Diese Arbeit wurde von der Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada unterstützt. Mikrofabrikation wurde mit Unterstützung der McGill Nanotools Microfab Anlage an der McGill Universität und der Abteilung für Elektronik an der Carleton University durchgeführt.

Blut von gesunden Personen mit Zustimmung der Ethikkommission der Universität Ottawa (H11-13-06) gesammelt. 1. Mikrokanal Fabrication Die Mikrokanäle werden basierend auf den Standard-Photolithographieverfahren 18 hergestellt. <ol><li> Entwerfen Sie die Mikrokanalgeometrie mit einem Design-Software Computer Aided (CAD) und drucken Sie die Konfiguration auf einer Transparenz Photomaske. Diese Masken sind von entscheidender Bedeutung, da sie die Lichtpfad aufgrund während des Herstellungsprozesses. In diesem Fall sind die Mikrokanalabmessungen betragen 120 &amp; mgr; m in der Dicke, 60 &amp; mgr; m in der Tiefe und 7 mm in der Länge. </li><li> In einem Reinraum, Schleuderbeschichtung ein Epoxidharz auf der Basis negativer Photoresist auf einem Siliciumwafer bei 2000 Upm für 30 s, um die gewünschte Mikrokanaltiefe (60 um) zu erhalten. </li><li> Aussetzen des Wafers und der Photomaske unter einer UV-Lampe bei 650 mJ / cm 2 für 70 sec. Stellen Sie sicher, dass nur die transparenten Bereiche des ExposesPhotomaske auf die UV-Licht. Die Belichtung der lichtdurchlässigen Bereiche können für die Polymerisation der Ketten, was zu einer Härtung der Photolack. Tauchen Sie die Siliziumstück in einen Entwickler, um mehr als Photolack zu entfernen. </li><li> Sobald die Form gefertigt, Mix ein Siliciumbasiertes Elastomer und ein Härtungsmittel in einem Verhältnis von 10: 1, um eine Lösung von Poly-Dimethyl-Siloxan (PDMS) zu erstellen. Legen Sie die PDMS-Lösung in einer Vakuumkammer zu entgasen. Gieße es in die Form und erhitzt bei 60 ° C für 90 min, um Mikrokanäle zu schaffen. Dann binden die einzelnen Kanäle auf einem Glasobjektträger unter Verwendung von Sauerstoffplasma Ausgleich für 90 sec. HINWEIS: Die PDMS entgasen Vorgang ist notwendig, um die Luftblasen durch den Mischvorgang erzeugt beseitigen geführt. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Mikrokanalabmessungen ermöglichen die erfolgreiche Prüfung. In diesem Protokoll werden die Mikrokanäle einen rechteckigen Querschnitt von 120 x 60 um. Im Vergleich dazu hat eine durchschnittliche RBC einen Durchmesser von 8 um und einer Dicke von 2 um. DieDaher liegt der Mikrokanalbreite ausreichend, um angemessene Aggregation zu beobachten und genau zu bestimmen, die Geschwindigkeitsprofile. </li></ol> 2. Blut Vorbereitung <ol><li> Sammeln Blut von gesunden freiwilligen Spendern, nach Zustimmung einer Ethikkommission. Behandeln Sie das Blut mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in den Sammelröhrchen vorhanden (7,2 mg EDTA in 4 ml Blut). HINWEIS: Das EDTA wird verwendet, um die Blutgerinnung zu vermeiden. </li><li> Zentrifugieren Sie die Blutproben dreimal für 10 Minuten bei 1.400 xg (3000 rpm), um die Blutbestandteile zu trennen. Als Folge der Zentrifugation beobachten drei unterschiedliche Schichten. HINWEIS: Die drei Schichten sind die RBC-Schicht (an der Unterseite des Rohres angeordnet ist), der Leukozytenfilm (bestehend aus weißen Blutkörperchen und Blutplättchen auf der RBC-Schicht angeordnet ist) und der Plasmaschicht (über allen der anderen befindet Bestandteile). <ol><li> Nach der ersten Zentrifugation, sammeln Blutplasma mit Hilfe eines Blut Pipette. Vermeiden Sie contakt mit der Buffy-Coat. </li><li> Sammeln und entsorgen der Buffy-Coat in einem Behälter mit Bleichmittel auf 10% verdünnt. </li><li> 3 ml PBS, pH 7,4, zu jeder der Röhren mit dem restlichen RBC-Schicht und sorgen für die richtige Balance zwischen der Zentrifuge. Wieder sanft die Rohre und Zentrifuge bei 1.400 xg mischen (3.000 rpm) für 10 min. