Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von CIHR (MOP394808) und Canada Research Chair zu CMCEWO getragen war der Empfänger eines Post-Graduate Scholarship von NSERC.

Hinweis: Dieses Protokoll ist weitgehend mit verschiedenen Monoschicht überzogenen Zelle / Zellkulturmodelle, Drogenbehandlungsschemata, und Kennzeichnungs Ziele. Somit im tatsächlichen Gebrauch werden viele spezifische Parameter auf experimentelle Design variieren. Hier sind Verweise auf diese benutzerdefinierten Parametern Generika. Beispiel Bedingungen, wie verwendet, um die repräsentative Ergebnisse zu erhalten, werden in Kursivschrift enthalten. 1. Lösungen <ol><li> Vorbereitung Waschpuffer durch Mischen 0,1 M Tris-gepufferter Hypertone (300 mM) Kochsalzlösung und 0,05% Polysorbat 20; pH 7,4 bei RT. </li><li> Bereiten Blockierungspuffer. Auf 0,05 M Tris-gepufferter Hypertone (300 mM) Saline hinzuzufügen 0,05% Polysorbat 20, 3% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1% Kaltfischhautgelatine und den pH auf 7,4 bei RT. </li><li> Vorbereitung Antikörperverdünnung durch Zugabe von 0,05% Polysorbat 20, 1% BSA, 0,1% kaltFischHautGelatine und 0,05 M Tris-gepufferter Hypertone (300 mM) Saline und den pH auf 7,4 einzustellen bei 4ºC Anmerkung: Der pH-Wert der Puffer Tris ist temperaturabhängig. Das heißt, eine Änderung in der Temperatur den pH-Wert der Lösung zu ändern. Aus Gründen der Einheitlichkeit sollte diese Puffer immer an der Temperatur, bei der sie verwendet werden pH-eingestellt. </li></ol> 2. Zellkultur Hinweis: Geeignete Zellkulturprotokolle werden auf Basis von Zelltyp (en) variieren. Diese Verfahren müssen separat optimiert werden. Detaillierte Zellkulturmethoden sind leicht verfügbar, einschließlich 16. Ein ähnliches Verfahren wurde verwendet, um die repräsentative Ergebnisse, mit den bemerkenswerten Unterschiede zu erhalten: <ol><li> Kultur Dorsalwurzelganglien Neuronen von erwachsenen Tieren wie beschrieben 12. Verwenden Erwachsenen-Neuron-Wachstumsmedium zur Kultur der Zellen. Reduzieren Sie die Glia-Zelldichte von Vorplattieren statt Glutamat. Dies resultiert in einer gemischten Neuronen Gliazellen Kultur auf 12-Runden-Deckgläser mit mindestens 30-60 Neuronen pro Platte und die begleitenden Gliazellen gewachsen approximat gezüchtetely 40% Konfluenz. Es sei darauf hingewiesen, daß Neuronen in einer Primärkultur wird nicht replizieren und wird von der Platte durch cokultiviert Glia geschoben werden, wenn der Glia dürfen übermßig wachsen werden. Um zu vermeiden, die die Nervenzellen, ist die physische Reduktion von Gliazellen Zahlen vorzuziehen, chemische / pharmakologischen Methoden. Hinweis: Für die Zwecke dieses Protokolls wird angenommen, dass die Zellen von Interesse sind gewachsen ihre experimentell gewünschten Zustand und Monolayer-plattiert. Wir finden, dass Plattierung auf 12-Runden-Deckgläschen in 24-Well-Platten werden am bequemsten. Alle beschriebenen Mengen und Verfahren sind für eine Deck in eine Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen geeignet. </li></ol> 3. Medikamentöse Behandlung von kultivierten Zellen Hinweis: Mehrere aufeinanderfolgende oder sich überlappenden, sind medikamentöse Behandlungen möglich. Die Medikamente, Dosen / Konzentrationen und die Dauer der Belichtung verwendet werden von der besonderen Experiment ab. <ol><li> Entfernen Sie den ursprünglichen Wachstumsmedium 16 </sup&gt; und ersetzen Sie es mit Medium, das den Wirkstoff (en) von Interesse bei der gewählten Konzentration (en). In diesem Fall verwenden Sie in Kochsalzlösung 10 &amp; mgr; M von Morphine solubilisiert oder verwenden Sie Kochsalzlösung als Kontrolle. Hinweis: Es ist wichtig, dass jeder unabhängig replizieren (in der Regel eine einzige Platte mit 24 Vertiefungen Kultur) enthalten die gleichen gemeinsamen Kontrollbedingung. Dies erlaubt die Normalisierung der Daten über Replikate, die für inter-trial Variabilität korrigiert. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen in den ursprünglichen Wachstumsbedingungen 16 für 48 Stunden. </li><li> Für die anschließende medikamentöse Behandlungen, wiederholen Sie die Schritte 3.1 und 3.2 mit Deltorphin 1 uM, 1 uM SNC80 oder Fahrzeug und Inkubation für 60 min 12. Solubilisieren Deltorphin II in Wasser und löslich SNC80 bei 10 mM in 40 &amp; mgr; M HCl und beschallen, 1 mM in Wasser verdünnt. Hinweis: Dieses Protokoll die Wirkstoff (e) wurden in Lösung, so dass sie in der gewünschten Konzentration (en) in der ausgewählten Wachstumsmedium gelöst sein. Geeignete Verfahren fürwie Solubilisierung wird in Abhängigkeit von der Droge in Frage variieren und müssen separat optimiert werden. </li><li> Waschen Sie die Zellen vorsichtig dreimal mit ~ 1 ml Waschpuffer pro Waschgang. Führen Sie jede Wasch durch leichtes Ansaugen der Flüssigkeit aus dem Brunnen, dann prompt, und sanft, Nachfüllen die gut mit frischer Lösung, je nach Wunsch (in diesem Fall mit Waschpuffer). </li></ol> 4. Fixierung und Immunocytochemistry Hinweis: Die spezifische Markierung Ziele werden durch das Experiment variieren. In unserer Anwendung, die wir markierten delta-Opioidrezeptoren (DOR) und Rab5, Rab 11 und LAMP1, wie besprochen. Die spezifischen Antikörper verwendet, hängt von der speziellen Experiments abhängt. Optimale Markierungsbedingungen sind abhängig von den spezifischen Antikörper (n) verwendet. Eine wesentlich umfassendere Diskussion über dieses Thema ist unten. <ol><li> Fixieren der Zellen durch Immersion in ~ 300 &amp; mgr; l 4% Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphat gepufferter Salzlösung für 10 min bei 37 ºC. Anmerkung: Es ist wichtig, daß die 4% paraFormaldehyd frisch durch die Autofluoreszenz durch die Verwendung von zuvor gefrorenen Para verursacht, hergestellt werden. </li><li> Waschen Sie die Zellen vorsichtig, 3 mal mit ca. 1 ml Waschpuffer pro Waschgang, wie in 3.3 beschrieben. </li><li> Die Zellen in 300 ul Blockierungspuffer inkubieren für 2 h bei RT. </li><li> Die Zellen mit primären Antikörpern in 300 ul Antikörperverdünnung 48 h Inkubation bei 4 ºC. In unserer Verwendung primärer Antikörper gegen DOR (Kaninchen anti-DOR) und eines der folgenden: Rab5 (Maus-anti-Rab5), Rab 11 (Maus-anti-Rab11) und LAMP1 (Ziege-anti-LAMP1). </li><li> Waschen Sie die Zellen vorsichtig dreimal mit ca. 1 ml Waschpuffer pro Waschgang, wie in 3.3 beschrieben. </li><li> Die Zellen mit Sekundärantikörper zu verschiedenen Fluorophoren konjugiert inkubieren (siehe Diskussion unten) in 300 &amp; mgr; l Antikörperverdünnungslösung für 1 h bei RT. In diesem und allen nachfolgenden Schritten, schützen die Zellen vor Licht. Um repräsentative Ergebnisse zu erhalten, verwenden grün emittierende Fluorophor-konjugierten Anti-Kaninchen und either eine rot emittierende Fluorophor-konjugierten Anti-Maus oder rot emittierende Fluorophor-konjugierten Anti-Ziege. </li><li> Waschen Sie die Zellen vorsichtig, 3 mal mit ca. 1 ml Waschpuffer pro Waschgang, wie in 3.3 beschrieben. </li><li> Entfernen Sie die 12-Runden-Deckgläser von Platten mit 24 Vertiefungen, indem Sie ~ 1 ml Waschpuffer in jede Vertiefung, hält die Platte bei ~ 45 °, und hebeln Sie das Deckglas aus der gut Boden mit feinen Pinzette. Das Deckglas wird kommen, um gegen die Bohrlochwand ruhen, von wo aus sie leicht mit der Pinzette entfernt werden. </li><li> Montieren Sie die Deckgläser, Zell-side-down, auf Objektträger mit Anti-Fading Eindeckmedium. </li></ol> 5. Mikroskop Einstellungen <ol><li> Unter Verwendung einer hohen Vergrößerung Ziel (100X), suchen Sie zuerst einen repräsentativen Zelle zur