Die Autoren möchten FORTE Projekt, das von der Region Toskana (POR Creo FESR 2007-2013 Bando Unico R &amp; S 2012) finanziert werden, die EU FP7 ECHORD ++ Experiment LA-Rosen, die teilweise die Forschungsaktivitäten unterstützt und das RP7 BiophotonicPlus Projekt &quot;LITE&quot; gewährt danke von der Region Toskana.

Die Studie wurde prospektiv mit der Genehmigung der Ethikkommission des Krankenhauses durchgeführt; informierte Zustimmung erhalten. Die Studie wurde im Festhalten an den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki. 1. Donor Endothel Vorbereitung <ol><li> Verwenden Sie eine Spenderhornhaut wurden von den lokalen Hautbank bei Raumtemperatur hergestellt. </li><li> Im Operationssaal, ziehen Sie die Spenderhornhaut von der Liefer Behälter und abheben die Lösung für Gewebekonservierung und Ernährung, die für die Hornhauttransport verwendet wird. </li><li> Setzen Sie den Spender-Hornhaut Sklerarand über eine künstliche Vorderkammer, in die eine Flüssigkeit fließen kann und eine variable Druck; decken die Hornhaut mit der Gewebehaltekopf. </li><li> Verbinden den künstlichen Vorderkammer (AAC) durch ein 3-Wege-Verbinder, um eine Spritze mit der Kornea Konservierung und Ernährung Flüssigkeit gefüllt. </li><li> Verwenden Sie den Kompressionsring, um den Halter sicher an seinem Platz zu halten. </li><li> Verwenden Sie die syringe verbunden ist, um die AAC, um den Druck aufrecht zu erhalten intracameral: die Vorderkammer mit der Gewebekonservierungslösung füllen bis zum Erreichen der optimalen Druck (siehe 1.7). Schließen Sie den Stecker. </li><li> Testen der Druck innerhalb der vorderen Kammer mit einem Finger. Ändern Sie den inneren Druck bis zum Erreichen des rechten Innendruck (im Bereich von 60 bis 70 mmHg). Schließen Sie das 3-Wege-Anschluss. </li><li> Messen Sie die Dicke der Spenderhornhaut mit Optical Coherence Thomography (OCT). Pflegen Sie die Vorderkammer mit dieser Hornhaut in einer festen Position vor den Geräteoptik und dann eine volle Dicke-OCT Erwerb. </li></ol> 2. Femtosekundenlaser Herstellung von Donor Endothel <ol><li> Zuführen Applanation der Spenderhornhaut unter dem Femtosekundenlaser-Vorrichtung. Verwenden Sie die femtosec Laser die Spendergewebe mit drei nachfolgenden Schnitte geschnitten: hintere Seite geschnitten, voller Lamellen und vorderen Seitenschnitt. Stellen Sie die folgenden Parameter für die drei Schnitte.<ol><li> Für das Gesamtlamellenschnitt (Rastermuster, beginnen), stellen Sie die Schnitttiefe entspricht der dünnsten Stelle der Spenderhornhaut (gemessen mit OCT, wie in 1.8 beschrieben), immer Subtraktion 95 &amp; mgr; m. Stellen Sie die Pulsenergie im Bereich von 0,8 bis 0,9 &amp; mgr; J (je nach Arbeitstiefe). Stellen Sie die Durchmesser bis 8,7 mm. Stellen Sie die tangential Punktabstand bis 2 um. Stellen Sie den Radialpunktabstand bis 2 um. </li><li> Für die vorderen Seitenschnitt, stellen Sie den hinteren Tiefe 30 &amp; mgr; m tiefer als die vorherige vollständige Lamellen Schnitt. Stellen Sie die Pulsenergie bis 2,10 &amp; mgr; J; der Durchmesser auf 8,6 mm; die Fleckseparation bis 3 um, während die Schichttrennung bis 3 um. </li><li> Für die hinteren Seitenschnitt, suchen Sie die vordere Tiefe der hinteren Seite geschnitten 30 &amp; mgr; m nach vorn als die volle Lamellen Schnitt. Stellen Sie die hintere Tiefe bis 900 um. Stellen Sie die