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die PBS-Lösung keine Magnesium oder Calcium enthalten, da sie die Zelladhäsion verändern könnten. </li><li> Entsorgen Sie die PBS in den Rohren nach der zweiten Zentrifugation und entfernen Sie die restlichen Speckhaut, falls vorhanden. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.3 und 2.2.4 für die dritte Zentrifugation, um saubere RBCs ergeben. </li></ol></li><li> Mischen Sie die erforderliche Menge (0,05, 0,1 und 0,15 ml) der Rein RBCs mit Plasma (0,95, 0,9 und 0,85 ml) in einem 1-ml-Röhrchen, um RBC-Suspensionen mit der entsprechenden (5% zu erhalten, 10% und 15% ) Hämatokrit. Überprüfen Hämatokritwerte mit einer Mikrozentrifuge. </li></ol> 3. Flüssigkeiten Vorbereitung <ol><li> In 60 ul des fluoreszierenden Tracerpartikel-Lösung (1% Feststoff, d Partikel = 0 ist. 86 &amp; mgr; m, ABS λ = 542 nm und λ = 612 nm Emissions) in die 1 ml RBC-Suspension Röhren. HINWEIS: Die fluoreszierenden Markierungspartikel (intern gefärbte Polystyrol-Partikel) verwendet werden, um die Geschwindigkeit der Strömung innerhalb des Mikrokanals zu messen. Diese Partikel fluoreszieren, wenn auf die entsprechende Wellenlänge des Laserstrahls (λ = 542 nm) belichtet. </li><li> Vorbereitung einer PBS pH 7,4-Lösung und mit 60 ul der gleichen fluoreszierenden Markierungspartikel-Lösung in 1 ml PBS-Lösung. </li></ol> 4. Aggregates Größenmessungen <ol><li> Um die Flüssigkeiten (RBC-Suspensionen und PBS) in den Mikrokanal einzufügen, verwenden Sie zwei Glasspritzen von 25 ul und 100 ul. Dies wirddazu beitragen, die Einhaltung des Systems zu verringern. Schließen Sie die Mikrokanal, um die Spritzen über Schläuche und Anschlüsse Montage der Eintrittslöcher. Füllen Sie die Glasspritzen mit der Druckdifferenz, die zwischen dem Flüssigkeitsbehälter und die Spritze. Achten Sie darauf, keine Luftblasen in dem System vorhanden sind. Als ein alternatives Verfahren ist ein Druckregelstrecke, beide Flüssigkeiten in den Mikrokanal zu treiben. </li><li> Setzen Sie den Mikrokanal auf einem inversen Mikroskop Bühne zu einer Hochgeschwindigkeitskamera und einem μPIV System verbunden. Programm die Spritzenpumpe mit den gewünschten Flussraten (beispielsweise Q = 2 &amp; mgr; l / h für Blut verleihen eine Strömungsrate von Q = 8 &amp; mgr; l / h für PBS). HINWEIS: Nur eine Spritzenpumpe verwendet wird. Verwendung von zwei unterschiedlichen Glasspritzen mit zwei verschiedenen Innendurchmessern, ist es möglich, auf die Strömungsrate der Eingabe jedes Zweig des Y-Mikrokanal zu variieren. </li><li> Stecken Sie die beiden Flüssigkeiten im Doppel Y-Mikrokanal jeweils von einem anderen Eintrag Zweig und bei verschiedenen Durchflussmengen, wie in <strong&gt; 1. Um die unterschiedlichen Schergeschwindigkeiten zu testen, ändern Sie den Pumpendurchfluss. Dies hält die gleichen geeigneten Verhältnis (4 in diesem Fall), die zwischen den beiden Zweigen 19 (2 und 3). Warten Sie auf den Fluss zu stabilen Zustand vor dem Erwerb der Messungen zu erreichen: Sichtprüfung der Hochgeschwindigkeitskamera Bilder für einen reibungslosen Ablauf. ANMERKUNG: Das Verhältnis ist wesentlich, um eine lineare Geschwindigkeitsprofil innerhalb des Blutschicht. </li><li> Visualisieren Sie die RBCs mit der Hochgeschwindigkeitskamera. Schließen Sie die Kamera an einen Computer zu steuern, aufnehmen und speichern Sie die Bilder der Fluidströmung. Sobald die beiden Flüssigkeitsströme zu erreichen steady state, starten Sie die Aufnahme. <ol><li> Erwerben Sie mehrere Bilder für eine bessere Bearbeitungsergebnisse. Bestimmen Sie die optimale Kamerabelichtungszeit für ein klares Bild der Aggregate. HINWEIS: Die Belichtungszeit der Kamera für diesen Fall beträgt 0,5 msec. Die Wahl