Dieses Protokoll ermöglicht es dem Prüfer, die Entwicklung des Gallengangs in Mausmodellen von Lebererkrankungen zu quantifizieren. Es ermöglicht auch die Bewertung der Auswirkungen von genetischen Modifikatoren auf die Gallengangentwicklung. Der Vorteil dieser Technik ist, dass es sich um eine einfache, empfindliche und quantitative Methode zur direkten Bewertung der Gallengangsentwicklung handelt.
Zunächst, mit der Haut durch Zangen straff gehalten, verwenden Sie kleine Schere, um einen Querschnitt etwa einen Zoll unter dem Rippenkäfig einer eingeschläferten Maus zu machen. Setzen Sie die gesamte ventrale Oberfläche der Leber aus. Verwenden Sie eine kleine Schere, um die Bänder, die die Leber mit den anderen Organen im Bauch verbinden, sorgfältig zu durchschneiden.
Dann durchschneiden Sie den gemeinsamen Gallengang, um die Leber vom Darm zu lösen. Halten Sie an der Gallenblase fest und entfernen Sie vorsichtig die Leber. Sofort in ein 50-Milliliter-Rohr geben, das drei Viertel mit 4% Paraformaldehyd gefüllt ist.
Um das Lebergewebe zu fixieren, inkubieren Sie es in 4%PFA bei vier Grad Celsius für 48 Stunden. Nach einer Reihe von Ethanolwäschen die Leber dreimal für jeweils 30 Minuten bei Raumtemperatur mit Räummittel waschen. Um mit dem Einbetten zu beginnen, waschen Sie eine Gewebekassette dreimal in einer Gewebeform für 30 Minuten in Paraffinwachs, das auf 60 Grad Celsius vorgewärmt wird.
Dann füllen Sie die Gewebeform mit Paraffinwachs auf drei Viertel Höhe und halten Sie es auf einem Heizblock bei 60 Grad Celsius. Legen Sie die Leber in die Form mit der ventralen Seite nach oben. Nachdem Sie die Form sorgfältig aus dem Heizblock entfernt haben, legen Sie die Oberseite der Kassette auf die Form.
Mit heißem Flüssigparaffin abkühlen lassen und es über Nacht auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Nachdem Sie den Leberblock aus der Form entfernt haben, verwenden Sie ein Mikrotome, um durch die oberflächliche Rückenseite der Leber zu sektionieren und fünf Mikrometerabschnitte zu machen. Überprüfen Sie die oberflächlichen Abschnitte unter einem Seziermikroskop, um sicherzustellen, dass die Abschnitte nicht geschoren oder gefaltet sind.
Um Dias für die Immunhistochemie zu verarbeiten, wählen Sie einen Dia pro zu analysierendem Genotyp aus und waschen Sie ihn 15 Minuten lang in Xylol, 100 %Ethanol, 95 % Ethanol und schließlich 70 %Ethanol. Nachdem Sie die Rutsche in das ionisierte Wasser gewaschen haben, tauchen Sie sie in tris-basierte High pH-Antigen-Retrieval-Lösung ein. Dann erhitzen Sie es unter Druck in einem Schnellkochtopf für drei Minuten bei 10 Pfund pro Quadratzoll.
Nachdem Sie die Folie auf Raumtemperatur abkühlen lassen, verwenden Sie einen PAP-Stift, um die Abschnitte auf der Folie zu skizzieren. Nach dem Waschen mit PBS Tween, blockieren Sie die Gewebeabschnitte durch Zugabe von 100 Mikroliter Blockierlösung pro Abschnitt und inkubieren bedeckt bei vier Grad Celsius für eine Stunde. 100 Mikroliter der verdünnten Antikörperlösung, die alle drei primären Antikörper enthält, auf jeden Abschnitt auftragen und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren.
