The authors have no acknowledgements.

1. Polyurethan (PU) Sponge Vorbereitung als Template <ol><li> Verwenden PU Schwämme an Hydroxyapatit-Vorlagen enthält miteinander verbundenen Poren zu erzeugen. Verwenden jedes Schwamm, um den primären Trabekel zur Bildung der Schablonen Streben sowie die Bildung von Mikrokanälen innerhalb der Knochenbälkchen bereitzustellen. </li><li> Schneiden und trimmen 80 ppi (Poren pro Zoll) Schwämme in 2 Brücke-Formen mit Abmessungen von 3,5 cm Höhe x 5 cm Länge x 1,5 cm in der Breite. Anmerkung: Die Abmessungen und Formen können ausgewählt werden entsprechend der gewünschten Primärporengröße: 100 ppi, 80 ppi und 60 ppi. </li><li> Stellen je 100 ml von 4% (w / v) NaOH-Lösung unter Verwendung eines 150-ml-Becher; dann eintauchen und drücken, bis die hergestellten Schwämme sind völlig durchnässt. </li><li> Nach dem Einweichen wird das Becherglas mit den Schwämmen in der Ultraschallgerät (42 kHz). </li><li> Ultraschall Vorbehandlung der PU-Schwämme für 15-20 min ohne Wärme, um die Oberflächeneigenschaften zu modifizieren. </li><li> Spülen Sie mit destilliertemWasser für 5-10 Minuten. Beim Waschvorgang ist, drücken Sie die Schwämme und es ihnen ermöglichen, 5-7 mal, um entfernen Sie die restliche NaOH innerhalb der Schwämme zu erweitern. </li><li> Drücken Sie die Schwämme mit Papiertüchern, um überschüssiges Wasser zu entfernen; dann trocknen Sie sie in einem Ofen bei 60-80 ° C. </li></ol> 2. Hydroxylapatit (HA) Gülle Vorbereitung zur Beschichtung <ol><li> Bevor die HA-Aufschlämmung, zu messen das Gewicht einer Becherglas mit einem magnetischen Rührstab. Dieser Wert wird verwendet, um das Pulver / Flüssigkeitsverhältnis zu berechnen. </li><li> Messen Sie 10 g der Nano-Größe HA Pulver. </li><li> In 20 ml destilliertem Wasser in die 50-ml-Becher. Wärme für 120 bis 140 ° C und umrühren unter Verwendung einer Heizplatte Magnetrührer. </li><li> Zugabe von 0,3 g (3% w / w) Polyvinylalkohol (PVA) (89,000-98,000 MW) pro Pulver in destilliertem Wasser unter Rühren bei 300-400 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Gerührt, bis die PVA vollständig gelöst ist. Die Lösung sollte klar nach der vollständigen Auflösung des PVA ist. </li><li> Drehen Sie off der Flamme und 0,1 g (1% w / w) Natrium-Carboxymethylcellulose (CMC) (ultra-low viscosity) für Pulver unter Rühren bei 400-500 Umdrehungen pro Minute. Die Lösung sollte klar nach der vollständigen Auflösung des PVA ist. </li><li> Rühren, bis die CMC vollständig gelöst und Abkühlen auf Raumtemperatur. </li><li> Zugabe von 0,3 g (3% w / w) von Ammonium-Dispergiermittel pro Pulver unter Rühren bei 300-400 Umdrehungen pro Minute. Rühren bis zur vollständigen Auflösung. </li><li> Werden 0,2 g (2% w / w) Glycerin pro Pulver unter Rühren bei 300-400 Umdrehungen pro Minute. Rühren bis zur vollständigen Auflösung. </li><li> Langsam verteilen das HA-Pulver in die Lösung unter Rühren bei 600 bis 900 Umdrehungen pro Minute und halten Rühren für 5 min. </li><li> Ultraschallbehandlung für 5 Minuten mit einem Ultraschallgerät, um die Dispersion jeder Agglomeration des HA-Pulver zu gewährleisten. </li><li> Mit einem zusätzlichen 5 ml destilliertes Wasser in das Gemisch unter Rühren bei 600-900 Umdrehungen pro Minute und Wärme bei 90-100 ° C. </li><li> Rühren der Mischung unter Verwendung eines magnetischen Rührers mit 600-800 rpm bei 90-100 ° C in order, um den Wassergehalt zu verdampfen. </li><li> Messen die gesamte Gewicht mit dem Becher und Mischung von Zeit zu Zeit, bis ein Pulver / Flüssigkeits-Verhältnis von 1,75 bis 1,8 erhalten wird. </li><li> Formatieren der Pulver / Flüssigkeits-Verhältnis, teilen das Gewicht des Pulvers durch das Gesamtgewicht der Mischung (2,14), einschließlich des Pulvers, Reagenzien und Wasser, minus dem Gewicht des Bechers und Rührer (2,1) und abzüglich des