Verwendung Epifluoreszenz abgebildet werden. </li><li> Konfigurieren Sie die Bildaufnahme-Einstellungen für die Aufnahme 8-bit unkomprimiertes TIFF-Bilder von jedem markierten Kanal (für den Nachweis von jedem Fluorophor verwendet, beispielsweise 488 nm und 594 nm), die dem Bild mit jeder Kanal sequentiell (entweder online oder Rahmen), und um durchschnittlich 4 bis 6 Scans für das endgültige Bild. Optimale Bildauflösung Mikroskop spezifisch sein, aber 1024 x 1024 ergibt sich in der Regel gute Ergebnisse. </li><li> Schalter zur konfokalen Abbildung Pfad und zu konzentrieren, um eine z-Ebene durch die Mitte der Zelle. </li><li> Optimierung Pinhole (typischerweise 1 Airy-Einheit), die Laserleistung und Photovervielfacherröhre Spannung (Verstärkung) und Offset für jeden Kanal. Speichern / aufzeichnen diese Einstellungen. Verwenden Sie dieselben Einstellungen Mikroskop zur Abbildung aller Zellen für eine bestimmte Zielpaar in der gleichen Wiederholungs markiert. Hinweis: Dieses Verfahren wird in der Regel in einer ausreichenden Photobleichung, dass diese Zelle nicht für die Analyse abzubildenden führen. </li></ol> 6. Imaging <ol><li> Unter Verwendung einer hohen Vergrößerung Ziel (zB 100X), suchen Sie zuerst eine Zelle, um mit Epifluoreszenz abgebildet werden. </li><li> Schalter zur konfokalen Abbildung Pfad und zu konzentrieren, um eine z-Ebene durch die Mitte der Zelle. ICHf vorhanden, benutzerfreundliche Software-Zoom / Ernte, um den Scanbereich auf die Zelle von Interesse zu beschränken. </li><li> Machen Sie Bilder für jeden markierten Kanal mit den Einstellungen vorher festgelegten. Wiederholen Sie die Schritte 6.1 bis 6.3 für Bild in 15 oder mehr Zellen pro Zustand pro Wiederholung, um eine ausreichende Probe zu gewährleisten. </li></ol> 7. Kolokalisationsanalyse <ol><li> Öffnen Sie das Paar von Bildern (zB &quot;grüne&quot; und &quot;rot&quot;) einer Zelle in ImageJ. Verwenden Sie die Bild&gt; Farbe&gt; Merge Channels ... Befehl aus, um ein RGB-Bild zu erzeugen. </li><li> Zeichnen Sie eine Auswahl um die Zelle von Interesse. Verwenden Sie die ImageJ Plugin &quot;PSC Kolokalisation&quot; (11, erhältlich von https://www.cpib.ac.uk/tools-resources/software/psc-colocalization-plugin/) an Kolokalisation der Ziele in der ausgewählten Zelle zu quantifizieren. </li><li> Nehmen Sie das gewünschte Maß Kolokalisation (typischerweise Pearsons r 17). Wiederholen Sie die Schritte 7.1 bis 7.3 für jede Zelle abgebildet. </li></ol&gt; 8. Datennormalisierung <ol><li> Berechnen Sie den Mittelwert der aufgezeichneten Werte Kolokalisation der gemeinsamen Kontrollbedingungen der einzelnen Wiederholung jeder Etikettierung Zustand. Hinweis: Zum Beispiel, wird der Mittelwert der Kolokalisation Werte der Neuronen in der &quot;48-Stunden-Fahrzeug 60 min Fahrzeug&quot; drug Zustand in jeder der 3 unabhängige Wiederholungen in jeder der 3 Markierungsbedingungen (Rezeptor und jeweils 3 Kompartimente). </li><li> Multiplizieren Sie die Mittel, mit (-1) zu ergeben den Offset für jede Wiederholung in jeder Etikettierung Zustand. Der Offset hinzufügen für jede Wiederholung in jeder Etikettierung Zustand zu jedem Kolokalisation Wert in dieser Replikation. Hinweis: Dadurch werden die Daten zu normalisieren, so dass die Durchschnitts Kolokalisation Maß für die gemeinsame Steuerzustand 0 in jeder Wiederholung jeder Etikettierung Zustand. </li><li> Bündeln die Daten aus alle Wiederholungen jeder Etikettierung Zustand. Hinweis: Änderungen in Kolokalisation kann nun über Replikate analysiert werden. Statistische anallyse wird nach Versuchsanordnung ab, sondern wird in der Regel umfasst die Analyse-of-Varianz (ANOVA) durch entsprechende Post-hoc-Tests (zB Tukey) gefolgt. Für statistische Ressourcen finden Sie beispielsweise 18. </li></ol>

