+/Mg2+ buffer to flowing blood just prior to perfusion, enabling rapid recalcification without sample stasis. A ten-fold difference in flow velocity between both reservoirs minimizes dilution. The recalcified blood is then perfused in a collagen-coated analysis chamber, and differential labeling permits real-time imaging of both platelet and fibrin deposition using fluorescence video microscopy. The system uses only commercially available tools, increasing the chances of standardization. Reconstitution of thrombocytopenic blood with platelets from banked concentrates furthermore models platelet transfusion, proving its use in this research domain. Exemplary data demonstrated that coagulation onset and fibrin deposition were linearly dependent on the platelet concentration, confirming the relationship between primary and secondary hemostasis in our model. In a timeframe of 16 perfusion min, contact activation did not take place, despite recalcification to normal Ca2+ and Mg2+ levels. When coagulation factor XIIa was inhibited by corn trypsin inhibitor, this time frame was even longer, indicating a considerable dynamic range in which the changes in the procoagulant nature of the platelets can be assessed. Co-immobilization of tissue factor with collagen significantly reduced the time to onset of coagulation, but not its rate. The option to study the tissue factor and/or the contact pathway increases the versatility and utility of the assay.

This paper describes an experimental model of hemostasis that simultaneously measures platelet function and coagulation. Platelet and fibrin fluorescence is measured in real-time, and platelet adhesion rate, coagulation rate, and onset of coagulation are determined. The model is used to determine platelet procoagulant properties under flow in concentrates for transfusion.

Ein Mikrofluidik-Flow-Kammer-Modell für Platelet Transfusions und Hämostase Maßnahmen Platelet Deposition und Fibrinbildung in Echtzeit

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...