Pulsenergie bis 2,10 &amp; mgr; J; der Durchmesser auf 8,3 mm; der Spot Trennung bis 2 um; die Schichttrennung bis 2 um. </li></ol></li&gt; </ol> 3. Empfänger Eye Vorbereitung <ol><li> Bereiten Sie den Patienten für die Chirurgie. Machen Sie einen 4,00 mm Hornhautschnitt um 12 Uhr mit einem 4,0 mm vorkalibriert Klinge. Machen Sie einen Limbus Parazentese mit einem 1,2 mm vorkalibriert Klinge, um 2 Uhr platziert. Stellen Sie einen anderen Limbus Parazentese bei 6 Uhr mit einem 30 ° stab Messer. </li><li> Legen Sie eine vordere Kammer Betreuer in der vorderen Augenkammer des Patienten, durch die 2.00 Parazentese. </li><li> Führen Sie einen 8,2 mm Durchmesser Kreis descemetorexis mit der dedizierten Haken. </li><li> Isolieren Sie die Descemet-Membran und Endothel von der hinteren Stroma und entfernen Sie das Gewebe mit einem Descemet Haken. </li></ol> 4. Chromophor Vorbereitung <ol><li> Setzen Sie 1 mg Indocyaningrün Pulver in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Hinzuzufügen 9 mg steriles Wasser (der ICG-Wasserlösung ist 10% w / w). </li><li> Manuell mischen die ICG-Pulver und das Wasser mit einem Metall Rührer. </li&gt; </ol> 5. Die Färbung der Donor Endothel <ol><li> Setzen Sie den Spender Endothel auf die breiteren Teil eines Busin-Injektor, mit der Innenseite in Kontakt mit der Einspritzfläche. </li><li> Flecken auf der Innenseite der Spender Endothel mit der Chromophor-Lösung in ihrem Randbereich, mit einem Spatel. Die richtig gefärbten Gewebe eine homogene grünliche Farbe. 3 min warten, bevor Sie Schritt 5.3. </li><li> Ziehen Sie den Geber Endothel am vorderen Teil des Busin-Injektor, gerollt. </li></ol> 6. Einsetzen der Donor Endothel <ol><li> Fassen Sie und legen Sie die gefalteten Spender Endothel mit einer atraumatischen koaxialen Zange für endothelial Linse. </li><li> Entfernen Sie die Vorderkammer Betreuer. </li><li> Naht der Hornhautschnitt und die Punktion (in Schritt 3.1 durchgeführt) mit einem Nylon 10,0 einzigen Stich. </li><li> Spritzen Sie eine Luftblase, um die Spendergewebe entfalten und gegen den Empfänger Hornhaut drücken. Die Luftblase muss compdie Vorderkammerraum letely zu füllen. </li></ol> 7. Laser Welding <ol><li> Platzieren des Spenders Linse in der Mitte des Empfängerhornhaut, von innen mit einem Haken oder einem Transport der Luftblase von der Außenseite der Hornhaut mit einem Spatel. </li><li> Mit einem Dioden-Laser mit Emission bei 810 nm, mit einem 300 &amp; mgr; m Kerndurchmesser sterile Glasfaser ausgestattet, mit 0,22 als die numerische Apertur (NA). </li><li> Halten Sie die Faserspitze außerhalb des Augapfels, und liefern die Laserlicht in Richtung des gefärbten Endothels, durch die transparente Hornhautgewebe. Die Faserspitze ist in berührungslose Konfiguration. </li><li> Verwenden Sie die folgenden Einstellungen für den Laser: single spot Emissionsmodus, 70-80 ms Impulsdauer, 35-40 mJ pro Puls. He-Ne-Zielstrahl auf. </li><li> Liefern einzelnen Laserspots auf der gefärbten Peripherie des Spenders Endothel. Liefern die Punkte nacheinander: der letzte Aspekt ist ein Ring von Punkten in dem Umfang der Geber Linse. Der Abstand zwischen zwei adjaCent-Spots Zentrum ist die Doppel eines Punktdurchmesser. </li><li> Tragen Sie eine Kontaktlinse auf dem Patientenauge, zusammen mit 0,3% Tobramycin und 0,1% Dexamethason ophthalmische Suspension. </li></ol>