<ol>
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Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).</li><li>Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+colocalization+analysis+of+multicolor+confocal+immunofluorescence+microscopy+images:+pushing+pixels+to+explore+biological+phenomena.">Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena.</a> Acta Histochem. Cytochem. 40 (4), 101-111 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Wir haben dieses Protokoll für die Analyse der Primärkulturen adulter Dorsalwurzelganglionneuronen (primäre sensorische Neuronen) optimiert. Es kann auch verwendet werden, mit geringer oder keiner Modifikation, zum Monobeschichtete kultivierten Zellen breit. Die colocalizational Analyse ist auch möglich, in Gewebeschnitten und anderen solchen Zubereitungen 11, aber die Drogentherapie und Gewebefixierung / der Zubereitung Komponenten nicht angemessen wäre. Von Interesse ist, k...

Rezeptoren, insbesondere G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs), werden routine intrazellulär gehandelt, zu und von der Zelloberfläche 1. Diese aufwändig orchestrierte und streng kontrollierte Prozesse diktieren verfügbar Rezeptor Ergänzungen Zellen und regulieren Rezeptor zeitliche Aktivität, Desensibilisierung und Resensibilisierung 2-4. Wichtig ist, dass diese Verfahren, die auf zelluläre Umgebungen, einschließlich Arzneimittel-induzierte Rezeptor-Aktivität oder Inaktivität. Das heißt, die Aktionen der Liganden an Rezeptoren intrazellulären Transport von diesen Rezeptoren verändern, wodurch Zellreaktionsfähigkeit zu verändern. Auf diese Weise üben externe Liganden noch weitere Auswirkungen auf die Zellfunktion, auch jenseits der klassischen Messenger-zu-Effektor-Kaskaden 5,6. Prüfung solcher Änderungen induzierte Rezeptor-ist schwierig. Alle verfügbaren Techniken beinhalten Einschränkungen. Biotin-Schutzassays wurden benutzt, um monitor Oberflächenrezeptoren Populationen. Diese Rezeptoren werden biotinyliert und einen Zeitverlauf von Immunpräzipitationen durchgeführt, um die Verringerung der biotinylierte Rezeptoren über die Zeit quantifiziert. Diese Technik überwacht im Wesentlichen den allmählichen Abbau von einer anfänglichen, beschriftet, Bevölkerung von Rezeptoren 7 und ist sehr nützlich bei der Konstruktion von Zeitkurse dieses Prozesses. Leider ist dieser Test nicht imstande, jede andere als Verschlechterung des ursprünglichen Pool von Rezeptoren, wie die Internalisierung, Recycling oder neue Rezeptoren zu überwachen. Auch kann die Zugabe eines Antikörpers in dem 150kDa Bereich auf einen Rezeptor in der 50kDa Bereich des Rezeptors Handel 8,9 verändern, und diese Technik kann nur schwer mit niedrigen Expressionsebene Rezeptoren verwenden. Andere Verfahren verwenden verschiedene Methoden, um intrazellulären Transport Fächer (zB Endosomen, etc.) identifizieren und bewerten ihre Kolokalisation mit den Rezeptoren von Interesse. Dies beinhaltet die unse von heterologen Systemen zum Ausdruck Fluoreszenzprotein-markierten chimären Konstrukten der Rezeptoren und Fach-Marker (zB Rab-GTPasen). Dies ermöglicht potentiell die Verwendung von Live-Cell-Imaging, das Entfernen Fragen Fixierung und Permeabilisierung zusammen. Während mächtig, leidet eine solche Strategie aus den gleichen Einschränkungen der heterologen Systemen im Allgemeinen: tag und Expressionsniveau Auswirkungen auf den Menschenhandel Verhalten und Unvereinbarkeit mit mehreren physiologisch repräsentativen Zelltypen. Besser bekannt werden Farbstoffe verwendet werden, um leicht zu beschriften intrazellulären Kompartimenten (zB Lysosomen, angeblich) 10. Farbstoffe, können jedoch die Spezifität (alle sauren Organellen im Falle von Farbstoffen für die Lysosomen) fehlt und nicht Handels durch andere Kompartimente beurteilen. Dennoch, diese Techniken ermöglichen erhebliche Kontrolle über das System und die experimentellen Bedingungen und können von den Kolokalisationsanalyse hier vorgestellten Methoden, unten zu profitieren. Das Verfahren whier anwesend e verfeinert die Verfolgung von Rezeptor-durch Kolokalisation. Verwendung Immuncytochemie (ICC) auf geeignete Marker kennzeichnen, ist es möglich, mehrere