HA-Pulver (2.2). Hinweis: Zum Beispiel: Wenn A (gesamte Mischung, Pulver, Reagenzien und Wasser) ist 49,05 g, B (Becherglas mit Rührer) beträgt 33,5 g, und dann C (HA Pulver) ist 10 g. C / (ABC) = 10 / (49.05-33.5-10) = 1,80 </li><li> Lassen Sie den Brei auf RT vor der Verwendung für die Beschichtung abzukühlen. </li></ol> 3. HA-Beschichtung, Trocknen und Sintern <ol><li> Bestreichen Sie die vorbereiteten PUR-Schwämme mit dem HA Lack-Slurry mit einem rostfreien Spachtel, bis die Aufschlämmung homogen in der gesamten PU-Schwamm auf eine Glasplatte verteilt sind. Hinweis: Nach dem Entfernen der überschüssigen Bindebogenry, einige der Poren können weiterhin mit der Aufschlämmung wegen der hohen Viskosität der Aufschlämmung zusetzen. </li><li> Um Interkonnektivität, der Homogenität und offenen Poren zu gewährleisten, leicht wehen die HA beschichtet Vorlagen mit einem Luftkompressor. Dieser Prozess stellt sicher, dass die Vorlagen homogen beidem beschichtet auf der Innen- und Außenflächen des PU-Schwamm. Hinweis: Wenn eine homogene Beschichtung nicht erreicht wird, werden die HA beschichtet Vorlagen während des Sintervorgangs zusammenbrechen und kann auch knacken, während Handhabung durch geringe mechanische Festigkeit. Zusätzlich wird die homogene Beschichtung kritischer schaffen Mikrokanäle innerhalb der Knochenbälkchen. </li><li> Trocknen die HA beschichtet Vorlagen für mindestens 5 Stunden unter Kühlbedingungen (20-25 ° C) unter leichtem Luftzirkulation. Erstrecken sich jedoch die Trockenzeit auf der Grundlage der Größe der Vorlage. Anmerkung: Nach dem Trocknen werden die beschichteten HA Vorlagen in der Regel in jeder Dimension schrumpfen etwa 8% bis 10%. </li><li> Nach der Trocknung, legen Sie die HAbeschichteten Vorlagen auf einen Aluminiumoxid-Tiegel. Dann legen Sie sie in einem Hochtemperaturofen und verwenden Sie die folgenden 8 Schritt Sintern Profil. <ol><li> Wärme 2 ° C / min bis 230 ° C. </li><li> Wärme 1 ° C / min bis 280 ° C. </li><li> Erhitzen von 0,5 ° C / min bis 400 ° C. </li><li> Wärme 3 ° C / min bis 600 ° C. Halten bei 600ºC für 1 Stunde. </li><li> Wärme 5 ° C / min bis 1230 ° C. Halten 1.230 ° C für 3 Std. </li><li> Kühlung bei 5 ° C / min auf RT. Hinweis: Das Sintern wird weiter schrumpfen die HA beschichteten Schwamm Vorlagen von ca. 22% - 25% in jeder Dimension. </li></ol></li></ol> 4. Ingress und inhabitancy von Zellen in Vorlage <ol><li> Kultur vorge osteoblastischen MC3T3-Zellen in einer nicht-osteogenen Medien, bestehend aus α-MEM, das mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Antibiotika (Streptomycin und Penicillin) ergänzt bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2 . </li><li> 10 mleiner Zellsuspension mit 2 x 10 6 Zelldichte in eine einzelne Vertiefung in einer Platte mit 6 Vertiefungen. </li><li> Platzieren Sie die 3 cm x 4 cm x 1 cm brückenförmigen Schablone vertikal in den 6-Well-Platte. Legen Sie eine Etappe der Vorlage in die Platte, die die Zellsuspension, und der andere Schenkel in einen benachbarten leeren Brunnen. </li><li> Lassen Sie die Schablone, um die Zellsuspension für 10 min absorbieren. </li><li> 5 ml Medium danach in der Vertiefung, die ursprünglich mit der Zellsuspension gefüllt war. </li><li> Auffüllung des Mediums in beiden Vertiefungen alle 2 oder 3 Tage bis 7 Tage vergangen sind. </li><li> Bestimmen Sie die Wirksamkeit der Zellmobilität durch Hämatoxylin und Eosin-Färbung 11. <ol><li> Befestigen Sie die Zellen und Gerüst von in 100% EtOH für 20-30 Minuten eingetaucht. </li><li> Fleck mit Hämatoxylin für 1-2 min. </li><li> Spülen Sie mit destilliertem Wasser für 1-2 min für zweimal. </li><li> Dehydratisierung durch Eintauchen in 70%, dann 95%, dann 100% EtOH für jeden 1-2 min. </li><li> Fleck mit Eosin für 20-30 sec. </li><li> Spülen Sie mit destilliertem Wasser für 12 min für