des Zeitintervalls zwischen jedem Rahmen auf der Kamerageschwindigkeit und der Strömungsgeschwindigkeit in t basierender Mikrokanal. Die Zeit zwischen jeder in diesem Verfahren verarbeiteten Rahmen betrug 60 msec. Daher ist eine Kamera zum Aufzeichnen von 18 Bildern pro Sekunde ausreichend. Hinweis: Vermeiden Sie Blut Absetzen in dem Rohr und Spritze, die zu Fehlmessungen führen können. </li></ol></li><li> Verwendung von Bildverarbeitungstechniken (a MATLAB-Programm in diesem Fall), die Bildqualität zu verbessern, detektieren die Aggregate in jedem der Bilder basierend auf Pixelintensitäten (in 4 dargestellt), wie folgt: <ol><li> Verbessern Sie die Bilder mit Hilfe der Histogramm Kontrast Equalizer Methode, um eine bessere Bildqualität für jeden Rahmen erhalten. </li><li> Konvertieren Sie die Graustufenbilder in binäre Bilder. Zu diesem Zweck einen Schwellenwert, die von 0 bis 1, die die Umwandlung eines jeden Pixels bestimmt. Jeder Pixel in dem Bild unter dem Schwellenwert werden als schwarze Pixel erkannt werden, während die Bildelemente mit Werten größer als der Schwellenwert wird als weißes Pixel erkannt werden. </li><li> Füllen Sie dasLöcher (falls vorhanden und notwendig), die den Lücken in einem Aggregat für bessere Ergebnisse. </li><li> Detektieren die Zellen durch Bestimmen benachbarter weiße Pixel in dem binären Bild, so daß benachbarte Zellen als Aggregate verbunden. </li><li> Beschriften Sie die verschiedenen Aggregate detektiert und konvertieren Sie die binäre Bild in eine Rot-Grün-Blau (RGB) Bild zur besseren Visualisierung. Verbinden die Originalrahmen mit jeder der entsprechenden verarbeiteten Bilder, um die Effizienz der Bildverarbeitungstechnik zu überprüfen und sicherzustellen, dass alle Zellen in Betracht gezogen werden, wie in Figur 5 gezeigt ist. Die Schritte 4.5.1, 4.5.2, 4.5.3 , 4.5.4 und 4.5.5 für alle Frames eingefangen. </li><li> Berechnen der Fläche jeder der Rahmen basierend auf der Anzahl von Pixeln detektiert Aggregat. Auf der Basis der Linsenvergrößerung verwendet, berechnen Sie den Umrechnungsfaktor, mit Hilfe einer Eichfadenkreuz, und konvertieren Sie die Ergebnisse in &amp; mgr; m 2. Der Mittelwert der Aggregatgrößen in jeder erkanntRahmen und dann der Mittelwert der Ergebnisse für alle Rahmen, um die durchschnittliche Aggregatgröße für jede Aufnahme der RBC-Suspensionen zu erhalten. </li><li> Berechnung der Fläche eines RBC einen Vertreter geschätzte Anzahl von RBCs innerhalb jedes detektierten Gesamt bestimmen. Unter Verwendung dieser Ergebnisse, die Berechnung der Verteilung der Prozentsatz der RBCs innerhalb jedes Aggregats in Abhängigkeit von der Aggregatgrößen (durch die geschätzte Anzahl der Zellen in jeder Sammel dargestellt), wie in 6 gezeigt. ANMERKUNG: Um die RBC Aggregate zu messen, könnte ImageJ Software (anstelle von MATLAB) verwendet, um dieselben Aktionen für jeden Rahmen durchzuführen. </li></ol></li></ol> 5. Fluidgeschwindigkeit und Schergeschwindigkeit Messungen Bestimmen Sie die Strömungsgeschwindigkeit und damit die Schergeschwindigkeit mit einem μPIV System. <ol><li> Sobald die Daten unter Verwendung des Hochgeschwindigkeitskamera erfasst, schaltet der Doppelimpuls Kamera zum μPIV System verwendet. Verwenden Sie eine Bildverarbeitungssoftware für die BildwechselErwerb der Strömung und der Bildverarbeitung für die Feldgeschwindigkeitsbestimmung. </li><li> Nehmen Sie alle notwendigen Vorsichtsmaßnahmen, abhängig von der Klasse des Lasers, bevor Sie den Laser. Dann schalten Sie das System, die Kamera und den Laser. </li><li> Kalibrieren der Kamera auf der Basis der Linsenvergrößerung eingesetzt. Zu diesem Zweck verwenden Sie eine Mikro von 10 um Präzision unter dem Mikroskop und stellen Sie die Größe von 1 Pixel im Bild. </li><li> Starten Sie