unterschiedliche intrazelluläre Kompartimente zu identifizieren. Dies ermöglicht auch die Verwendung von physiologisch relevanten primären Zellkulturen anstelle von heterologen Systemen. Das ICC-Protokoll beinhaltet die Festsetzung der Zellen von Interesse vor der Markierung; dies ermöglicht die Kennzeichnung bei einem bestimmten Zeitpunkt nach der Arzneimittelbehandlung (en). Dies erzeugt eine &quot;Momentaufnahme&quot; der globalen Rezeptor-Kammer-Verbände zu diesem Zeitpunkt. Mit mehreren Zeitpunkten kann ein Zeitverlauf des Menschenhandels Änderungen auch gebaut werden. Kurz gesagt, Zellen werden mit Arzneimittel behandelten, für den Rezeptor und intrazellulären Kompartiment von Interesse markiert konfokal abgebildet wird und die Mikrophotographien, werden analysiert, um mathematisch quantifizieren Kolokalisation des Rezeptors und das Fach 11. In unserer Anwendung, die Co-Lokalisierung eines Rezeptors mit Ra untersuchten wirb5, Rab11 und Lysosomale-associated membrane protein 1 (LAMP1). Diese Marker identifizieren frühe Endosomen, Recycling Endosomen und Lysosomen sind. Diese Kolokalisation Maßnahmen wirken als Proxies für die übergreifenden Prozesse der Verinnerlichung, Recycling und Abbau 12. Wie bei allen Techniken sollen einige Einschränkungen berücksichtigt werden. Aufgrund der Notwendigkeit, jede einzelne Bild Neuron analysiert, kann dieses Verfahren ziemlich arbeitsintensiv werden abhängig von der Anzahl von Bedingungen und Zeitpunkte einbezogen. Alle Immunomarkierung muss auch mit den Auswirkungen auf die zelluläre Ultrastruktur, Protein-Lokalisierung und Epitop Erreichbarkeit mit Fixierung und Permeabilisierung 13 verursacht kämpfen. Obwohl ursprünglich für die Verwendung mit primären Kulturen von primären sensorischen Neuronen optimiert ist dieses Verfahren weitgehend mit anderen Monoschicht überzogenen Kulturmodellen. Die Verwendung eines mathematisch quantifiziert measure der Kolokalisation ist, vor allem, viel mehr methodisch rigorosen als bisherige Techniken verwendet werden, um Rezeptor-Änderungen, die oft auf vage, subjektive Maßnahmen wie visuell inspiziert Multi-Channel-Überlagerungen 14 verlassen haben, zu beurteilen. Diese Technik ist besonders nützlich für ihre gute Verträglichkeit mit den in-vivo-Interventionen (vor der Primärkultur Generation), In-vitro-Interventionen (während der Kulturwachstum) und verschiedene Kennzeichnungs zielt 15. Als solches kann es viele verschiedene Forschungsfragen angepasst werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td align="right">258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7041-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td align="right">720084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 circle Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td align="right">1254580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua/Poly-Mount</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>18606-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9638-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9763-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>00380-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps - Standard/Dumoxel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-DOR antibody</td>
			<td>MyBioSource</td>
			<td>MBS316175</td>
			<td>Used at 1:1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Rab5 antibody</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R7904</td>
			<td>Used at 1:750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Rab11 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-853</td>
			<td>Used at 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-LAMP1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC8098</td>
			<td>Used at 1:750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>Used at 1:200 to 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-11005</td>
			<td>Used at 1:200 to 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-11058</td>
			<td>Used at 1:200 to 1:2000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking drug-induced changes in receptor post-internalization trafficking by colocalizational analysis