Nach dem Waschen der Dias 100 Mikroliter der sekundären Antikörperlösung hinzufügen, die sowohl sekundäre Antikörper enthält, als auch eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Schließlich montieren Medium und einen Deckelschlupf auf die Dias auftragen. Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop, um 20x Bilder mit 1x Zoom pro Abschnitt aufzunehmen.
Stellen Sie sicher, dass jede Portalvene in der Leber abgebildet ist. Erstellen Sie eine Kalkulationstabelle mit den folgenden Spalten:Tier-/Beispielnummer, Bildnummer, Anzahl der Portalvenen und Anzahl der Gallengänge. Identifizieren und zeichnen Sie die Anzahl der Portalvenen pro Bild für jedes Bild auf.
Identifizieren Sie dann die augguktionskanäle in jedem Bild durch das Vorhandensein von Cholangiozyten, die ein definierbares Lumen umgeben. Diese Strukturen sollten durch Mesenchym von anderen Breitband-Cytokeratin-positiven Zellen getrennt und getrennt sein. Eine der größten Herausforderungen dieser Technik besteht darin, patente Gallengänge zu identifizieren.
Um zu bestimmen, was ein Patentkanal ist, muss die Form des Kanals und die Zellen, die das Lumen umgeben, analysiert werden. Zählen Sie jeden Augenkanal des Patents und platzieren Sie ihn in derselben Spalte wie die Bildnummer, und wiederholen Sie ihn für jedes Portalvenenbild. Schließlich berechnen Sie die Summe aller Portalvenen und aller Gallengänge in der Leberprobe und berechnen Sie das Gallenkanal-Zuglas-Portal-Venenverhältnis für die Leberprobe.
P30-Mausleber wurden für CK8 und CK19 zusammen mit dem Gefäßmarker alpha-SMA geschnitten und mitgefärbt, um das BD-PV-Verhältnis zu bestimmen. Wenn alle Portalvenen in jedem Leberlappen abgebildet sind, wurden Portalvenen als alpha-SMA-gefärbte Gefäße definiert, die benachbarte Breitspektrum-Cytokeratin-Färbunghaben haben. Die Alpha-SMA-Fleckenstrukturen ohne Breitspektrum-Cytokeratin waren zentrale Venen, die von der Analyse ausgeschlossen wurden.
Patentkanäle haben ein deutlich definierbares Lumen, das von Breitspektrum-Cytokeratin-positiven Cholangioktyes umgeben ist und in der Regel durch Mesenchym von nahegelegenen Kanälen oder Cholangiozyten getrennt ist. Breitspektrum-Zytokeratin-positive Zellen, die kein definierbares Lumen haben, werden nicht auf die Gesamtzahl der Gallengänge angerechnet. Leberabschnitt von einem Wildtier zeigt eine Portalvene, die mit einem vollständig patentierten Kanal zusammen mit mehreren nicht inkorporierten Zellen verbunden ist.
Repräsentative Lebersektion eines JAG1 heterozygoten Tieres zeigt, dass keine patenten Gallengänge um die drei Portalvenen vorhanden sind. Alle Breitspektrum-Zytokeratin-positiven Zellen sind hier nicht inkorporiert und sollten daher nicht gezählt werden. Die Analyse des BD-PV-Verhältnisses für drei Wildtyp- und drei JAG1-Heterozygot-Tiere zeigt, wie die beiden Genotypen anhand der Gallengangszahl leicht unterschieden werden können.
Es ist wichtig, alle Portalgefäße auf Gallenwege zu prüfen. Es ist besonders wichtig für die Bestimmung der Gallengangsdichte, wenn es phänotypische Variabilität in der Leber gibt. Diese Technik wurde verwendet, um einen genetischen Unterdrücker des gallenhaften Phänotyps in einem Mausmodell von Helgason zu identifizieren.
Daher kann es bei der Bewertung der Behandlungsmodalitäten von Tiermodellen von Gallenkrankheit nützlich sein.