zweimal. </li><li> Dehydratisierung durch Eintauchen in 70%, 80%, 90% und 100% EtOH für jeden 1-2 min. </li><li> Betten Sie das Gerüst in einem Acrylharz zum Schneiden und Imaging. </li></ol></li><li> Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen mit den 3- [4,5-Dimethylthiazol-2-yl] -2,5-Diphenyl tetrazoliumbromid (MTT) Zelllebensfähigkeitstest und Live / Dead-Assay (lebend / tot Zellfärbung Kit MPTP) zu den Zeitpunkten von Tag 3 und 7 11. Hinweis: Das Schema der knochenähnlichen Vorlage Herstellungsprotokolle werden in der &quot;Repräsentative Ergebnisse&quot; Sitzung vertreten. </li></ol>

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	<li>Petrie Aronin, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+effects+of+scaffold+pore+size,+pore+volume,+and+total+void+volume+on+cranial+bone+healing+patterns+using+microsphere-based+scaffolds.">Comparative effects of scaffold pore size, pore volume, and total void volume on cranial bone healing patterns using microsphere-based scaffolds.</a> J Biomed Mater Res A. 89 (3), 632-641 (2009).</li><li>Guzm&#225;n, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan+scaffolds+containing+calcium+phosphate+salts+and+rhBMP-2:+in+vitro+and+in+vivo+testing+for+bone+tissue+regeneration.">Chitosan scaffolds containing calcium phosphate salts and rhBMP-2: in vitro and in vivo testing for bone tissue regeneration.</a> PLoS One. 9 (2), e87149 (1371).</li><li>Cha, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinus+augmentation+using+BMP-2+in+a+bovine+hydroxyapatite/collagen+carrier+in+dogs.">Sinus augmentation using BMP-2 in a bovine hydroxyapatite/collagen carrier in dogs.</a> J Clin Periodontol. 41 (1), 86-93 (2014).</li><li>Karageorgiou, V., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porosity+of+3D+biomaterial+scaffolds+and+osteogenesis.">Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis.</a> Biomaterials. 26 (27), 5474-5491 (2005).</li><li>Fisher, M. B., Mauck, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+and+regenerative+medicine:+recent+innovations+and+the+transition+to+translation.">Tissue engineering and regenerative medicine: recent innovations and the transition to translation.</a> Tissue Eng Part B Rev. 19 (1), 1-13 (2013).</li><li>Manassero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+in+Sheep+Using+Acropora+Coral,+a+Natural+Resorbable+Scaffold,+and+Autologous+Mesenchymal+Stem+Cells.">Regeneration in Sheep Using Acropora Coral, a Natural Resorbable Scaffold, and Autologous Mesenchymal Stem Cells.</a> Tissue Eng Part A. 19 (13-14), 1554-1563 (2013).</li><li>Reichert, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tissue+engineering+solution+for+segmental+defect+regeneration+in+load-bearing+long+bones.">A tissue engineering solution for segmental defect regeneration in load-bearing long bones.</a> Sci Transl Med. 4 (141), 141ra93 (2012).</li><li>Sachlos, E., Czernuszka, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+Tissue+Engineering+Scaffolds+Work.+Review+on+The+Application+of+Solid+Freeform+Fabrication+Technology+to+The+Production+of+Tissue+Engineering+Scaffolds.">Making Tissue Engineering Scaffolds Work. Review on The Application of Solid Freeform Fabrication Technology to The Production of Tissue Engineering Scaffolds.</a> Eur Cell Mater. 5, 29-40 (2003).</li><li>Woodard, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+properties+and+osteoconductivity+of+hydroxyapatite+bone+scaffolds+with+multi-scale+porosity.">The mechanical properties and osteoconductivity of hydroxyapatite bone scaffolds with multi-scale porosity.</a> Biomaterials. 28 (1), 45-54 (2007).</li><li>Correia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Acta Biomater. 8 (7), 2483-2492 (2012).