den Laser und visualisieren die Partikel in den beiden Flüssigkeiten. Suche nach der Mittelebene der Mikrokanal durch die Konzentration auf die schnellsten Teilchen in der Strömung (das heißt, die schnellste Partikel sollten das hellste sein). </li><li> Gesetzt den dt (Zeitintervall zwischen zwei aufeinanderfolgenden Frames), um die richtige Versetzung der Partikel zu gewährleisten. Die schnellsten Partikel sollten zwischen den beiden Bildern zu bewegen etwa 5 bis 10 Pixel. </li><li> Starten Sie die Aufnahme der Strömung. Legen Sie die Software auf 100 Bildpaare, 5 ms auseinander zu erwerben. Führen Sie die Schritte 5.4, 5.5 und 5.6 für die ganze difschiedlichen RBC-Suspensionen und für verschiedene Scherraten. HINWEIS: Weitere Details der Methode sind in der Studie von Pitts und Fenech 20 angegeben. </li><li> Verarbeiten Sie die mit dem Kreuzkorrelationsverfahren mit der Bildbearbeitungssoftware erworben Aufnahmen. ANMERKUNG: Diese besteht aus der Diskretisierung des Paares von Bildern in kleine Fenster von vorbestimmter Größe (bezogen auf den Fluidstrom und dem durch den Benutzer ausgewählten Zeitintervall) genannt Korrelationsfenstern und nach der Verschiebung der Teilchen in jedem Fenster. <ol><li> Erstens, festzustellen, ob die erfassten Bilder die Vorverarbeitung (einschließlich Hintergrundabzug, &quot;base-Clipping&quot; 21 oder überlappenden Bild 22,23) für eine bessere Datenverarbeitung. </li><li> Dann wählen Sie den Korrelationsfenster Größe und Form, sowie der Prozentsatz der Bilder überlappen. Eine detaillierte Studie wurde von Pitts et al 24 durchgeführt., Um die optimalen Parameter und Bildvorverarbeitung Techniken zum Blut zu bestimmenfließen in verschiedenen Kanalkonfigurationen. Die Ergebnisse sind als eine durchschnittliche Geschwindigkeitsfeld von den 100 Bildpaare und die Fehler Root Mean Square (RMS) in der Geschwindigkeit berechnet. </li></ol></li><li> Extrahieren eines Geschwindigkeitsprofils am Kanalausgang, aus den verarbeiteten Daten, wie in Abbildung 7 dargestellt. Für ein besseres Profil, ist der Mittelwert der Geschwindigkeitsfeld im Raum. HINWEIS: Die Balken Zusammensetzen des Geschwindigkeitsprofils entsprechen der relativ zu der Kanalbreite gewählt Korrelationsfenstergröße. Der Fehler in der Geschwindigkeit RMS ist auch in Figur 7 gezeigt, die den Fehler in der experimentellen Geschwindigkeitsschätzung. </li><li> Den Laser auszuschalten, wenn alle Messungen und die Verarbeitung durchgeführt werden ,. Beenden Sie alle Komponenten des Systems: Software, Kameras, Bewegung Bühne, Computer und Laser. </li><li> Um die Schergeschwindigkeit zu berechnen, zuerst erkennen und schätzen die Blutdicke in den Mikrokanal auf der Grundlage des Hochgeschwindigkeitskamera-Aufzeichnung. Zu diesem Zweck, ist der Mittelwert allerdie Rahmen in der spezifischen Aufzeichnungs ein Hintergrundbild des Videos zu erzielen. Begrenzen die Blutschicht (wie in Figur 8 für die RBC-Suspensionen bei 10 ul / h fließt, wenn bei 5%, 10% und 15% Hämatokrit suspendiert gezeigt). Besorgen Sie sich die Velocity-Wert für das entsprechende Blutschichtdicke und die Berechnung der Scherrate durch Teilen der Geschwindigkeitswert durch das Blut Schichtdicke. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Unter Verwendung der vorliegenden Methode ist es möglich, qualitativ und quantitativ analysiert die RBC-Aggregate unter verschiedenen Strömungsbedingungen und Hämatokritwerten. Für die erfolgreiche Prüfung und Aggregat Detektion ist es von entscheidender Bedeutung, um den entsprechenden Geschwindigkeitsverhältnis zwischen den beiden Fluiden an der Mikrokanaleintrag zu bestimmen. Dieses Verhältnis ist sehr wichtig, um eine optimale Blutschichtdicke, wo das Geschwindigkeitsprofil quasi lineare 19 erhalte...

