Wir wollen ein Schlaganfallmodell erstellen, das ein Blutgerinnsel erzeugt, das Patientenproben ähnelt und auf die klinisch relevante thrombolytische Therapie anspricht. Daher modifizieren wir das klassische photothrombotische Schlaganfallmodell und mischen Thrombin und den photodynamischen Farbstoff Rose Bengal vor der Photoaktivierung. Wir freuen uns, dass dieses Verfahren tatsächlich Blutgerinnsel erzeugt, die sehr empfindlich auf die tPA-vermittelte Thrombolyse reagieren.
Dieses modifizierte photothrombotische Schlaganfallmodell verwendet sehr einfache chirurgische Eingriffe mit einer niedrigen Mortalitätsrate und führt zu einer sehr konsistenten Infarktgröße und -lokalisation. Sie produzieren auch ein gemischtes Blutgerinnsel aus Fibrin und Blutplättchen, das denen des akuten Schlaganfallpatienten ähnelt. Daher halten wir es für die präklinische Schlaganfallforschung für sinnvoll, effektivere thrombolytische Therapien zu entwickeln.
Wir hoffen, dass mehr Menschen unser Modell nutzen. Das Verfahren wird von Dr. Yu-Yo Sun, unserem wissenschaftlichen Assistenzprofessor in unserer Gruppe, demonstriert. Bereiten Sie die Maus 30 Minuten vor der Operation vor, indem Sie ein Analgetikum injizieren.
Nachdem Sie die Maus betäubt haben, kneifen Sie die Zehen zusammen, um sicherzustellen, dass sie vollständig betäubt ist. Anschließend die Haare am linken Hals und Kopf mit Haarentfernungscreme entfernen. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf den Kleintieradapter und sterilisieren Sie den chirurgischen Hautbereich, indem Sie ihn mit drei abwechselnden Streichen von Povidon-Jod und 70%igem Ethanol abwischen.
Machen Sie unter einem Präpariermikroskop einen 0,5 Zentimeter langen linken Halsschnitt mit einer Mikroschere und einer geraden Pinzette etwa 0,2 Zentimeter seitlich der Mittellinie. Ziehen Sie dann mit einer feinen gezackten Pinzette das Weichgewebe und die Faszie auseinander, um die LCCA freizulegen. Trennen Sie dann mit einer feinen, glatten Pinzette vorsichtig den LCCA vom Vagusnerv.
Legen Sie eine permanente Doppelknotennaht mit einer 5-0-Seidennaht um die LCCA. Drehen Sie die Maus in eine Bauchlage und drehen Sie die Nasenklammerrolle um 15 Grad. Sterilisieren Sie dann den Operationsbereich, indem Sie die Haut mit drei abwechselnden Streichen von Betadin und 70%igem Ethanol abwischen.
Machen Sie einen 0,8 Zentimeter langen Schnitt in die Kopfhaut mit einer Mikroschere und einer geraden Pinzette entlang des linken Auges und Ohrs, um den Schläfenmuskel freizulegen. Als nächstes machen Sie einen 0,5 Zentimeter langen Schnitt entlang der Kante des Schläfenmuskels am linken Scheitelknochen. Machen Sie dann einen zweiten 0,3 Zentimeter langen vertikalen Schnitt am Schläfenmuskel und ziehen Sie den Muskel zurück, um den Rand des Scheitelknochens und des Plattenepithelknochens freizulegen.
Stellen Sie sicher, dass Sie die Landmarke der koronalen Naht zwischen Frontal- und Scheitelknochen visualisieren. Als nächstes befeuchten Sie den Schädel, indem Sie sterile Kochsalzlösung auftragen, um das linke MCA freizulegen, und markieren Sie den proximalen MCA-Ast auf dem Plattenepithelknochen mit einem Marker. Zeichnen Sie vorsichtig mit einem pneumatischen Zahnbohrer einen Kreis mit einem Durchmesser von einem Millimeter, der diesen markierten Bereich umgibt.
Dann dünnen Sie den Schädel etwa 0,2 Millimeter tief aus, ohne die darunter liegende Dura zu berühren. Stoppen Sie das Bohren, wenn eine sehr dünne Knochenschicht übrig bleibt. Als nächstes mischen Sie die Thrombin- und Rosenbengalenlösung basierend auf dem Körpergewicht der Maus und injizieren die Mischung langsam mit einer 31-Gauge-Nadel in den retroorbitalen Sinus.
Tragen Sie Augensalbe auf beide Augen auf, um Trockenheit zu vermeiden. Tragen Sie den Strahler mit einem 532-Nanometer-Laserlicht 20 Minuten lang in einem Abstand von zwei Zoll auf die gebohrte Stelle auf. Visualisieren Sie die Beleuchtung am proximalen Ast des MCA durch eine Laserprojektionsbrille.