</li><li>Wang, H., Li, Y., Zuo, Y., Li, J., Ma, S., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatibility+and+osteogenesis+of+biomimetic+nano-hydroxyapatite/polyamide+composite+scaffolds+for+bone+tissue+engineering.">Biocompatibility and osteogenesis of biomimetic nano-hydroxyapatite/polyamide composite scaffolds for bone tissue engineering.</a> Biomaterials. 28 (22), 3338-3348 (2007).</li><li>Oh, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+absorption+and+retention+properties+of+engineered+scaffolds+with+micro-channels+and+nano-pores+for+tissue+engineering:+a+proof+of+concept.">Bone marrow absorption and retention properties of engineered scaffolds with micro-channels and nano-pores for tissue engineering: a proof of concept.</a> Ceram Int. 39 (7), 8401-8410 (2013).</li><li>Hong, M. H., Kim, Y. H., Ganbat, D., Kim, D. G., Bae, C. S., Oh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+action:+enrichment+of+retention+and+habitation+of+cells+via+micro-channeled+scaffolds+for+massive+bone+defect+regeneration.J.">Capillary action: enrichment of retention and habitation of cells via micro-channeled scaffolds for massive bone defect regeneration.J.</a> Mater Sci Mater Med. 25 (8), 1991-2001 (2014).</li><li>Volkmer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+in+static+and+dynamic+3D+culture+systems+for+tissue+engineering+of+bone.">Hypoxia in static and dynamic 3D culture systems for tissue engineering of bone.</a> Tissue Eng. Part A. 14 (8), 1331-1340 (2008).</li><li>Malda, J., Klein, T. J., Upton, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+hypoxia+in+the+in+vitro+engineering+of+tissues.">The roles of hypoxia in the in vitro engineering of tissues.</a> Tissue Eng. 13 (9), 2153-2162 (2007).</li><li>Macchetta, A., Turner, I. G., Bowen, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+HA/TCP+scaffolds+with+a+graded+and+porous+structure+using+a+camphene-based+freeze-casting+method.">Fabrication of HA/TCP scaffolds with a graded and porous structure using a camphene-based freeze-casting method.</a> Acta Biomater. 5 (4), 1319-1327 (2009).</li><li>Cox, S. C., Thornby, J. A., Gibbons, G. J., Williams, M. A., Mallick, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+porous+hydroxyapatite+scaffolds+intended+for+use+in+bone+tissue+engineering+applications.">3D printing of porous hydroxyapatite scaffolds intended for use in bone tissue engineering applications.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 47, 237-247 (2015).</li><li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+and+proliferation+of+OCT-1+osteoblast-like+cells+on+micro-+and+nano-scale+topography+structured+poly(l-lactide).">Adhesion and proliferation of OCT-1 osteoblast-like cells on micro- and nano-scale topography structured poly(l-lactide).</a> Biomaterials. 26 (21), 4453-4459 (2005).</li><li>Zhao, L., Mei, S., Chu, P. K., Zhang, Y., Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+hierarchical+hybrid+micro/nano-textured+titanium+surface+with+titania+nanotubes+on+osteoblast+functions.">The influence of hierarchical hybrid micro/nano-textured titanium surface with titania nanotubes on osteoblast functions.</a> Biomaterials. 31 (19), 5072-5082 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Ein Mehrkomponenten-Vorlage einschließlich Zellen, Wachstumsfaktoren, Nährstoffe usw. ist für eine erfolgreiche Knochenregeneration und funktionelle Wiederherstellung der kritischen große große Knochendefekte erforderlich ist. Innerhalb dieser Faktoren sind anatomisch konforme biologischen Eigenschaften von wesentlicher Bedeutung. Um biologische Funktionen zu erreichen, muß die Schablone Biokompatibilität Osteokonduktivität mechanischer Integrität, ausreichende Oberfläche ausreichende Oberflächenbeschaffenheit, und die Mittel für die Sauerstoff- und Nährstofftransport aufweist. Auf zellulärer Ebene, sind die folgenden Merkmale