<ol>
	<li>Tan, D. T., Dart, J. K., Holland, E. J., Kinoshita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+transplantation.">Corneal transplantation.</a> Lancet. 379 (9827), 1749-1761 (2012).</li><li>El Husseiny, M. A., Manero, F., Gris, O., Elies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Historical+Review+and+Update+of+Surgical+Treatment+for+Corneal+Endothelial+Diseases.">Historical Review and Update of Surgical Treatment for Corneal Endothelial Diseases.</a> Ophthalmol Ther. , (2014).</li><li>Rossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+tissue+welding+in+ophthalmic+surgery.">Laser tissue welding in ophthalmic surgery.</a> J Biophotonics. 1 (4), 331-342 (2008).</li><li>Pini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+femtosecond+laser+ablation+and+diode+laser+welding+in+lamellar+and+endothelial+corneal+transplants.">Combining femtosecond laser ablation and diode laser welding in lamellar and endothelial corneal transplants.</a> Proc. SPIE Ophthalmic Technologies XVIII. 6 (844), 684411-1-684411-7 (2008).</li><li>Rossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-laser'+endothelial+corneal+transplant+in+human+patients.">All-laser' endothelial corneal transplant in human patients.</a> Proc. SPIE Ophthalmic Technologies XXII. 8209, 82091O-1-82091O-3 (2012).</li><li>Rossi, F., Pini, R., Menabuoni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+and+model+analysis+on+the+temperature+dynamics+during+diode+laser+welding+of+the+cornea.">Experimental and model analysis on the temperature dynamics during diode laser welding of the cornea.</a> J Biomed Opt. 12 (1), 014031-1-014031-7 (2007).</li><li>Menabuoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-assisted+corneal+welding+in+cataract+surgery:+retrospective+study.">Laser-assisted corneal welding in cataract surgery: retrospective study.</a> J Cataract Refract Surg. 33 (9), 1608-1612 (2007).</li><li>Buzzonetti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Welding+in+Penetrating+Keratoplasty+and+Cataract+Surgery+in+Pediatric+Patients.+Early+Results.">Laser Welding in Penetrating Keratoplasty and Cataract Surgery in Pediatric Patients. Early Results.</a> J Cataract Refract Surg. 39 (12), 1829-1834 (2013).</li><li>Menabuoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+'anvil'+profile+in+femtosecond+laser-assistedpenetrating+keratoplasty.">The 'anvil' profile in femtosecond laser-assistedpenetrating keratoplasty.</a> Acta Ophthalmol. 91 (6), e494-e495 (2013).</li><li>Canovetti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-assisted+penetrating+keratoplasty:+one+year&#8217;s+results+in+patients,+using+a+laser-welded+&#8220;anvil&#8221;-profiled+graft.">Laser-assisted penetrating keratoplasty: one year&#8217;s results in patients, using a laser-welded &#8220;anvil&#8221;-profiled graft.</a> Am J Ophthalmol. 158 (4), 664-670 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Das &quot;all-Laser&quot; endotheliale Transplantat ist eine ursprüngliche Ansatz zur minimal-invasiven Hornhauttransplantation. Alle innerhalb des Protokolls beschriebenen Verfahren wurden im Operationssaal durchgeführt wird, unter Berücksichtigung der hygienischen und Sterilisationsverfahren, das gemeinsame Praktiken bei Operationen, wie zum Beispiel den Einsatz von sterilisierten Handschuhe, Kittel, Maske und Kappe sind. Der ICG-Lösung wurde in den Operationsraum kurz vor seiner Anwen...