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.

Mit dieser Technik ist es möglich, Änderungen in der Post-Rezeptor-Internalisierung Handel folgenden sowohl chronische / akute und längere medikamentöse Behandlungen zu quantifizieren. Nach medikamentöser Behandlung, Fixierung, und Kennzeichnung sind hochauflösenden Zwei-Kanal-Mikrofotografien von jeder Zelle von Interesse erfasst. Repräsentative Bilder können mit Falschfarben Kolokalisation kombiniert werden, um illustrative Zahlen (Abbildung 1) zu erzeugen. Anschließende colocalizational Anal...

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Tracking Drug-induced Changes in Receptor Post-internalization Trafficking by Colocalizational Analysis

Rezeptor-moduliert Signalisierung und Zellen gegenüber Liganden und ist selbst in Reaktion auf Zellbedingungen, einschließlich Liganden-induzierte Signalisierung. Hier beschreiben wir eine leistungsfähige und flexible Methode zur quantitativen Beurteilung der Arzneimittel-induzierte Rezeptor-Verwendung von Immunmarkierung und colocalizational Analyse.

Tracking-Drug-induzierte Veränderungen der Post-Rezeptor-Internalisierung Handel durch Colocalizational Analysis

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and ...

tracking-drug-induced-changes-receptor-post-internalization

Research

JoVE Journal

Biology

8.7K Aufrufe.  University of California Irvine.  Rezeptor-moduliert Signalisierung und Zellen gegenüber Liganden und ist selbst in Reaktion auf Zellbedingungen, einschließlich Liganden-induzierte Signalisierung. Hier beschreiben wir eine leistungsfähige und flexible Methode zur quantitativen Beurteilung der Arzneimittel-induzierte Rezeptor-Verwendung von Immunmarkierung und colocalizational Analyse. 

Serie: Tracking Drug-induced Changes in Receptor Post-internalization Trafficking by Colocalizational Analysis

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no curative treatment available. Recent advances in stem cell biology have generated new hopes for the development of effective cell based therapies to treat these diseases. Transplantation of various types of stem cells labeled with fluorescent proteins into muscles of dystrophic animal models has been used broadly in the field. A non-invasive technique with the capability to track the transplanted cell fate longitudinally can further our ability to evaluate muscle engraftment by transplanted cells more accurately and efficiently.
In the present study, we demonstrate that in vivo fluorescence imaging is a sensitive and reliable method for tracking transplanted GFP (Green Fluorescent Protein)-labeled cells in mouse skeletal muscles. Despite the concern about background due to the use of an external light necessary for excitation of fluorescent protein, we found that by using either nude mouse or eliminating hair with hair removal reagents much of this problem is eliminated. Using a CCD camera, the fluorescent signal can be detected in the tibialis anterior (TA) muscle after injection of 5 x 105 cells from either GFP transgenic mice or eGFP transduced myoblast culture. For more superficial muscles such as the extensor digitorum longus (EDL), injection of fewer cells produces a detectable signal. Signal intensity can be measured and quantified as the number of emitted photons per second in a region of interest (ROI). Since the acquired images show clear boundaries demarcating the engrafted area, the size of the ROI can be measured as well. If the legs are positioned consistently every time, the changes in total number of photons per second per muscle and the size of the ROI reflect the changes in the number of engrafted cells and the size of the engrafted area. Therefore the changes in the same muscle over time are quantifiable. In vivo fluorescent imaging technique has been used primarily to track the growth of tumorogenic cells, our study shows that it is a powerful tool that enables us to track the fate of transplanted stem cells.

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

We describe an in vivo fluorescence imaging protocol to monitor muscle regeneration by GFP-labeled myoblasts after transplantation into skeletal muscles of both healthy and dystrophic mice. This protocol can be adapted to study muscle regeneration by transplantation of other types of cells and in other muscular conditions as well.

