המחברים מבקשים להודות FORTE פרויקט, ממומן על ידי טוסקנה אזור (POR קריאו FESR 2,007-2,013, Bando Unico R &amp; S 2012), האיחוד האירופי FP7 ECHORD ++ ניסוי LA-ורדים שחלקו תמכו בפעילויות המחקר, ו&quot; לייט &quot;FP7 BiophotonicPlus הפרויקט הוענק על ידי טוסקנה האזור.

המחקר נערך באישור מכאן ולהבא של ועדת האתיקה של בית החולים; הסכמה מהדעת הושגה. המחקר היה בדבקות בעקרונות של הצהרת הלסינקי. 1. תורם האנדותל הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש קרנית תורם כפי שהוכן על ידי הבנק המקומי עין בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחדר הניתוח, לשלוף את קרנית התורם מיכל המסירה ולהפריד את הפתרון לשימור רקמות ותזונה המשמש לתחבורה בקרנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את שפת קורנאו-scleral תורם מעל לשכה קדמית מלאכותית, שלתוכו נוזל יכול לזרום וליצור לחץ משתנה; לכסות את הקרנית עם ראש התמך רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את התא המלאכותי הקדמי (AAC) דרך מחבר 3-בדרך למזרק מלא בשימור הקרנית ונוזל תזונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בטבעת הדחיסה להחזיק את המסגרת באופן מאובטח במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בSYRאינגה מחוברת לAAC כדי לשמור על לחץ intracameral: למלא את התא הקדמי עם פתרון שימור רקמות עד שמגיע ללחץ האופטימלי (ראה 1.7). סגור את המחבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הלחץ בתוך התא הקדמי עם אצבע. לשנות את הלחץ בתוך עד שמגיע ללחץ הפנימי תקין (בטווח 60-70 מ&quot;מ כספית). סגור את מחבר 3-הדרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את העובי של קרנית התורם עם אופטי הלכידות Thomography (אוקטובר). לשמור על התא הקדמי עם קרנית שבתנוחה קבועה מול אופטיקה המכשיר ולאחר מכן לקחת רכישה מלאה עובי-OCT. </li></ol> 2. Femtosecond הכנת לייזר של האנדותל התורם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע applanation של קרנית התורם תחת מכשיר לייזר פמטו-השני. השתמש בליזר femtosec לחתוך את הרקמות התורמות עם שלושה חתכים הבאים: צד חתוך אחורי, שבשבת מלאה וצד חתוך קדמי. הגדר את הפרמטרים לשלושה החתכים הבאים.<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחיתוך מלא שבשבת (דפוס סריקה, להתחיל), להגדיר את עומק החתך מקביל לנקודה של הקרנית התורמת (נמדדה עם ב- OCT כפי שמתואר ב1.8) הדק, תמיד הפחתת 95 מיקרומטר. הגדר את אנרגיית הדופק בטווח .8-0.9 μJ (תלוי בעומק העבודה). הגדר את הקוטר 8.7 מ&quot;מ ל. הגדר הפרדת הנקודה משיקה 2 מיקרומטר. הגדר הפרדת נקודת רדיאלי 2 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצד החתך הקדמי, להגדיר את העומק האחורי 30 מיקרומטר עמוקים יותר מאשר לחתוך שבשבת מלאה הקודם. הגדר את האנרגיה הדופק ל2.10 μJ; הקוטר 8.6 מ&quot;מ; הפרדת המקום 3 מיקרומטר, תוך הפרדת השכבה 3 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתך הצד האחורי, לאתר את העומק הקדמי של הצד האחורי לחתוך 30 מיקרומטר anteriorly מאשר לחתוך שבשבת מלאה. הגדר את העומק האחורי עד 900 מיקרומטר. הגדר את האנרגיה הדופק ל2.10 μJ; הקוטר 8.3 מ&quot;מ; הפרדת המקום 2 מיקרומטר; הפרדת השכבה 2 מיקרומטר. </li></ol></li&gt; </ol> 3. נמען עין הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את החולה לניתוח. לעשות חתך בקרנית מ&quot;מ אחד 4.00 בשעה 12 עם 4.0 מ&quot;מ להב precalibrated. הפוך paracentesis אחד limbal עם להב precalibrated 1.2 מ&quot;מ, ממוקם שעה 2 בצהריים. לעשות עוד ניקור אחד limbal בשעה 6 עם סכין לדקור 30 מעלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מתחזק לשכה קדמי בלשכה הקדמית של המטופל, באמצעות הניקור 02:00. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע descemetorexis המעגלי בקוטר 8.2 מ&quot;מ אחד עם הוו הייעודי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיט את קרום Descemet והאנדותל מסטרומה האחורית ולהסיר את הרקמות עם וו Descemet. </li></ol> 4. הכנת Chromophore <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים 1 מ&quot;ג של אבקה ירוקה Indocyanine בצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 9 מ&quot;ג של מים סטריליים (פתרון המים ICG הוא 10% w / w). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידני לערבב את אבקת ICG ומים עם בוחש מתכת. </li&gt; </ol> 5. הכתמה של האנדותל התורם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים האנדותל התורם על החלק הרחב יותר של busin-מזרק, עם הצד הפנימי במגע עם משטח המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכתים את הצד הפנימי של האנדותל תורם עם פתרון כרומופור, בחלק ההיקפי שלה, בעזרת מרית. יש הרקמה הצבעונית בצורה נכונה בצבע ירקרק הומוגני. חכה 3 דקות לפני תחילת שלב 5.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את האנדותל התורם על החלק הקדמי של busin-המזרק, התגלגל. </li></ol> 6. הכנסת האנדותל התורם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתפוס ולהכניס את האנדותל התורם המקופל באמצעות מלקחיים קואקסיאליים atraumatic לlenticule אנדותל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מתחזק הלשכה הקדמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתפור את החתך בקרנית וניקור (שבוצע בשלב 3.1) עם סטיץ יחיד ניילון 10.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק בועת אוויר להתפתח הרקמות התורמות וללחוץ עליו מפני קרנית הנמען. בועת האוויר חייבת completely למלא את חלל הלשכה הקדמי. </li></ol> 7. ריתוך לייזר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את lenticule התורם במרכז של קרנית הנמען, מתוך עם וו או הזזת אוויר בועות מהחלק החיצוני של הקרנית עם מרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש לייזר דיודה ב810 ננומטר, מצוידים בסיבים אופטיים סטרילי 300 מיקרומטר קוטר ליבה, עם 0.22 כצמצם מספרי (NA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את קצה הסיב מחוץ לגלגל העין, ולספק את אור הלייזר לכיוון האנדותל המוכתם, דרך רקמת קרנית השקופה. טיפ הסיבים הוא בתצורה ללא מגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בהגדרות הבאות ללייזר: מצב פליטת נקודה אחת, 70-80 משך דופק msec, 35-40 mJ לכל דופק. הוא Ne-מכוון את האלומה על. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספק מקומות בודדים לייזר בפריפריה המוכתמת של האנדותל התורם. לספק הנקודות ברצף: ההיבט האחרון הוא טבעת של כתמים בפריפריה של lenticule התורם. המרחק בין שתי adjaמרכז כתמי אחוזים הוא הכפול של קוטר נקודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל עדשות מגע בעיני המטופל, יחד עם tobramycin 0.3% ו -0.1% השעיה עיני dexamethasone. </li></ol>