In dieser Arbeit stellen wir eine originelle Herangehensweise an endothelialen Keratoplastik, die auf der Verwendung eines Femtosekundenlasers zur Spendergewebe und eine Nah-Infrarot-Dioden-Laser, um es auf den Empfänger Bett schweißen vorzubereiten. Intraoperative Messung der Spenderhornhaut erforderlich ist, um die Spendergewebe Abmessungen korrekt zu entwerfen. Endothelialen Keratoplastik hat sich in den letzten Jahren vorgeschlagen worden, Keratoplastik bei der Behandlung von Endothelzellen Krankheit 1,2 ersetzen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist eine schnellere visuelle Rückgewinnung, in Bezug auf Keratoplastik, reduziert Anästhesie während der Operation, einem verringerten Risiko einer Transplantatabstoßung und die Erhaltung der Integrität Auge. Der Hauptrisikofaktor ist die postoperative Spender Linse Luxation. Die Standardtechnik wird durch Einsetzen der Spender Endothel in seine endgültige Position, wo es durch die Injektion von einer Luftblase aufrechterhalten wird durchgeführt: keine Nähte aufgrund der mechanischen, biophysikalischen und Dimensions charaban verwendetcteristics des Endothels. Darüber hinaus kann die Sehschärfe Erholung vor allem wegen einer Nichtübereinstimmung zwischen Spender und Empfänger Gewebe aufgrund eines dicken Gewebe transplantiert begrenzt. Hier präsentieren wir eine Vorgehensweise bei der Durchführung von endothelialen Keratoplastik, die diese Hauptprobleme überwinden kann. Der Spender Endothel können in ihrer endgültigen Position durch die Verwendung der Laserschweißtechnik gewährleistet sein. Dies ist eine kontrollierte und lokalisierte photothermische Verfahren: Sie kann an der Donor / Empfängerschnittstelle induziert wird. Es hat sich in den letzten zehn Jahren untersucht und in Keratoplastik und in der Transplantation von Endothel 3-5 vorgeschlagen. Das Licht im nahen Infrarot (Wellenlänge: 810 nm) von einem niedrigen Leistungs Diodenlaser emittiert wird, in Richtung des biologischen Gewebes an der Wundstelle zugeführt. Die Hornhaut ist natürlich durchlässig für diese Wellenlänge: um dieses Gewebe zu machen, um das Laserlicht zu absorbieren, ist es notwendig, sie mit einem Chromophor zu färben. Die vorgeschlagene Farbstoff ein steriles Sättigungd Wasserlösung von Indocyaningrün (ICG). Wir zeigten, dass, wenn das Hornhautgewebe in geeigneter Weise auf diesem ICG Herstellung gefärbt, zeigt er ein Absorptionsmaximum bei 810 nm. 6 Darüber hinaus wird ICG weit verbreitet in der klinischen Diagnostik eingesetzt und seine Sicherheit wurde bereits beim Menschen nachgewiesen. Die gefärbten Kornea absorbiert die Diodenlaserlichtenergie und der Haupt resultierende Effekt ist eine kontrollierte Temperaturanstieg an der Schweißstelle. Keine thermische Effekte sind in den ungefärbten Geweben induziert. Die Temperatursteigerung bewirkt reversible thermische Denaturierung in stromalen Kollagen, mit einer sofortigen closuring der Wundwände beim Abkühlen. Das Laserschweißen Effekt wurde zum einen in der Kataraktchirurgie 7,8 und Keratoplastik 9,10 demonstriert. Eine optimierte Ansatz, den wir in diesem Papier präsentiert wurde für den Einsatz in endothelialen Keratoplastik untersucht. In der vorgeschlagenen Operation einzelnen Laserspots (Dauer Zehn msec) are an das Gewebe geliefert wird, was zu einer photothermischen Effekt innerhalb des Flecks Dimension (einige hundert &amp; mgr; m im Durchmesser) lokalisiert: die induzierte Effekt ist ein Festlaserschweißen, die aus einer Lichtkoagulation des Kollagens in der Donor / Host-Schnittstelle beschränkt. Das Ergebnis der Kollagen einer Denaturierung an der Schweißstelle ist eine starke Haftung zwischen dem Donor- und dem Wirtsgewebe, wodurch eine Nahteffekt, unmöglich, mit Standardverfahren (Stiche) zu erhalten. Das Gewebe wieder seine natürliche Optik in einer kurzen Follow-up (1 Monat) und die Haftung zwischen Donor / Wirtsgewebe wird durch die Schweiß in einem sehr frühen Stadium des Heilungsphase vorgesehen verbessert. Um die anderen Hauptrisiko der endothelialen Keratoplastik, also die Transplantation eines dicken Spendergewebe zu vermeiden, wird intra die optische Kohärenztomographie (OCT) verwendet: ein kommerzielles Gerät misst die Dicke der Spenderhornhaut, so dass eine korrekte Schnittprofil kann mit gestaltet sein diefemtosec Laser. Die vorgeschlagene &quot;all-Laser&quot; endothelial Transplantation scheint also, um die klinischen Ergebnisse dieser minimal-invasiven Chirurgie zu verbessern.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Indocyanine Green</td>
			<td>Pulsion Medical Systems, Germany</td>
			<td>ICG-PULSION (http://www.pulsion.com/international-english/perfusion/icg-pulsion/)</td>
			<td>Alternative product: IC-GREEN, Akorn&#160; Inc., Lake Forest, Illinois- US (http://www.icginjection.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtosecond Laser&#160;</td>
			<td>Abbott Medical Optics,&#160; Abbott Laboratories Inc. Abbott Park, Illinois, USA</td>
			<td>iFS150 (http://www.abbottmedicaloptics.com/products/refractive/ilasik/ifs-advanced-femtosecond-laser)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Coherence Tomography (OCT)</td>
			<td>Carl-Zeiss Meditec, Dublin, California- US (http://www.zeiss.com/meditec/en_de/home.html)</td>
			<td>Visante</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diode Laser</td>
			<td>E.l.En. Group s.pa., Calenzano-FI, Italy (http://www.elengroup.com/en/divisions/medical)</td>
			<td>Mod. WELD 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial Anterior Chamber</td>
			<td>CORONET, corneal graft products. Network Medical Products Ltd. Coronet House, Kearsley Road, Ripon, North Yorkshire, HG4 2SG, UK</td>
			<td>&#160;Artificial Anterior Chamber (A.A.C.) with large and small tissue-retaining heads. Code 51-935 (http://www.networkmedical.co.uk/ophthalmic_artificial_anterior_chamber.html)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution for tissue preservation and nutrition&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;AL.CHI.MI.A. Srl, Viale Austria 14, 35020 - Ponte S. Nicol&#242; - PD 
			&#160;ITALY</td>
			<td>Carry-C media for corneal deturgescence and transport at room temperature - 12 x 50 ml (http://www.alchimiasrl.com/en/organ-culture-at-31&#176;-c-eb/carry-c-eb)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an &#8220;all-laser&#8221; endothelial transplant