besonders wichtig für die funktionelle Wiederherstellung der massiven Knochendefekten: erleichtert das Eindringen in Vorlage (aktiv Rekrutierung), eine gleichmäßige Verteilung in der gesamten Vorlage (Retention), beschleunigte Verbreitung und hohe Rentabilität (Wohnraum). Schließlich wird die nachfolgende Bildung von wesentlichen extrazellulären Matrix und dem Auslösen der Genexpression sind entscheidend wichtiger biologischer Prozesse wie rasche Vaskularisierung and Osteogenese. Viele verschiedene Arten von synthetischen Ersatzstoffen vorgeschlagen worden, um Auto- / Allo- Knochentransplantate zu ersetzen. Allerdings ist der Stromgerüst Organisation nicht aufweist einen internen Mikromikrokanäle und Nanoporen enthält, und somit nicht aktiv Zellinfiltration, Verteilung und inhabitance tief in die synthetische Ersatzstoffe, die größer als 10 mm sind, zu erleichtern. Sie bieten keine körperliche Signale für bahnbrechende Zellen, effizient, schnell und gleichmäßig tief wandern in den Knochen Vorlage. Stattdessen wird die begrenzte passive Rekrutierung von Zellen schafft eine ungleich verteilt Zellpopulationen zwischen den äußeren und inneren Bereiche des Gerüsts. Dies verstärkt nicht nur die erste Herausforderung der Zellen Erreichen der innere Kern der Vorlage, sondern behindert auch Nährflusses und Zell-Kommunikation mit dem anderen Ende des synthetischen Ersatz. Diese Art der unverhältnismäßigen Zellrekrutierung und Besiedlung Ergebnisse in der Zell death und unvollständige Knochenwachstum nach dem Gerüst in die Körper 14,15 implantiert. So haben wir das Konzept der Kapillarwirkung als primäre physikalische Cue, um diese Hindernisse zu adressieren eingeführt. Wir haben sorgfältig konstruierte Mikrokanäle in der BMT, um die Kapillarwirkung, die für die primäre Schleppkraft zuständig für aktiv rekrutieren Zellen tief in die BMT-Konto wird induzieren. Die PU-Schwammbeschichtungstechnik stellt einige einzigartige Eigenschaften. Erstens erlaubt sie für eine einfache Herstellung von gut kontrollierten porösen trabekulären Strukturen, die sich auf den vordefinierten Matrizenstrukturen ab (dh 80 Poren pro Zoll Vorlage für 300-400 um). Dies ist für die Optimierung der Porengröße für Osteoblasten Infiltration 15 sehr wichtig. Zweitens ist die Technik ermöglicht den Aufbau von miteinander verbundenen Mikrokanälen, die für die bedeutende Rolle des Initialisierens Zelle Verlagerung 11 entfallen. Drittens gibt es fast keine Einschränkungen bei der Verwendung der PU-Schwamm in Bezug auf das Erstellen von benutzerdefinierten Formen und Größen von den Vorlagen. Der Hersteller kann eine Schere für einfache Formen oder sogar berechnete Laserschneiden für komplexe Geometrien zu verwenden. Mit diesen präzise gesteuerten Technologien, wir die BMT erstellt. HA wurde als Ausgangsmaterial aufgrund seiner Biokompatibilität und osteokonduktiv Kapazität 17 ausgewählt. In dieser Studie gab es einige kritische Schritte, die hervorgehoben werden müssen. Während der HA Brei Vorbereitung, wenn die Temperatur zu hoch ist und die Rührgeschwindigkeit zu niedrig ist, wird der HA Brei stecken bleiben am unteren Rand des Bechers und versiegen. Nach der Beschichtung, wenn Ausblasen der überschüssigen HA Brei, kann zu hohen Luftdruck Risse auf der Oberfläche der BMT zu induzieren. Es ist wichtig, um den Luftdruck relativ gering, um nur richtig lüften das überschüssige HA Brei zu halten. Schließlich werden die zweite und dritte Schritt des Sinterprozessessind entscheidendsten (Heat 1 ° C / min bis 280 ° C und Wärme 0,5 ° C / min bis 400 ° C). In diesem Temperaturbereich wird die PU-Schwamm komplett ausbrennen, während der HA dicht wird. Wenn dieses Protokoll nicht genau verfolgt, wird der BMT zusammengebrochen sind oder nach dem Sintern zerbröckelt werden. Die in dieser Studie beschriebenen