<ol>
	<li>Tan, D. T., Dart, J. K., Holland, E. J., Kinoshita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+transplantation.">Corneal transplantation.</a> Lancet. 379 (9827), 1749-1761 (2012).</li><li>El Husseiny, M. A., Manero, F., Gris, O., Elies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Historical+Review+and+Update+of+Surgical+Treatment+for+Corneal+Endothelial+Diseases.">Historical Review and Update of Surgical Treatment for Corneal Endothelial Diseases.</a> Ophthalmol Ther. , (2014).</li><li>Rossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+tissue+welding+in+ophthalmic+surgery.">Laser tissue welding in ophthalmic surgery.</a> J Biophotonics. 1 (4), 331-342 (2008).</li><li>Pini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+femtosecond+laser+ablation+and+diode+laser+welding+in+lamellar+and+endothelial+corneal+transplants.">Combining femtosecond laser ablation and diode laser welding in lamellar and endothelial corneal transplants.</a> Proc. SPIE Ophthalmic Technologies XVIII. 6 (844), 684411-1-684411-7 (2008).</li><li>Rossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-laser'+endothelial+corneal+transplant+in+human+patients.">All-laser' endothelial corneal transplant in human patients.</a> Proc. SPIE Ophthalmic Technologies XXII. 8209, 82091O-1-82091O-3 (2012).</li><li>Rossi, F., Pini, R., Menabuoni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+and+model+analysis+on+the+temperature+dynamics+during+diode+laser+welding+of+the+cornea.">Experimental and model analysis on the temperature dynamics during diode laser welding of the cornea.</a> J Biomed Opt. 12 (1), 014031-1-014031-7 (2007).</li><li>Menabuoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-assisted+corneal+welding+in+cataract+surgery:+retrospective+study.">Laser-assisted corneal welding in cataract surgery: retrospective study.</a> J Cataract Refract Surg. 33 (9), 1608-1612 (2007).</li><li>Buzzonetti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Welding+in+Penetrating+Keratoplasty+and+Cataract+Surgery+in+Pediatric+Patients.+Early+Results.">Laser Welding in Penetrating Keratoplasty and Cataract Surgery in Pediatric Patients. Early Results.</a> J Cataract Refract Surg. 39 (12), 1829-1834 (2013).</li><li>Menabuoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+'anvil'+profile+in+femtosecond+laser-assistedpenetrating+keratoplasty.">The 'anvil' profile in femtosecond laser-assistedpenetrating keratoplasty.</a> Acta Ophthalmol. 91 (6), e494-e495 (2013).</li><li>Canovetti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-assisted+penetrating+keratoplasty:+one+year&#8217;s+results+in+patients,+using+a+laser-welded+&#8220;anvil&#8221;-profiled+graft.">Laser-assisted penetrating keratoplasty: one year&#8217;s results in patients, using a laser-welded &#8220;anvil&#8221;-profiled graft.</a> Am J Ophthalmol. 158 (4), 664-670 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