An erratum was issue for <a href="http://www.jove.com/video/52719">Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation</a>. The introduction section was updated.

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52719">Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation</a>. The introduction section was updated.

Erratum: Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Rote Blutkörperchen (Erythrozyten) spielen eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung des rheologischen Verhaltens von Blut. Sie sind fast einzigartig für die besonderen Eigenschaften von Blut in vitro und in vivo verantwortlich ist. Unter physiologischen Bedingungen RBCs besetzen 40% bis 45% des Blutvolumens. Der Mikrozirkulation, RBCs nur besetzen bis zu 20% des Blutvolumens durch kleinere Gefäßdurchmesser und dem Plasma skimming effect 1. Dieses Phänomen der Plasmareduktion in der Mikrozirkulation als Fahraeus Wirkung bekannt. Bei niedrigen Schergeschwindigkeiten sind RBCs in der Lage über die Bridge und bilden eine oder dreidimensionale Strukturen genannt &quot;Geldrollen&quot; oder Aggregaten, die damit verbundenen Auswirkungen auf die nicht-Newtonsche Verhalten von Blut. Jedoch ist der Mechanismus der RBC Aggregation nicht vollständig verstanden. Zwei Theorien existieren, um die Aggregation von Erythrozyten zu modellieren: die Überbrückung von Zellen Theorie aufgrund der Quervernetzung der Makromoleküle 2 und dem Kraft attraktion Theorie durch Verarmung der Moleküle aufgrund der osmotischen Gradienten 3 verursacht. Typischerweise ist für menschliches Blut, Aggregate bilden bei sehr niedrigen Scherraten 4 im Bereich von 1 bis 10 s -1 aufweist. Oberhalb dieses Bereichs neigen Erythrozyten zu zerlegen und separat zu fließen innerhalb des Gefäßes. Das Verständnis der Bedingungen der Aggregate Bildung eines großen Wert auf die Hämorheologie Bereich in Bezug auf die Definition rheologische Verhalten Blut. Diese Aggregate werden oft an der Makrozirkulation Niveau (&gt; 300 &amp; mgr; m Durchmesser) 5 zu sehen. An diesem Maßstab wird Blut als Newtonsche Flüssigkeit und einer homogenen Mischung berücksichtigt. Jedoch werden diese Aggregate seltener im Kapillarebene (4-10 &amp; mgr; m im Durchmesser) zu sehen sind und in der Regel ein Hinweis auf pathologische Zustände wie Diabetes 6 und Fettleibigkeit. Andere pathologische Zustände, die verändern könnten RBC Aggregation gehören entzündlich oder infektiös Bedingungenkardiovaskuläre Erkrankungen wie Bluthochdruck oder Arteriosklerose, genetischen Erkrankungen und chronische Erkrankungen 7. Daher steht die RBC Aggregationsmechanismus und Analysieren dieser Entitäten (durch Definition einer Beziehung zwischen der Größe dieser Aggregate und der Strömungsverhältnisse) könnte zum Verständnis der microrheological Verhalten von Blut führen und somit in Beziehung zu klinischen Anwendungen. RBC Aggregate kann durch verschiedene Faktoren wie der Hämatokrit (Volumen von RBCs in Blut), der Scherrate, des Gefäßdurchmessers, der RBC-Membransteifigkeit und dem Suspendiermedium Zusammensetzung 8-10 verändert werden. Daher werden kontrollierten Bedingungen, um die RBC-Aggregate effektiv zu analysieren erforderlich. Mehrere Verfahren sind in der Lage, die Aggregatbildung durch statische Messungen Aggregation (Aggregationsindex) zu analysieren, die relevanten Informationen über Blut Verhalten bietet. Diese Verfahren umfassen unter anderem die BlutsenkungsgeschwindigkeitVerfahren 11, die Lichtübertragungsverfahren 12, die Lichtreflexionsverfahren 13 und die niedrige Scherviskosität Verfahren 14. Einige Studien haben versucht, RBC Aggregation untersuchen und bestimmen den Grad der Aggregation in kontrollierten Strömungsverhältnissen 15-17. Allerdings sind diese Studien indirekt untersuchen RBC Aggregatgrößen durch Bestimmen des Verhältnisses der belegten Raum in einem Schersystem gemessen basierend auf mikroskopische Blutbilder die Informationen über den Grad der Aggregation als auch der lokalen Viskosität. Wir stellen daher ein neues Verfahren, um direkt zu quantifizieren RBC-Aggregate in der Mikrozirkulation, dynamisch, unter kontrollierten und konstanten Scherraten. RBC-Suspensionen werden mitgerissen, in einem doppelten Y-Mikrokanal (wie in Figur 1 dargestellt), mit einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS) somit die Schaffung einer Scherströmung in der Blutschicht. Innerhalb dieser Blutschicht eine konstante Shear Rate erhalten werden kann. Die RBC-Suspensionen bei verschiedenen Hämatokrit (H) Ebenen (5%, 10% und 15%) und unter verschiedenen Scherraten (2-11 sec -1) getestet. Die Blutgeschwindigkeit und Schergeschwindigkeit werden mit einem Mikro Particle Image Velocimetry (μPIV) System, während die Strömung visualisiert mit einer Hochgeschwindigkeitskamera bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse werden dann mit einem MATLAB-Code basierend auf den Bildintensitäten, um die RBCs erfassen und Aggregatgrößen verarbeitet.

<table><tbody><tr><td>SU8-50 epoxy based negative Photo-resist</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU8-50 developer</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Sylgard-184</td><td>Dow-Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>PE-50 series Plasma system&amp;nbsp;</td><td>Plasma Etch</td><td>PE-50 series</td><td></td></tr><tr><td>Blood collection tubes with K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)</td><td>FisherSci</td><td>B367861</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge, &lt;em&gt;i.e.&lt;/em&gt; Thermo Scientific CL2</td><td>Thermo Scientific</td><td>004260F</td><td></td></tr><tr><td>Poshpate buffered saline (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Tracer fluorescent particles solution (15 ml)</td><td>FisherSci</td><td>R800</td><td></td></tr><tr><td>Aggregometer</td><td>RheoMeditech</td><td>Rheo Scan AnD300</td><td></td></tr><tr><td>Glass syringes (50 &amp;micro;l)</td><td>Hamilton</td><td>80965</td><td></td></tr><tr><td>Tubing (Tygon)</td><td>FisherSci</td><td>AAA00001</td><td></td></tr><tr><td>High speed camera (Basler)</td><td>Graftek Imaging Inc.</td><td>basler acA2000-340km</td><td>A camera capable of recording 18 frames per second could be used.</td></tr><tr><td>Double pulsed camera&amp;nbsp;</td><td>LaVision</td><td>Imager Intense</td><td></td></tr><tr><td>Microscope MITAS</td><td>LaVision</td><td>MITAS</td><td></td></tr><tr><td>Nd:YAG laser</td><td>New Wave Research</td><td>Solo-II</td><td></td></tr><tr><td>Syringe pump (Nexus3000 and PicoPlus)</td><td>Chemyx Inc. and Harvard Apparatus</td><td>Nexus3000 and PicoPlus</td><td></td></tr><tr><td>DaVis software</td><td>LaVision</td><td>Davis</td><td></td></tr></tbody></table>

controlled microfluidic environment for dynamic investigation of red blood cell aggregation