The &#8220;all laser&#8221; assisted endothelial keratoplasty is a procedure that is performed with a femtosecond laser used to cut the donor tissue at an intended depth, and a near infrared diode laser to weld the corneal tissue. The proposed technique enables to reach the three main goals in endothelial keratoplasty: a precise control in the thickness of the donor tissue; its easy insertion in the recipient bed and a reduced risk of donor lenticule dislocation. The donor cornea thickness is measured in the surgery room with optical coherence tomography (OCT), in order to correctly design the donor tissue dimensions. A femtosecond laser is used to cut the donor cornea. The recipient eye is prepared by manual stripping of the descemetic membrane. The donor endothelium is inserted into a Busin-injector, the peripheral inner side is stained with a proper chromophore (a water solution of Indocyanine Green) and then it is pulled in the anterior chamber. The transplanted tissue is placed in the final and correct location and then diode laser welding is induced from outside the eyeball. The procedure has been performed on more than 15 patients evidencing an improvement in surgery performances, with a good recovery of visual acuity and a reduced donor lenticule dislocation event.

Die &quot;Alles-Laser&quot; chirurgische Verfahren wird vorgeschlagen, um minimal-invasive Hornhauttransplantation durchzuführen. Das Verfahren ist einfach durchzuführen (siehe Abbildung 1): in Bezug auf eine Standard endothelial Transplantation nur die Schritte der Messung der Hornhautdicke, Anfärben des Spendergewebes und zum Liefern des Laserlichts werden zugegeben. Die erzielten Vorteile weitestgehend kompensieren eine erhöhte Operationsdauer von einigen min. Die Anwendung von intraoperativen Ok...

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An &amp;#8220;All-laser&amp;#8221; Endothelial Transplant

An all laser procedure is proposed in the endothelial transplant. The surgical technique is based on the use of a femtosecond laser to prepare the donor tissue. Laser welding technique is then used to secure the donor endothelium in the correct position.

Ein &quot;All-Laser&quot; Endothelial Transplant

The &#8220;all laser&#8221; assisted endothelial keratoplasty is a procedure that is performed with a femtosecond laser used to cut the donor tissue at an ...

Research

JoVE Journal

Medicine

An &#8220;All-laser&#8221; Endothelial Transplant

9.3K Aufrufe.  Italian National Research Council. An all laser procedure is proposed in the endothelial transplant. The surgical technique is based on the use of a femtosecond laser to prepare the donor tissue. Laser welding technique is then used to secure the donor endothelium in the correct position.