ההשתלה &quot;כל הלייזר&quot; האנדותל היא גישה מקורית להשתלת קרנית פולשנית. כל ההליכים המתוארים בפרוטוקול בוצעו בחדר הניתוח, התבוננות ההליך היגייני ועיקור ששיטות נפוצות בניתוחים, כגון השימוש בכפפות מעוקרת, שמלה, מסכה וכובע. פתרון ICG הו...

בעבודה זו אנו מציגים גישה מקורית לkeratoplasty האנדותל, המבוסס על השימוש בליזר femtosecond להכין רקמות תורמות ודיודת לייזר אינפרא אדום ליד לרתך אותו על מיטת הנמען. מדידת Intraoperative של קרנית התורם יש צורך לתכנן בצורה נכונה את ממדי רקמות התורמות. keratoplasty האנדותל הוצע בשנים האחרונות להחליף keratoplasty החודר בטיפול במחלה 1,2 אנדותל. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא התאוששות מהירה יותר חזותית, ביחס לחדירת keratoplasty, הרדמה הופחתה במהלך ניתוח, ירידה בסיכון לדחיית שתל והשימור של שלמות עין. גורם הסיכון העיקרי הוא נקע lenticule התורם לאחר ניתוח. הטכניקה סטנדרטית מבוצעת על ידי החדרת האנדותל התורם בעמדתה הסופית שבו הוא מנוהל על-ידי ההזרקה של בועת אוויר: אין תפרים משמשים בגלל Chara המכני, biophysical והממדיםcteristics של האנדותל. יתר על כן, התאוששות חדות ראייה יכולה להיות מוגבלת בעיקר בגלל חוסר התאמה בין רקמות התורמות והמקבל בשל רקמה עבה המושתלת. כאן אנו מציגים הליך בביצוע keratoplasty האנדותל שיכול להתגבר על הבעיות עיקריות אלה. האנדותל התורם יכול להיות סמוך ובטוח בעמדתו הסופית שלה על ידי השימוש בטכניקת ריתוך לייזר. זהו תהליך photothermal מבוקר ומקומי: זה יכול להיגרם על ממשק תורם / נמען. זה כבר למד בעשר השנים האחרונות והציע לחדור keratoplasty ובהשתלה של האנדותל 3-5. אור אינפרא אדום (אורך הגל: 810 ננומטר) ליד הנפלט על ידי לייזר דיודה החשמל נמוך מועבר לרקמות הביולוגיות באתר הפצע. הקרנית היא באופן טבעי שקופה לגל זה: כדי להפוך את הרקמה זו לקלוט את אור הלייזר, יש צורך להכתימה בchromophore. הצבע המוצע הוא רווי סטריליפתרון מים ד של Indocyanine ירוק (ICG). אנחנו הוכחנו שכאשר רקמת קרנית מוכתמת כראוי עם הכנת ICG זה, זה מראה שיא ספיגה ב810 6 ננומטר. יתר על כן, ICG נעשה שימוש נרחב באבחון קליני והבטיחות שלה כבר הוכחה בבני אדם. הקרנית המוכתמת סופגת את אנרגיית אור לייזר דיודה והאפקט שנוצר העיקרי הוא עליית טמפרטורה מבוקרת באתר הריתוך. אין תופעות תרמיות מושרה ברקמות בלא כתם. שיפור הטמפרטורה גורם denaturation תרמית הפיך בקולגן סטרומה, עם closuring מיידי של קירות הפצע בקירור. השפעת ריתוך לייזר זה הודגמה קודם בניתוח קטרקט 7,8 וחודר 9,10 keratoplasty. גישה מותאמת שאנו מציגים במאמר זה נחקרה ליישום בkeratoplasty האנדותל. בניתוח המוצע כתמים בודדים לייזר ar, (עשרות מתמשכים של אלפיות שני)דואר נמסר לרקמות, וכתוצאה מכך השפעת photothermal המקומית בתוך ממד המקום (כמה מאות מיקרומטר בקוטר): ההשפעה המושרית היא ריתוך לייזר קשה, בהיקף של photocoagulation של קולגן המוגבל בממשק תורם / מארח. התוצאה של denaturation קולגן באתר מרותך היא הדבקה חזקה בין הרקמות התורמות ומארח, ובכך לספק אפקט תפירה שאי אפשר להשיג עם טכניקה סטנדרטית (תפרים). הרקמה חוזר המראה הטבעי שלו ב( חודש 1) קצר מעקב וההדבקה בין רקמות תורמות / מארח הוא השתפרה על ידי הריתוך ניתן בשלב מוקדם מאוד של שלב הריפוי. כדי להימנע מהסיכון האחר העיקרי של keratoplasty האנדותל, כלומר ההשתלה של רקמות תורמות עבות, טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית intrasurgical (אוקטובר) משמשת: מכשיר מסחרי מודד את העובי של קרנית תורם, כך שפרופיל חתך נכון יכול להיות מתוכנן עםלייזר femtosec. נראה ההשתלה המוצעת &quot;כל הלייזר&quot; אנדותל כך לשפר את התוצאות הקליניות של ניתוח זעיר-פולשנית זה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Indocyanine Green</td>
			<td>Pulsion Medical Systems, Germany</td>
			<td>ICG-PULSION (http://www.pulsion.com/international-english/perfusion/icg-pulsion/)</td>
			<td>Alternative product: IC-GREEN, Akorn&#160; Inc., Lake Forest, Illinois- US (http://www.icginjection.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtosecond Laser&#160;</td>
			<td>Abbott Medical Optics,&#160; Abbott Laboratories Inc. Abbott Park, Illinois, USA</td>
			<td>iFS150 (http://www.abbottmedicaloptics.com/products/refractive/ilasik/ifs-advanced-femtosecond-laser)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Coherence Tomography (OCT)</td>
			<td>Carl-Zeiss Meditec, Dublin, California- US (http://www.zeiss.com/meditec/en_de/home.html)</td>
			<td>Visante</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diode Laser</td>
			<td>E.l.En. Group s.pa., Calenzano-FI, Italy (http://www.elengroup.com/en/divisions/medical)</td>
			<td>Mod. WELD 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial Anterior Chamber</td>
			<td>CORONET, corneal graft products. Network Medical Products Ltd. Coronet House, Kearsley Road, Ripon, North Yorkshire, HG4 2SG, UK</td>
			<td>&#160;Artificial Anterior Chamber (A.A.C.) with large and small tissue-retaining heads. Code 51-935 (http://www.networkmedical.co.uk/ophthalmic_artificial_anterior_chamber.html)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution for tissue preservation and nutrition&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;AL.CHI.MI.A. Srl, Viale Austria 14, 35020 - Ponte S. Nicol&#242; - PD 
			&#160;ITALY</td>
			<td>Carry-C media for corneal deturgescence and transport at room temperature - 12 x 50 ml (http://www.alchimiasrl.com/en/organ-culture-at-31&#176;-c-eb/carry-c-eb)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an &#8220;all-laser&#8221; endothelial transplant