Stoppen Sie nach 20 Minuten die Laserbeleuchtung. Machen Sie ein Schädelfenster von drei Millimetern Durchmesser auf das Scheitelbein des Schädels und setzen Sie ein Deckglas darauf. Platzieren Sie dann das distale MCA unter einer 20-fachen Wasserimmersionsobjektivlinse.
Markierung des zirkulierenden Blutplättchens durch Injektion des Schwanzvenen-Antikörpers DyLight 488 gegen GP1b-beta fünf Minuten vor der Bildgebung. Injizieren Sie dann retroorbital die Mischung aus Thrombin und Rosenbengalenlösung. Photoaktivieren Sie den MCA mit einem 532-Nanometer-Lasersystem mit einem Laserstrahl von 10 Mikrometern Durchmesser und zeichnen Sie das Bild bis zur Thrombusbildung auf.
Für die tPA-Verabreichung wird das betäubte Tier auf eine 37 Grad Celsius warme Unterlage gelegt. Wickeln Sie seinen Schwanz mit einer 45 Grad Celsius warmen, nassen Gaze für eine Minute zum ausgewählten Zeitpunkt nach der Photoaktivierung um. Als nächstes injizieren Sie das rekombinante humane tPA durch die Schwanzvene.
Injizieren Sie 50 % als Bolus und lassen Sie die restlichen 50 % über 30 Minuten mit einer Infusionspumpe infundieren. Um den zerebralen Blutfluss zu überwachen, machen Sie einen Mittellinienschnitt auf der Kopfhaut, wobei der Schädel freiliegt. Befeuchten Sie den Schädel mit steriler Kochsalzlösung und tragen Sie das Ultraschallgel sanft darauf auf, wobei Sie darauf achten sollten, Haare oder Luftblasen im Gel zu vermeiden.
Überwachen Sie den zerebralen Blutfluss in beiden Gehirnhälften unter dem Laser-Speckle-Kontrast-Imager für 10 Minuten. Die Immunfluoreszenzmarkierung zeigt, dass bei der Photothrombose auf Basis des Rosen-Bengalenfarbstoffs der MCA-Zweig dicht mit CD41-positiven Thrombozyten und wenig Fibrin gefüllt war. Im Gegensatz dazu war der MCA-Zweig bei der Thrombin plus Rosenbengalen-Photothrombose durch zufällig gemischte Thrombozyten- und Fibringerinnsel verschlossen.
Die Immunoblotting-Analyse zeigte eine mehr als doppelt so hohe Fibrinablagerung in der ipsilateralen Hemisphäre bei der Photothrombin plus Rosenbengalen im Vergleich zur Rosenbengalen-Photombose allein. Die konfokalmikroskopische intravitale Bildgebung zeigte, dass eine intravenöse Thrombininjektion auch unter Laserbeleuchtung keine Thrombozytenaggregate induzierte. Die Thrombozyten bildeten homogene Gerinnsel im Rose-Bengal-Photothrombose-Modell, aber ungleichmäßige Aggregate mit mehreren schwachen Regionen im Thrombin-plus-Rose-Bengal-Modell.
Der CBF derselben Maus vor und 24 Stunden nach der tPA-Behandlung im Vergleich zur Vehikelbehandlung wurde mittels Laser-Speckle-Kontrast-Bildgebung gemessen und auf die kontralaterale Hemisphäre normalisiert. Bei der Rosenbengalen-Photothrombose führte die tPA-Behandlung zu einem Trend der CBF-Erholung, insbesondere im ischämischen Grenzbereich im Vergleich zu den mit Vehikeln behandelten Mäusen. Bei der Thrombin-plus-Rosenbengal-Photothrombose war die Erholung von CBF bei tPA-behandelten Mäusen ausgeprägter, und die proximalen MCA-Äste wurden oft nach 24 Stunden sichtbar.
Bei der Rosenbengalen-Photothrombose wurde eine ähnliche Infarktgröße bei Vehikel-behandelten und tPA-behandelten Mäusen festgestellt. Im Gegensatz dazu reduzierte die lytische tPA-Behandlung bei Thrombin plus Rosenbengal-Photothrombose den Infarkt signifikant nach 0,5, einer oder zwei Stunden, aber nicht sechs Stunden nach der Photoaktivierung im Vergleich zu vehikelbehandelten Mäusen. Diese Methode kann zur Untersuchung der Gerinnselzusammensetzung und zur weiteren Untersuchung thrombolytischer Behandlungen verwendet werden.
Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden der Thrombolysetherapie angewendet und die spätere Wirksamkeit bestimmt werden. Die Zugabe von Thrombin ermöglicht es, die Gerinnselzusammensetzung von fibrinarm auf fibrinreich einzustellen, so dass Forscher klinisch relevante therapeutische Strategien entwickeln können.