Serie: An &#8220;All-laser&#8221; Endothelial Transplant

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules that regulate HSCs. In these transplant model systems, the function of HSCs is determined by the ability of these cells to engraft and reconstitute lethally irradiated recipient mice. Commonly, the donor cell contribution/engraftment is measured by antibodies to donor- specific cell surface proteins using flow cytometry. However, this method heavily depends on the specificity and the ability of the cell surface marker to differentiate donor-derived cells from recipient-originated cells, which may not be available for all mouse strains. Considering the various backgrounds of genetically modified mouse strains in the market, this cell surface/ flow cytometry-based method has significant limitations especially in mouse strains that lack well-defined surface markers to separate donor cells from congenic recipient cells. Here, we reported a PCR-based technique to determine donor cell engraftment/contribution in transplant recipient mice. We transplanted male donor bone marrow HSCs to lethally irradiated congenic female mice. Peripheral blood samples were collected at different time points post transplantation. Bone marrow samples were obtained at the end of the experiments. Genomic DNA was isolated and the Y chromosome specific gene, Zfy1, was amplified using quantitative Real time PCR. The engraftment of male donor-derived cells in the female recipient mice was calculated against standard curve with known percentage of male vs. female DNAs. Bcl2 was used as a reference gene to normalize the total DNA amount. Our data suggested that this approach reliably determines donor cell engraftment and provides a useful, yet simple method in measuring hematopoietic cell reconstitution in murine bone marrow transplantation models. Our method can be routinely performed in most laboratories because no costly equipment such as flow cytometry is required.

Determining donor cell engraftment presents a challenge in mouse bone marrow transplant models that lack well-defined phenotypical markers. We described a methodology to quantify male donor cell engraftment in female transplant recipient mice. This method can be used in all mouse strains for the study of HSC functions.

Mittels quantitativer real-time PCR zum Donor Cell Engraftment in einem Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Modell fest

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Forschung

Medizin

Murine Heterotopic Heart Transplant Technique

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become proficient in and utilize this technique, it is now widely used by many laboratories around the world. A significant refinement to the original technique was developed and reported in 2001 by Niimi. Described here are the techniques that have evolved over more than a decade in the hands of three surgeons (Plenter, Grazia, Pietra) in our center. These techniques are now being passed on to a younger generation of surgeons and researchers.
Based largely on the Niimi experience, the procedures used have evolved in the fine details - details which we will endeavor to relate here in such a way that others may be able to use this very useful model. Like Niimi, we have found that a video aid to learning is a priceless resource for the beginner.

The manuscript describes the steps required to perform the heterotopic heart transplant in the mouse.

Murine Heterotope Heart Transplant-Technik

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become ...

Technique of Porcine Liver Procurement and Orthotopic Transplantation using an Active Porto-Caval Shunt

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. Each year, a considerable number of patients on the liver transplantation waiting list die without receiving an organ transplant or are delisted due to disease progression. Even after a successful transplantation, rejection and side effects of immunosuppression remain major concerns for graft survival and patient morbidity. 
Experimental animal research has been essential to the success of liver transplantation and still plays a pivotal role in the development of clinical transplantation practice. In particular, the porcine orthotopic liver transplantation model (OLTx) is optimal for clinically oriented research for its close resemblance to human size, anatomy, and physiology. 
Decompression of intestinal congestion during the anhepatic phase of porcine OLTx is important to guarantee reliable animal survival. The use of an active porto-caval-jugular shunt achieves excellent intestinal decompression. The system can be used for short-term as well as long-term survival experiments. The following protocol contains all technical information for a stable and reproducible liver transplantation model in pigs including post-operative animal care.

Experimental animal research plays a pivotal role in the development of clinical transplantation practice. The porcine orthotopic liver transplantation model (OLTx) closely resembles human conditions and is frequently used in clinically oriented research. The following protocol contains all information for a reliable porcine OLTx model using an active porto-caval-jugular shunt.

Technik der Schweineleber Beschaffung und orthotopen Transplantation mit einem Active Porto-Kava-Shunt

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. Each year, a considerable number of patients on the liver transplantation ...