The &#8220;all laser&#8221; assisted endothelial keratoplasty is a procedure that is performed with a femtosecond laser used to cut the donor tissue at an intended depth, and a near infrared diode laser to weld the corneal tissue. The proposed technique enables to reach the three main goals in endothelial keratoplasty: a precise control in the thickness of the donor tissue; its easy insertion in the recipient bed and a reduced risk of donor lenticule dislocation. The donor cornea thickness is measured in the surgery room with optical coherence tomography (OCT), in order to correctly design the donor tissue dimensions. A femtosecond laser is used to cut the donor cornea. The recipient eye is prepared by manual stripping of the descemetic membrane. The donor endothelium is inserted into a Busin-injector, the peripheral inner side is stained with a proper chromophore (a water solution of Indocyanine Green) and then it is pulled in the anterior chamber. The transplanted tissue is placed in the final and correct location and then diode laser welding is induced from outside the eyeball. The procedure has been performed on more than 15 patients evidencing an improvement in surgery performances, with a good recovery of visual acuity and a reduced donor lenticule dislocation event.

ההליך כירורגי &quot;כל הלייזר&quot; מוצע לבצע השתלת קרנית פולשנית. ההליך הוא קל לביצוע (ראה איור 1): ביחס להשתלת אנדותל סטנדרטית רק הצעדים של מדידת העובי קרני, מכתים את הרקמות התורמות ומתן אור הלייזר מתווספים. היתרונות שהושגו במידה רבה לפצות זמן כירורגית מוגבר של כ...

Watch this Scientific Journal Video about An â€œAll-laserâ€ Endothelial Transplant at JoVE.com

An &amp;#8220;All-laser&amp;#8221; Endothelial Transplant

An all laser procedure is proposed in the endothelial transplant. The surgical technique is based on the use of a femtosecond laser to prepare the donor tissue. Laser welding technique is then used to secure the donor endothelium in the correct position.

השתלות &quot;All-הלייזר&quot; האנדותל

The &#8220;all laser&#8221; assisted endothelial keratoplasty is a procedure that is performed with a femtosecond laser used to cut the donor tissue at an ...

Research

JoVE Journal

Medicine

An &#8220;All-laser&#8221; Endothelial Transplant

9.3K Views.  Italian National Research Council. An all laser procedure is proposed in the endothelial transplant. The surgical technique is based on the use of a femtosecond laser to prepare the donor tissue. Laser welding technique is then used to secure the donor endothelium in the correct position.