Blut als nicht-Newtonsche Biofluid, stellt die Gegenstand zahlreicher Studien im Hämorheologie Feldes. Blutbestandteile sind rote Blutkörperchen, weiße Blutkörperchen und Blutplättchen, die im Blutplasma suspendiert sind. Aufgrund der Fülle der RBCs (40% bis 45% des Blutvolumens) diktiert ihr Verhalten, das rheologische Verhalten von Blut besonders in der Mikrozirkulation. Bei sehr niedrigen Scherraten werden RBCs gesehen zu montieren und Form Entitäten, die als Aggregate, die das nicht-Newtonsche Verhalten von Blut bewirkt. Es ist wichtig, die Bedingungen der Granulatbildung zu verstehen, um die Rheologie des Blutes in die Mikrozirkulation zu verstehen. Das hier beschriebene Protokoll beschreibt die experimentelle Vorgehensweise, um die RBC-Aggregate in der Mikrozirkulation unter konstanten Scherrate quantitativ zu bestimmen, basierend auf Bildverarbeitung. Zu diesem Zweck werden RBC-Suspensionen geprüft und 120 x 60 &amp; mgr; m Poly-Dimethyl-Siloxan (PDMS) Mikrokanäle analysiert. Die RBC-Suspensionen sind entregnete es mit einem zweiten Fluid, um eine lineare Geschwindigkeitsprofil innerhalb des Blutschicht zu erhalten und somit eine Vielzahl von konstanten Scherraten. Die Schergeschwindigkeit ist mit einem Mikro Particle Image Velocimetry (μPIV) Systems bestimmt, während RBC Aggregate werden mit einer Hochgeschwindigkeitskamera sichtbar gemacht. Die der RBC Aggregate aufgenommenen Videos unter Verwendung von Bildverarbeitungstechniken, um die Aggregatgrößen basierend auf den Bildern Intensitäten zu bestimmen.

Ein Beispiel der Zwei-Fluid-Strömung in der doppelten Y-Mikrokanal ist in Abbildung 2 für die menschliche RBCs bei 5%, 10% und 15% Hämatokrit suspendiert und bei 10 &amp; mgr; l / h fließt gezeigt ist. Figur 3 zeigt den Unterschied in der Aggregatgrößen, wenn die Strömung in dem Kanal wird aus 10 &amp; mgr; l / h bis 5 &amp; mgr; l / h für einen Hämatokrit von 10% reduziert. Dies ergibt eine qualitative Vorstellung von der Grße der Aggregate beim Variieren der Hämatokrit und ...

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Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Das Protokoll beschriebenen Einzelheiten ein experimentelles Verfahren, um rote Blutzellen (RBC) Aggregate unter einer kontrollierten und konstanten Scherrate zu quantifizieren, auf Basis von Bildverarbeitungstechniken. Das Ziel des Protokolls ist es, RBC Aggregatgrößen an den entsprechenden Schergeschwindigkeit kontrolliert mikrofluidischen Umwelt beziehen.

Controlled Environment Mikrofluidik für dynamische Untersuchung der Aggregation roter Blutzellen

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white ...

controlled-microfluidic-environment-for-dynamic-investigation-red

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.7K Aufrufe.  University of Ottawa.  Das Protokoll beschriebenen Einzelheiten ein experimentelles Verfahren, um rote Blutzellen (RBC) Aggregate unter einer kontrollierten und konstanten Scherrate zu quantifizieren, auf Basis von Bildverarbeitungstechniken. Das Ziel des Protokolls ist es, RBC Aggregatgrößen an den entsprechenden Schergeschwindigkeit kontrolliert mikrofluidischen Umwelt beziehen. 

Serie: Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Advances in microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and reproducible microfluidic systems for conducting biological and biochemical experiments at the micro- and nanoscales 1,2. In addition, microfluidics have also been specifically used to quantitatively analyze hematologic and microvascular processes, because of their ability to easily control the dynamic fluidic environment and biological conditions3-6. As such, researchers have more recently used microfluidic systems to study blood cell deformability, blood cell aggregation, microvascular blood flow, and blood cell-endothelial cell interactions6-13.However, these microfluidic systems either did not include cultured endothelial cells or were larger than the sizescale relevant to microvascular pathologic processes. A microfluidic platform with cultured endothelial cells that accurately recapitulates the cellular, physical, and hemodynamic environment of the microcirculation is needed to further our understanding of the underlying biophysical pathophysiology of hematologic diseases that involve the microvasculature.
Here, we report a method to create an "endothelialized" in vitro model of the microvasculature, using a simple, single mask microfabrication process in conjunction with standard endothelial cell culture techniques, to study pathologic biophysical microvascular interactions that occur in hematologic disease. This "microvasculature-on-a-chip" provides the researcher with a robust assay that tightly controls biological as well as biophysical conditions and is operated using a standard syringe pump and brightfield/fluorescence microscopy. Parameters such as microcirculatory hemodynamic conditions, endothelial cell type, blood cell type(s) and concentration(s), drug/inhibitory concentration etc., can all be easily controlled. As such, our microsystem provides a method to quantitatively investigate disease processes in which microvascular flow is impaired due to alterations in cell adhesion, aggregation, and deformability, a capability unavailable with existing assays.

A method to culture an endothelial cell monolayer throughout the entire inner 3D surface of a microfluidic device with microvascular-sized channels (&lt;30 &mu;m) is described. This in vitro microvasculature model enables the study of biophysical interactions between blood cells, endothelial cells, and soluble factors in hematologic diseases.