Mouse Model of Alloimmune-induced Vascular Rejection and Transplant Arteriosclerosis

Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune system of the recipient causes damage of the arterial wall and dysfunction of endothelial cells and smooth muscle cells. This triggers a pathological repair response that is characterized by intimal thickening and luminal occlusion. Understanding the mechanisms by which the immune system causes vasculature rejection and TA may inform the development of novel ways to manage graft failure. Here, we describe a mouse aortic interposition model that can be used to study the pathogenic mechanisms of vascular rejection and TA. The model involves grafting of an aortic segment from a donor animal into an allogeneic recipient. Rejection of the artery segment involves alloimmune reactions and results in arterial changes that resemble vascular rejection. The basic technical approach we describe can be used with different mouse strains and targeted interventions to answer specific questions related to vascular rejection and TA.

We describe a protocol for aortic interposition grafting in mice. The goal of the protocol is to provide a model with which to study pathological processes and therapeutic strategies relevant to alloimmune reactions in arteries and the resultant arterial changes that contribute to organ transplant failure.

Maus-Modell der Alloimmune-induzierte Gefäßabstoßung und Transplantat-Arteriosklerose

Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune ...

Murine Kidney Transplant Technique

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become proficient in and utilize this technique, it is now widely used by many laboratories around the world. A significant refinement to the original technique using the donor aorta to form the arterial anastomosis instead of the renal artery was developed and reported in 1993 by Kalina and Mottram 2 with a further advancement coming from the same laboratory in 1999 3. While one can become proficient in this model, a search of the literature reveals that many labs still experience a high proportion of graft loss due to arterial thrombosis. We describe here a technique that was devised in our laboratory that vastly reduces the arterial thrombus reported by others 4,5. This is achieved by forming a heel-and-toe cuff of the donor infra-renal aorta that facilitates a larger anastomosis and straighter blood flow into the kidney.

The goal of this manuscript is to describe the steps required to perform a kidney transplant in a mouse, paying particular attention to the details of the arterial anastomosis.

Murine Nierentransplantations Technik

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

Verbesserte Methode für die Einrichtung einer In-vitro- Blut - Hirn-Schranke Modell auf porcinen Endothelzellen Gehirnzellen basiert

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Optimized Griess Reaction for UV-Vis and Naked-eye Determination of Anti-malarial Primaquine

Primaquine (PMQ), an important anti-malarial drug, has been recommended by the World Health Organization (WHO) for the treatment of life-threatening infections caused by P. vivax and ovale. However, PMQ has unwanted adverse effects that lead&#160;to acute hemolysis in patients with glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) deficiency. There is a need to develop simple and reliable methods for PMQ determination with the purpose of dosage monitoring. In early 2019, we have reported an UV-Vis and naked-eye based approach for PMQ colorimetric quantification. The detection was based on a Griess-like reaction between PMQ and anilines, which can generate colored azo products. The detection limit for direct measurement of PMQ in synthetic urine is in the nanomolar range. Moreover, this method has shown great potential for PMQ quantification from human serum samples at clinically relevant concentrations. In this protocol, we will describe the technical details regarding the syntheses and characterization of colored azo products, the reagent preparation, and the procedures for PMQ determination.

This protocol describes a novel colorimetric method for antimalarial primaquine (PMQ) detection in synthetic urines and human serums.

Optimierte Griess-Reaktion für UV-Vis und Nacktaugenbestimmung von Anti-Malaria-Primaquin

Primaquine (PMQ), an important anti-malarial drug, has been recommended by the World Health Organization (WHO) for the treatment of life-threatening ...

Organ Ischemia-Reperfusion Injury by Simulating Hemodynamic Changes in Rat Liver Transplant Model

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats is a tried and proven animal model used for preoperative, intraoperative, and postoperative studies, including ischemia-reperfusion injury (IRI) of extrahepatic organs. This model requires numerous experiments and devices. The duration of anhepatic phase is closely related to the time to develop IRI after transplantation. In this experiment, we used hemodynamic changes to induce extrahepatic organ damage in rats and determined the maximum tolerance time. The time until the most severe organ injury varied for different organs. This method can easily be replicated and can also be used to study IRI of the extrahepatic organs after liver transplantation.

This paper provides a detailed description of how to build an animal model of the anhepatic phase (liver ischemia) in rats to facilitate basic research into ischemia-reperfusion injury after liver transplantation.