Video: An &#8220;All-laser&#8221; Endothelial Transplant

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules that regulate HSCs. In these transplant model systems, the function of HSCs is determined by the ability of these cells to engraft and reconstitute lethally irradiated recipient mice. Commonly, the donor cell contribution/engraftment is measured by antibodies to donor- specific cell surface proteins using flow cytometry. However, this method heavily depends on the specificity and the ability of the cell surface marker to differentiate donor-derived cells from recipient-originated cells, which may not be available for all mouse strains. Considering the various backgrounds of genetically modified mouse strains in the market, this cell surface/ flow cytometry-based method has significant limitations especially in mouse strains that lack well-defined surface markers to separate donor cells from congenic recipient cells. Here, we reported a PCR-based technique to determine donor cell engraftment/contribution in transplant recipient mice. We transplanted male donor bone marrow HSCs to lethally irradiated congenic female mice. Peripheral blood samples were collected at different time points post transplantation. Bone marrow samples were obtained at the end of the experiments. Genomic DNA was isolated and the Y chromosome specific gene, Zfy1, was amplified using quantitative Real time PCR. The engraftment of male donor-derived cells in the female recipient mice was calculated against standard curve with known percentage of male vs. female DNAs. Bcl2 was used as a reference gene to normalize the total DNA amount. Our data suggested that this approach reliably determines donor cell engraftment and provides a useful, yet simple method in measuring hematopoietic cell reconstitution in murine bone marrow transplantation models. Our method can be routinely performed in most laboratories because no costly equipment such as flow cytometry is required.

Determining donor cell engraftment presents a challenge in mouse bone marrow transplant models that lack well-defined phenotypical markers. We described a methodology to quantify male donor cell engraftment in female transplant recipient mice. This method can be used in all mouse strains for the study of HSC functions.

באמצעות PCR כמוני בזמן אמת לקביעת engraftment תא התורם במודל תחרותי Murine מח עצם השתלה

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Murine Heterotopic Heart Transplant Technique

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become proficient in and utilize this technique, it is now widely used by many laboratories around the world. A significant refinement to the original technique was developed and reported in 2001 by Niimi. Described here are the techniques that have evolved over more than a decade in the hands of three surgeons (Plenter, Grazia, Pietra) in our center. These techniques are now being passed on to a younger generation of surgeons and researchers.
Based largely on the Niimi experience, the procedures used have evolved in the fine details - details which we will endeavor to relate here in such a way that others may be able to use this very useful model. Like Niimi, we have found that a video aid to learning is a priceless resource for the beginner.

The manuscript describes the steps required to perform the heterotopic heart transplant in the mouse.

טכניקת השתלות Murine Heterotopic לב

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become ...

Technique of Porcine Liver Procurement and Orthotopic Transplantation using an Active Porto-Caval Shunt

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. Each year, a considerable number of patients on the liver transplantation waiting list die without receiving an organ transplant or are delisted due to disease progression. Even after a successful transplantation, rejection and side effects of immunosuppression remain major concerns for graft survival and patient morbidity. 
Experimental animal research has been essential to the success of liver transplantation and still plays a pivotal role in the development of clinical transplantation practice. In particular, the porcine orthotopic liver transplantation model (OLTx) is optimal for clinically oriented research for its close resemblance to human size, anatomy, and physiology. 
Decompression of intestinal congestion during the anhepatic phase of porcine OLTx is important to guarantee reliable animal survival. The use of an active porto-caval-jugular shunt achieves excellent intestinal decompression. The system can be used for short-term as well as long-term survival experiments. The following protocol contains all technical information for a stable and reproducible liver transplantation model in pigs including post-operative animal care.

Experimental animal research plays a pivotal role in the development of clinical transplantation practice. The porcine orthotopic liver transplantation model (OLTx) closely resembles human conditions and is frequently used in clinically oriented research. The following protocol contains all information for a reliable porcine OLTx model using an active porto-caval-jugular shunt.

טכניקה של רכש כבד בשר חזירים והשתלות Orthotopic באמצעות פורטו-caval אנט פעיל

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. Each year, a considerable number of patients on the liver transplantation ...