Endothelialisierten Mikrofluidik für ein Studium Mikrovaskuläre Wechselwirkungen in Hämatologische Krankheiten

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Forschung

Biotechnik

Micro-particle Image Velocimetry for Velocity Profile Measurements of Micro Blood Flows

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to give an accurate velocity profile. A protocol is presented for &mu;PIV measurements of blood flows in microchannels. At the scale of the microcirculation, blood cannot be considered a homogeneous fluid, as it is a suspension of flexible particles suspended in plasma, a Newtonian fluid. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate can be derived from these measurements. Several key parameters such as focal depth, particle concentration, and system compliance, are presented in order to ensure accurate, useful data along with examples and representative results for various hematocrits and flow conditions.

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows which are cross-correlated to give an accurate velocity profile. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate, each of which has clinical applications, can be derived from these measurements.

Micro-Particle Image Velocimetry für Velocity Micro Profil Messungen der Blut fließt

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher neutrophil counts in the blood are usually an indicator of ongoing infections, while low neutrophil counts are a warning sign for higher risks for infections. To accomplish their functions, neutrophils also have to be able to move effectively from the blood where they spend most of their life, into tissues, where infections occur. Consequently, any defects in the ability of neutrophils to migrate can increase the risks for infections, even when neutrophils are present in appropriate numbers in the blood. However, measuring neutrophil migration ability in the clinic is a challenging task, which is time consuming, requires large volume of blood, and expert knowledge. To address these limitations, we designed a robust microfluidic assays for neutrophil migration, which requires a single droplet of unprocessed blood, circumvents the need for neutrophil separation, and is easy to quantify on a simple microscope. In this assay, neutrophils migrate directly from the blood droplet, through small channels, towards the source of chemoattractant. To prevent the granular flow of red blood cells through the same channels, we implemented mechanical filters with right angle turns that selectively block the advance of red blood cells. We validated the assay by comparing neutrophil migration from blood droplets collected from finger prick and venous blood. We also compared these whole blood (WB) sources with neutrophil migration from samples of purified neutrophils and found consistent speed and directionality between the three sources. This microfluidic platform will enable the study of human neutrophil migration in the clinic and the research setting to help advance our understanding of neutrophil functions in health and disease.

This protocol details an assay designed to measure human neutrophil chemotaxis from one droplet of whole blood with robust reproducibility. This approach circumvents the need for neutrophil separation and requires only a few minutes of assay preparation time. The microfluidic chip enables the repeated measure of neutrophil chemotaxis over time in infants or small mammals, where sample volume is limited.

Mikrofluidik-Plattform zur Messung der Neutrophilen-Chemotaxis von Rohboden Vollblut

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an efficient manner. Typically, data for ~102 cells can be acquired within a 1 hr experiment. An automated image analysis program enables efficient post-experiment analysis of image data, enabling processing to be complete within a few hours. Our device geometry is unique in that cells must deform through a series of micron-scale constrictions, thereby enabling the initial deformation and time-dependent relaxation of individual cells to be assayed. The applicability of this method to human promyelocytic leukemia (HL-60) cells is demonstrated. Driving cells to deform through micron-scale constrictions using pressure-driven flow, we observe that human promyelocytic (HL-60) cells momentarily occlude the first constriction for a median time of 9.3 msec before passaging more quickly through the subsequent constrictions with a median transit time of 4.0 msec per constriction. By contrast, all-trans retinoic acid-treated (neutrophil-type) HL-60 cells occlude the first constriction for only 4.3 msec before passaging through the subsequent constrictions with a median transit time of 3.3 msec. This method can provide insight into the viscoelastic nature of cells, and ultimately reveal the molecular origins of this behavior.

We demonstrate a microfluidics-based assay to measure the timescale for cells to transit through a sequence of micron-scale constrictions.

Ein Mikrofluidiktechnik to Cell Verformbarkeit Sonde

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions. Extracellular proteins, collagen I or von Willebrand factor are deposited within the microfluidic channel using active perfusion with a pneumatic pump. The matrix proteins are then washed with buffer and blocked to prepare the microfluidic channel for platelet interactions. Whole blood labeled with fluorescent dye is perfused through the channel at various flow rates in order to achieve platelet activation and aggregation. Inhibitors of platelet aggregation can be added prior to the flow cell experiment to generate IC50 dose response data.

The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions.

Adhäsion und Aggregation unter Fluss mit Mikrofluidik-Flow-Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Biologie

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

Mikrofluidik-Strömungskammern Mit Rekonstituierte Blut Hämostaseologie und Transfusions Platelet zu Modell<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is restricted to platelet deposition only. The intricate relationship between Ca2+-dependent coagulation and platelet function requires careful and controlled recalcification of blood prior to analysis. Our setup uses a Y-shaped mixing channel, which supplies concentrated Ca2+/Mg2+ buffer to flowing blood just prior to perfusion, enabling rapid recalcification without sample stasis. A ten-fold difference in flow velocity between both reservoirs minimizes dilution. The recalcified blood is then perfused in a collagen-coated analysis chamber, and differential labeling permits real-time imaging of both platelet and fibrin deposition using fluorescence video microscopy. The system uses only commercially available tools, increasing the chances of standardization. Reconstitution of thrombocytopenic blood with platelets from banked concentrates furthermore models platelet transfusion, proving its use in this research domain. Exemplary data demonstrated that coagulation onset and fibrin deposition were linearly dependent on the platelet concentration, confirming the relationship between primary and secondary hemostasis in our model. In a timeframe of 16 perfusion min, contact activation did not take place, despite recalcification to normal Ca2+ and Mg2+ levels. When coagulation factor XIIa was inhibited by corn trypsin inhibitor, this time frame was even longer, indicating a considerable dynamic range in which the changes in the procoagulant nature of the platelets can be assessed. Co-immobilization of tissue factor with collagen significantly reduced the time to onset of coagulation, but not its rate. The option to study the tissue factor and/or the contact pathway increases the versatility and utility of the assay.