OrganIschemia-Reperfusion Verletzung durch Simulation hämodynamischer Veränderungen im Lebertransplantationsmodell der Ratte

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats is a tried and proven animal model used for preoperative, intraoperative, and postoperative studies, ...

TBase - an Integrated Electronic Health Record and Research Database for Kidney Transplant Recipients

TBase is an electronic health record (EHR) for kidney transplant recipients (KTR) combining automated data entry of key clinical data (e.g., laboratory values, medical reports, radiology and pathology data) via standardized interfaces with manual data entry during routine treatment (e.g., clinical notes, medication list, and transplantation data). By this means, a comprehensive database for KTR is created with benefits for routine clinical care and research. It enables both easy everyday clinical use and quick access for research questions with highest data quality. This is achieved by the concept of data validation in clinical routine in which clinical users and patients have to rely on correct data for treatment and medication plans and thereby validate and correct the clinical data in their daily practice. This EHR is tailored for the needs of transplant outpatient care and proved its clinical utility for more than 20 years at Charit&#233; - Universit&#228;tsmedizin Berlin. It facilitates efficient routine work with well-structured, comprehensive long-term data and allows their easy use for clinical research. To this point, its functionality covers automated transmission of routine data via standardized interfaces from different hospital information systems, availability of transplant-specific data, a medication list with an integrated check for drug-drug interactions, and semi-automated generation of medical reports among others. Key elements of the latest reengineering are a robust privacy-by-design concept, modularity, and hence portability into other clinical contexts as well as usability and platform independence enabled by HTML5 (Hypertext Markup Language) based responsive web design. This allows fast and easy scalability into other disease areas and other university hospitals. The comprehensive long-term datasets are the basis for the investigation of Machine Learning algorithms, and the modular structure allows to rapidly implement these into clinical care. Patient reported data and telemedicine services are integrated into TBase in order to meet future needs of the patients. These novel features aim to improve clinical care as well as to create new research options and therapeutic interventions.

TBase combines an electronic health record with an innovative research database for kidney transplant recipients. TBase is built upon an in-memory database platform, connected to different hospital systems, and used for regular outpatient care. It automatically integrates all relevant clinical data including transplantation-specific data creating a unique research database.

TBase - eine integrierte elektronische Gesundheitsakte und Forschungsdatenbank für Nierentransplantationsempfänger

TBase is an electronic health record (EHR) for kidney transplant recipients (KTR) combining automated data entry of key clinical data (e.g., laboratory ...

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and subsequent vision loss. The inner blood-retinal barrier (iBRB) is mainly composed of retinal vascular endothelium with low permeability under physiological conditions. This feature of low permeability is tightly regulated and maintained by low rates of paracellular transport between adjacent retinal microvascular endothelial cells, as well as transcellular transport (transcytosis) through them. The assessment of retinal transcellular barrier permeability may provide fundamental insights into iBRB integrity in health and disease. In this study, we describe an endothelial cell (EC) transcytosis assay, as an in vitro model for evaluating iBRB permeability, using human retinal microvascular endothelial cells (HRMECs). This assay assesses the ability of HRMECs to transport transferrin and horseradish peroxidase (HRP) in receptor- and caveolae-mediated transcellular transport processes, respectively. Fully confluent HRMECs cultured on porous membrane were incubated with fluorescent-tagged transferrin (clathrin-dependent transcytosis) or HRP (caveolae-mediated transcytosis) to measure the levels of transferrin or HRP transferred to the bottom chamber, indicative of transcytosis levels across the EC monolayer. Wnt signaling, a known pathway regulating iBRB, was modulated to demonstrate the caveolae-mediated HRP-based transcytosis assay method. The EC transcytosis assay described here may provide a useful tool for investigating the molecular regulators of EC permeability and iBRB integrity in vascular pathologies and for screening drug delivery systems.

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

This protocol illustrates an in vitro endothelial cell transcytosis assay as a model to evaluate inner blood-retinal barrier permeability by measuring the ability of human retinal microvascular endothelial cells to transport horseradish peroxidase across cells in caveolae-mediated transcellular transport processes.

Endothelzell-Transzytose-Assay als In-vitro-Modell zur Beurteilung der Permeabilität der inneren Blut-Retina-Barriere

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...