Mouse Model of Alloimmune-induced Vascular Rejection and Transplant Arteriosclerosis

Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune system of the recipient causes damage of the arterial wall and dysfunction of endothelial cells and smooth muscle cells. This triggers a pathological repair response that is characterized by intimal thickening and luminal occlusion. Understanding the mechanisms by which the immune system causes vasculature rejection and TA may inform the development of novel ways to manage graft failure. Here, we describe a mouse aortic interposition model that can be used to study the pathogenic mechanisms of vascular rejection and TA. The model involves grafting of an aortic segment from a donor animal into an allogeneic recipient. Rejection of the artery segment involves alloimmune reactions and results in arterial changes that resemble vascular rejection. The basic technical approach we describe can be used with different mouse strains and targeted interventions to answer specific questions related to vascular rejection and TA.

We describe a protocol for aortic interposition grafting in mice. The goal of the protocol is to provide a model with which to study pathological processes and therapeutic strategies relevant to alloimmune reactions in arteries and the resultant arterial changes that contribute to organ transplant failure.

עכבר דגם של דחיית כלי דם הנוצרת על-Alloimmune וטרשת עורקים להשתלות

Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune ...

Murine Kidney Transplant Technique

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become proficient in and utilize this technique, it is now widely used by many laboratories around the world. A significant refinement to the original technique using the donor aorta to form the arterial anastomosis instead of the renal artery was developed and reported in 1993 by Kalina and Mottram 2 with a further advancement coming from the same laboratory in 1999 3. While one can become proficient in this model, a search of the literature reveals that many labs still experience a high proportion of graft loss due to arterial thrombosis. We describe here a technique that was devised in our laboratory that vastly reduces the arterial thrombus reported by others 4,5. This is achieved by forming a heel-and-toe cuff of the donor infra-renal aorta that facilitates a larger anastomosis and straighter blood flow into the kidney.

The goal of this manuscript is to describe the steps required to perform a kidney transplant in a mouse, paying particular attention to the details of the arterial anastomosis.

טכניקת השתלת כליה בעכברים

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

שיפור שיטה להקמת במבחנה מחסום הדם - מוח מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Optimized Griess Reaction for UV-Vis and Naked-eye Determination of Anti-malarial Primaquine

Primaquine (PMQ), an important anti-malarial drug, has been recommended by the World Health Organization (WHO) for the treatment of life-threatening infections caused by P. vivax and ovale. However, PMQ has unwanted adverse effects that lead&#160;to acute hemolysis in patients with glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) deficiency. There is a need to develop simple and reliable methods for PMQ determination with the purpose of dosage monitoring. In early 2019, we have reported an UV-Vis and naked-eye based approach for PMQ colorimetric quantification. The detection was based on a Griess-like reaction between PMQ and anilines, which can generate colored azo products. The detection limit for direct measurement of PMQ in synthetic urine is in the nanomolar range. Moreover, this method has shown great potential for PMQ quantification from human serum samples at clinically relevant concentrations. In this protocol, we will describe the technical details regarding the syntheses and characterization of colored azo products, the reagent preparation, and the procedures for PMQ determination.

This protocol describes a novel colorimetric method for antimalarial primaquine (PMQ) detection in synthetic urines and human serums.

התגובה האופטימיזציה של Griess עבור UV-Vis ו-עירום עין ההגדרה של אנטי מלאביאל Primaquine

Primaquine (PMQ), an important anti-malarial drug, has been recommended by the World Health Organization (WHO) for the treatment of life-threatening ...

Organ Ischemia-Reperfusion Injury by Simulating Hemodynamic Changes in Rat Liver Transplant Model

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats is a tried and proven animal model used for preoperative, intraoperative, and postoperative studies, including ischemia-reperfusion injury (IRI) of extrahepatic organs. This model requires numerous experiments and devices. The duration of anhepatic phase is closely related to the time to develop IRI after transplantation. In this experiment, we used hemodynamic changes to induce extrahepatic organ damage in rats and determined the maximum tolerance time. The time until the most severe organ injury varied for different organs. This method can easily be replicated and can also be used to study IRI of the extrahepatic organs after liver transplantation.

This paper provides a detailed description of how to build an animal model of the anhepatic phase (liver ischemia) in rats to facilitate basic research into ischemia-reperfusion injury after liver transplantation.

פגיעה באיבר איסכמיה-רפרופוזיה על ידי הדמיית שינויים המודינמיים במודל השתלת כבד עכברוש

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats is a tried and proven animal model used for preoperative, intraoperative, and postoperative studies, ...