This paper describes an experimental model of hemostasis that simultaneously measures platelet function and coagulation. Platelet and fibrin fluorescence is measured in real-time, and platelet adhesion rate, coagulation rate, and onset of coagulation are determined. The model is used to determine platelet procoagulant properties under flow in concentrates for transfusion.

Ein Mikrofluidik-Flow-Kammer-Modell für Platelet Transfusions und Hämostase Maßnahmen Platelet Deposition und Fibrinbildung in Echtzeit

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical gradient, known as chemotaxis, plays an important role in development, the immune response, wound healing, and cancer metastasis. While chemotaxis modulates the migration of single cells as well as collections of cells in vivo, in vitro research focuses on single-cell chemotaxis, partly due to the lack of the proper experimental tools. To fill that gap, described here is a unique experimental system that combines microfluidics and micropatterning to demonstrate the effects of chemical gradients on collective cell migration. Furthermore, traction microscopy and monolayer stress microscopy are incorporated into the system to characterize changes in cellular force on the substrate as well as between neighboring cells. As proof-of-concept, the migration of micropatterned circular islands of Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells is tested under a gradient of hepatocyte growth factor (HGF), a known scattering factor. It is found that cells located near the higher concentration of HGF migrate faster than those on the opposite side within a cell island. Within the same island, cellular traction is similar on both sides, but intercellular stress is much lower on the side of higher HGF concentration. This novel experimental system can provide new opportunities to studying the mechanics of chemotactic migration by cellular collectives.

Collective cell migration in development, wound healing, and cancer metastasis is often guided by the gradients of growth factors or signaling molecules. Described here is an experimental system combining traction microscopy with a microfluidic system and a demonstration of how to quantify the mechanics of collective migration under biochemical gradient.

Traktionsmikroskopie integriert mit Mikrofluidik für chemotaktische kollektive Migration

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

Quantitative Analyse der mikrobiellen Autoaggregation mittels bildgebender Durchflusszytometrie

Imaging Flow Cytometry to Study Microbial Autoaggregation

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The Lactobacillaceae family consists of Gram-positive bacteria with confirmed probiotic properties. This study utilizes Lactobacillaceae species as a model to demonstrate the effectiveness of single-cell high throughput analysis in studying cellular aggregation. The focus is on analyzing the response of these beneficial species to simple carbohydrates from the diet.
The study showcases how Imaging Flow Cytometry (IFC) can overcome the fundamental differences in the assembly of probiotic bacteria in the presence and absence of carbohydrates. IFC combines the power and speed of conventional flow cytometry with the spatial resolution of microscopy, enabling high-rate complex morphometric measurements in a phenotypically defined manner across a library of beneficial bacterial strains and conditions. This protocol provides insights into the autoaggregation of Lactobacillaceae species and sheds light on their response to dietary carbohydrates, contributing to understanding the mechanisms behind the beneficial effects of these probiotic bacteria.

Autor im Rampenlicht: Förderung der Forschung in der mikrobiellen Autoaggregation mit bildgebender Durchflusszytometrie

This protocol describes a quantitative approach to measure microbial autoaggregation using imaging flow cytometry.

Bildgebende Durchflusszytometrie zur Untersuchung der mikrobiellen Autoaggregation

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The ...

Controlled Environment Mikrofluidik für dynamische Untersuchung der Aggregation roter Blutzellen

Zusammenfassung

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Endothelialisierten Mikrofluidik für ein Studium Mikrovaskuläre Wechselwirkungen in Hämatologische Krankheiten

Micro-Particle Image Velocimetry für Velocity Micro Profil Messungen der Blut fließt

Mikrofluidik-Plattform zur Messung der Neutrophilen-Chemotaxis von Rohboden Vollblut

Ein Mikrofluidiktechnik to Cell Verformbarkeit Sonde

Adhäsion und Aggregation unter Fluss mit Mikrofluidik-Flow-Cells

Mikrofluidik-Strömungskammern Mit Rekonstituierte Blut Hämostaseologie und Transfusions Platelet zu Modell

Ein Mikrofluidik-Flow-Kammer-Modell für Platelet Transfusions und Hämostase Maßnahmen Platelet Deposition und Fibrinbildung in Echtzeit

Traktionsmikroskopie integriert mit Mikrofluidik für chemotaktische kollektive Migration

Bildgebende Durchflusszytometrie zur Untersuchung der mikrobiellen Autoaggregation

Bildgebende Durchflusszytometrie zur Untersuchung der mikrobiellen Autoaggregation