BMT bietet mehrere Vorteile. Zunächst werden die miteinander verbundenen Makroporen (300-400 um) imitieren die der menschlichen trabekulären Knochen und ermöglicht eine reibungslose Knochenmark-Durchfluss. Zweitens werden die Vorlagen von Mikrokanälen (25-50 um) innerhalb jedes trabekulären Septum umfasst, um die anfängliche Eindringen von Knochenzellen durch Kapillarwirkung zu beschleunigen. Wie mit Computersimulation 13, wenn die Vorlage hatte nur 300 um Poren (Primärporen) und keine Mikrokanälen gezeigt, würde die Kapillarwirkung nicht ausreichen für die volle Sättigung der Vorlage mit dem Knochenmark. Dies würde insbesondere gelten für große Mängel, l erfordern würdearge Größe Vorlagen. Mikrometergroßen Kanälen weisen hochwirksame Flüssigkeitsaufnahme und damit erwarteten wir die Mikrokanäle in erster Linie für die Kapillarwirkung in unserer Studie verantwortlich. Drittens haben unsere BMTS strategisch platzierten Nanoporen. Daten aus der Literatur zeigen, dass Zellen, die besonders empfindlich auf Nanostrukturen 18,19; In diesem Fall müssten die Nanoporen auf den Wänden der Mikrokanäle, eine Rolle bei der Erhöhung der Zellanheftung zu spielen. Nanogroßen Poren (100-400 nm) auf der Oberfläche des trabekulären Septen erlaubt immobilisierten Zellen zu verankern. Insgesamt zeigen die kombinierte Wirkung dieser drei internen Strukturen zu einer verstärkten Zellmobilisierung und die Haftung in der gesamten Vorlage. Es gibt jedoch einige Einschränkungen des Protokolls und die entscheidenden Schritte, um die perfekte BMT herzustellen. Zum Beispiel gibt es oft eine große Menge von HA-Aufschlämmung aufgrund der Schwierigkeit, eine homogene Viskosität während der Beschichtung hergestellt. Auch gibt es eine Beschränkung bei der Herstellung vonVorlagen größer als 5 cm 3 des Volumens aufgrund der Arbeitszeit, während Beschichtung. Die Beschichtungsdicke ist entscheidend, die je nach Hersteller Techniken variiert. Die Befunde der vorliegenden Studie zeigen, dass die BMT absorbieren und zu halten Zellen potentielle Vorteile gegenüber herkömmlichen alloplastische (oder synthetische) Gerüste bieten. Eine prospektive Studie in Betracht gezogen wird, die Vorteile der BMT auf Osteogenese und / oder Angiogenese zusammen mit Knochen-Wachstumsfaktoren zu verifizieren. Daher behaupten wir, dass unsere einzigartigen Funktionsumfang BMT Gerüst können die wichtigsten Hindernisse unzureichender Knochenmarkinfiltration in die synthetischen Konstrukte und unvollständiger Knochenregeneration in großen Mängel anzugehen. Das ultimative Ziel dieser Studie ist es, die aktuelle Paradigma der Biotechnik in Knochenrekonstruktion und funktionelle Wiederherstellung in kritischen großen Knochendefekte, indem die Notwendigkeit für zeit / arbeitsintensive Knochenmarkstroma vereinfachenl Zellen Isolierung und Expansionsprozesse. Schließlich wollen wir anatomisch nutzen konforme 3D-Konstrukte mit Mikrokanälen und Nano-Poren, die schnelle Zellabsorption, homogene Verteilung und inhabitance für den Wiederaufbau von Knochen induzieren.

The ultimate goal of bone tissue engineering with synthetic constructs is the incorporation of the constructs into the host bone, repopulation of the constructs with host cells, and reconstitution of gas and body fluid exchanges to restore normal bone function. Considerable research has been reported over the last decade in the use of polymeric and ceramic biomaterials for producing scaffolds1,2. However, the ideal material and fabrication technique for optimal bone tissue regeneration has yet to be identified. In addition, there is an overall lack of success in bringing these technologies to the clinic, especially for the reconstruction and restoration of large bone defects. Therefore, restoring critical sized bony defects still remains a clinical challenge1-5. 