TBase - an Integrated Electronic Health Record and Research Database for Kidney Transplant Recipients

TBase is an electronic health record (EHR) for kidney transplant recipients (KTR) combining automated data entry of key clinical data (e.g., laboratory values, medical reports, radiology and pathology data) via standardized interfaces with manual data entry during routine treatment (e.g., clinical notes, medication list, and transplantation data). By this means, a comprehensive database for KTR is created with benefits for routine clinical care and research. It enables both easy everyday clinical use and quick access for research questions with highest data quality. This is achieved by the concept of data validation in clinical routine in which clinical users and patients have to rely on correct data for treatment and medication plans and thereby validate and correct the clinical data in their daily practice. This EHR is tailored for the needs of transplant outpatient care and proved its clinical utility for more than 20 years at Charit&#233; - Universit&#228;tsmedizin Berlin. It facilitates efficient routine work with well-structured, comprehensive long-term data and allows their easy use for clinical research. To this point, its functionality covers automated transmission of routine data via standardized interfaces from different hospital information systems, availability of transplant-specific data, a medication list with an integrated check for drug-drug interactions, and semi-automated generation of medical reports among others. Key elements of the latest reengineering are a robust privacy-by-design concept, modularity, and hence portability into other clinical contexts as well as usability and platform independence enabled by HTML5 (Hypertext Markup Language) based responsive web design. This allows fast and easy scalability into other disease areas and other university hospitals. The comprehensive long-term datasets are the basis for the investigation of Machine Learning algorithms, and the modular structure allows to rapidly implement these into clinical care. Patient reported data and telemedicine services are integrated into TBase in order to meet future needs of the patients. These novel features aim to improve clinical care as well as to create new research options and therapeutic interventions.

TBase combines an electronic health record with an innovative research database for kidney transplant recipients. TBase is built upon an in-memory database platform, connected to different hospital systems, and used for regular outpatient care. It automatically integrates all relevant clinical data including transplantation-specific data creating a unique research database.

TBase - מאגר מידע משולב על בריאות אלקטרונית ומחקר עבור מושתלי כליה

TBase is an electronic health record (EHR) for kidney transplant recipients (KTR) combining automated data entry of key clinical data (e.g., laboratory ...

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and subsequent vision loss. The inner blood-retinal barrier (iBRB) is mainly composed of retinal vascular endothelium with low permeability under physiological conditions. This feature of low permeability is tightly regulated and maintained by low rates of paracellular transport between adjacent retinal microvascular endothelial cells, as well as transcellular transport (transcytosis) through them. The assessment of retinal transcellular barrier permeability may provide fundamental insights into iBRB integrity in health and disease. In this study, we describe an endothelial cell (EC) transcytosis assay, as an in vitro model for evaluating iBRB permeability, using human retinal microvascular endothelial cells (HRMECs). This assay assesses the ability of HRMECs to transport transferrin and horseradish peroxidase (HRP) in receptor- and caveolae-mediated transcellular transport processes, respectively. Fully confluent HRMECs cultured on porous membrane were incubated with fluorescent-tagged transferrin (clathrin-dependent transcytosis) or HRP (caveolae-mediated transcytosis) to measure the levels of transferrin or HRP transferred to the bottom chamber, indicative of transcytosis levels across the EC monolayer. Wnt signaling, a known pathway regulating iBRB, was modulated to demonstrate the caveolae-mediated HRP-based transcytosis assay method. The EC transcytosis assay described here may provide a useful tool for investigating the molecular regulators of EC permeability and iBRB integrity in vascular pathologies and for screening drug delivery systems.

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

This protocol illustrates an in vitro endothelial cell transcytosis assay as a model to evaluate inner blood-retinal barrier permeability by measuring the ability of human retinal microvascular endothelial cells to transport horseradish peroxidase across cells in caveolae-mediated transcellular transport processes.

בדיקת טרנסציטוזה של תאי אנדותל כמודל In vitro להערכת חדירות מחסום הרשתית הפנימית בדם

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...