Tracking-Dynamics of Muscle Engraftment bei Kleintieren durch In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no ...

Forschung

Biologie

Environmentally Induced Heritable Changes in Flax

Some flax varieties respond to nutrient stress by modifying their genome and these modifications can be inherited through many generations. Also associated with these genomic changes are heritable phenotypic variations 1,2. The flax variety Stormont Cirrus (Pl) when grown under three different nutrient conditions can either remain inducible (under the control conditions), or become stably modified to either the large or small genotroph by growth under high or low nutrient conditions respectively. The lines resulting from the initial growth under each of these conditions appear to grow better when grown under the same conditions in subsequent generations, notably the Pl line grows best under the control treatment indicating that the plants growing under both the high and low nutrients are under stress. One of the genomic changes that are associated with the induction of heritable changes is the appearance of an insertion element (LIS-1) 3, 4 while the plants are growing under the nutrient stress. With respect to this insertion event, the flax variety Stormont Cirrus (Pl) when grown under three different nutrient conditions can either remain unchanged (under the control conditions), have the insertion appear in all the plants (under low nutrients) and have this transmitted to the next generation, or have the insertion (or parts of it) appear but not be transmitted through generations (under high nutrients) 4. The frequency of the appearance of this insertion indicates that it is under positive selection, which is also consistent with the growth response in subsequent generations. Leaves or meristems harvested at various stages of growth are used for DNA and RNA isolation. The RNA is used to identify variation in expression associated with the various growth environments and/or t he presence/absence of LIS-1. The isolated DNA is used to identify those plants in which the insertion has occurred.

Growing some flax varieties under nutrient stress results in genomic variation within a subset of the genome and phenotypic variation. A complex insertion at a specific site is associated with growth under various nutrient regimes and with changes in gene expression around this site.

Umweltfreundliche Induced vererbbare Veränderungen in Flax

Some flax varieties respond to nutrient stress by modifying their genome and these modifications can be inherited through many generations. Also ...

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling a specific biologic role as regulator, binder or catalyst. Information about tertiary contact formation is essential to understand the function of RNA molecules. Hydroxyl radicals (&bull;OH) are unique probes of the structure of nucleic acids due to their high reactivity and small size.1 When used as a footprinting probe, hydroxyl radicals map the solvent accessible surface of the phosphodiester backbone of DNA1 and RNA2 with as fine as single nucleotide resolution. Hydroxyl radical footprinting can be used to identify the nucleotides within an intermolecular contact surface, e.g. in DNA-protein1 and RNA-protein complexes. Equilibrium3 and kinetic4 transitions can be determined by conducting hydroxyl radical footprinting as a function of a solution variable or time, respectively. A key feature of footprinting is that limited exposure to the probe (e.g., 'single-hit kinetics') results in the uniform sampling of each nucleotide of the polymer.5
In this video article, we use the P4-P6 domain of the Tetrahymena ribozyme to illustrate RNA sample preparation and the determination of a Mg(II)-mediated folding isotherms. We describe the use of the well known hydroxyl radical footprinting protocol that requires H2O2 (we call this the 'peroxidative' protocol) and a valuable, but not widely known, alternative that uses naturally dissolved O2 (we call this the 'oxidative' protocol). An overview of the data reduction, transformation and analysis procedures is presented.

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by &#039;Peroxidative&#039; and &#039;Oxidative&#039; Hydroxyl Radical Footprinting

This protocol describes how to quantify the Mg(II)-dependent formation of RNA tertiary structure by two methods of hydroxyl radical footprinting.

Überwachung Equilibrium Veränderungen im RNA-Struktur von &quot;peroxidativer&quot; und &quot;Oxidativer &#39;Hydroxylradikal Footprinting

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecal Glucocorticoid-Analyse: Nicht-invasive Monitoring-Adrenal in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

We describe a modified method for membrane fraction isolation from human cells and sample preparation for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further introduce a GFP-labeling method to monitor SCAP trafficking using confocal microscopy. This protocol can be used in regular biology laboratories.

Analyse von SCAP<em&gt; N</em&gt; -glycosylation Und Handel in menschlichen Zellen

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of ...

Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in transfected human embryonic kidney-293 (HEK) cells following stimulation with angiotensin II (Ang II). HEK cells are transiently transfected with plasmid DNA containing AT1aR tagged with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Lysosomes are identified with a red fluorescent dye. Live-cell images are captured on a laser scanning confocal microscope after Ang II stimulation and analyzed by software in three dimensions (3D, voxels) over time. Live-cell imaging enables investigations into receptor trafficking and avoids confounds associated with fixation, and in particular, the loss or artefactual displacement of EGFP-tagged membrane receptors. Thus, as individual cells are tracked through time, the subcellular localization of receptors can be imaged and measured. Images must be acquired sufficiently rapidly to capture rapid vesicle movement. Yet, at faster imaging speeds, the number of photons collected is reduced. Compromises must also be made in the selection of imaging parameters like voxel size in order to gain imaging speed. Significant applications of live-cell imaging are to study protein trafficking, migration, proliferation, cell cycle, apoptosis, autophagy and protein-protein interaction and dynamics, to name but a few.

Here we present a protocol to image cells expressing green fluorescent protein-tagged angiotensin type 1a receptors during endocytosis initiated by angiotensin II treatment. This technique includes labeling lysosomes with a second fluorescent marker, and then utilizing software to analyze the co-localization of receptor and lysosome in three dimensions over time.

Live Cell Imaging und 3D-Analyse von Angiotensin-Rezeptor-Typ 1a Handel Transfizierte humane embryonale Nierenzellen mittels konfokaler Mikroskopie

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent fusion proteins, such as green fluorescent protein (GFP), to determine their expression, localization, and function. The subcellular localization of target proteins is important for identification, characterization, and functional analyses. Internalization is one of the predominant mechanisms controlling G protein-coupled receptor (GPCR) signaling to ensure the appropriate cellular responses to stimuli. Here, we describe an experimental method to detect the subcellular localization and internalization of GPCR in HEK293 cells with confocal microscopy. In addition, this experiment provides some details about cell culture and transfection. This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescent markers and is applicable to the visualization of the subcellular localization of a majority of proteins, as well as of the internalization of GPCR. This technique should enable researchers to efficiently manipulate GPCR gene expression in mammalian cell lines and should facilitate studies on GPCR subcellular localization and internalization.

This protocol describes confocal microscopy detection of G protein-coupled receptor (GPCR) internalization in mammalian cells. It includes the basic cell culture, transfection, and confocal microscopy procedure and provides an efficient and easily interpretable method to detect the subcellular localization and internalization of fusion-expressed GPCR.

Detektion von Liganden-aktivierte G-Protein gekoppelten Rezeptor-Internalisierung durch konfokale Mikroskopie

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Eine grafische Benutzeroberfläche für die softwaregestützte Verfolgung der Proteinkonzentration in dynamischen zellulären Vorsprüngen

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult mice for in vivo longitudinal real-time monitoring of thymocytes&#180; dynamics within a vascularized thymus segment. Following the transplantation, laser scanning microscopy (LSM) through the cornea allows in vivo noninvasive repeated imaging at cellular resolution level. Importantly, the approach adds to previous intravital T-cell maturation imaging models the possibility for continuous progenitor cell recruitment and mature T-cell egress recordings in the same animal. Additional advantages of the system are the transparency of the grafted area, permitting macroscopic rapid monitoring of the implanted tissue, and the accessibility to the implant allowing for localized in addition to systemic treatments. The main limitation being the volume of the tissue that fits in the reduced space of the eye chamber which demands for lobe trimming. Organ integrity is maximized by dissecting thymus lobes in patterns previously shown to be functional for mature T-cell production. The technique is potentially suited to interrogate a milieu of medically relevant questions related to thymus function that include autoimmunity, immunodeficiency and central tolerance; processes which remain mechanistically poorly defined. The fine dissection of mechanisms guiding thymocyte migration, differentiation and selection should lead to novel therapeutic strategies targeting developing T cells.

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

The goal of the protocol is to show longitudinal intravital real-time tracking of thymocytes by laser scanning microscopy in thymic implants in the anterior chamber of the mouse eye. The transparency of the cornea and vascularization of the graft allows for continuously recording progenitor cell recruitment and mature T-cell egress.

Echtzeit- In Vivo Verfolgung von Thymozyten in die Vorderkammer des Auges durch Laser-Scanning-Mikroskopie

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...