Ideally, the scaffolds for bone tissue regeneration should exhibit biocompatibility without causing inflammatory responses or foreign body/toxic reactions, have closely matched mechanical properties when compared to those of native bone, and possess a mechanism to allow diffusion and/or transport of ions and nutrients. Strong bonding with the host bone, dynamic bone growth, vascular ingrowth, and biodegradation of the scaffolds are equally desirable. Although the use of biodegradable polymer scaffolds has exhibited progress in terms of tissue ingrowth, there are controversies over their use for bone regeneration. 
Notwithstanding these extensive efforts, the highly organized structural synthetic constructs still have limited potential in overcoming the obstacle of passive cell penetration. Most of these approaches have resulted in the in vitro tissue ingrowth with cross-sections of less than a few &#181;m to several mm from the external surface, an incomplete integration with host bone, and only partial bone regeneration in vivo6,7. The pioneering cells do not migrate deeply into the constructs because of the lack of an initial force that pulls them inside before cell colonization begins. Consequently, cell colonization strictly occurs at the scaffold periphery, becoming an obstruction from the periphery to the center of the scaffold. Thus, the diffusion of oxygen and nutrients into the inner parts of the templates becomes limited8. Therefore, it is clear that the architecture of the scaffolds (pore size, porosity, interconnectivity, and permeability) that affect the transport and diffusion of substances throughout the scaffolds is critical for achieving well-distributed cell proliferation and differentiation9,10. Although calcium phosphates have been used in the past for scaffold fabrication, different processes and procedures have often resulted in calcium phosphate scaffolds with varying architectures. Thus, the selection of the manufacturing process becomes important in dictating the scaffold architecture needed for successful bone tissue regeneration.
In conclusion, there are still two major shortcomings of bone tissue engineering that need to be addressed: the initial cell recruitment into the template prior to cell attachment and colonization and the quality of substance flow both into and out of the template.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>polyurethan sponge</td>
			<td>Plastifoam</td>
			<td>PU-3215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">167176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxyapatite Powder</td>
			<td>Ossgen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl Alcoho</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">341584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxymethyl cellulose sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">360384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium polyacrylate</td>
			<td>Vanderbilt</td>
			<td>DARVAN 821A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2289</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

distinctive capillary action by micro-channels in bone-like templates can enhance recruitment of cells for restoration of large bony defect

Ohne eine aktive, blühende Zellpopulation, die gut verteilt und stabil an der eingelegten Vorlage verankert ist, hat außergewöhnliche Knochenregeneration nicht auf. Mit konventionellen Vorlagen, das Fehlen von internen Mikrokanälen führt die fehlende Zellinfiltration, Verteilung und inhabitance tief in den Vorlagen. Daher ist eine hochporöse und einheitlich miteinander verbunden trabekulären Knochenartigen Vorlage mit Mikrokanälen (biogenen Mikroschablone; BMT) ist entwickelt worden, um diese Hindernisse zu adressieren. Der Roman BMT wurde durch innovative Konzepte (Kapillarwirkung) erstellt und mit einem Schwamm-Vorlage Beschichtungstechnik hergestellt. Die BMT besteht aus mehreren Bauteilen: miteinander verbundenen Primärporen (300-400 &amp; mgr; m), die Poren im trabekulären Knochen, Mikrokanäle (25 bis 70 &amp; mgr; m) innerhalb jedes Trabekel und Nanoporen (100-400 nm) auf der zu imitieren Oberfläche, damit Zellen zu verankern. Darüber hinaus hat der BMT durch mechanische Test-Studie dokumentiert sim zu haben,Ilar mechanischen Festigkeitseigenschaften zu denen der menschlichen trabekulären Knochen (~ 3,8 MPa) 12. Die BMT zeigte eine hohe Absorption, Retention und Behausung der Zellen während der brückenförmige (Π) Vorlagen (3 cm Höhe und 4 cm Länge). Die Zellen, die anfänglich wurden ausgesät in ein Ende der Vorlagen unmittelbar mit dem anderen Ende (10 cm Abstand) durch Kapillarwirkung der BMT auf das Zellmedium mobilisiert. Nach 4 Stunden wurden die Zellen homogen besetzt die gesamte BMT und wiesen normalen zellulären Verhaltens. Die Kapillarwirkung entfiel der Infiltration der Zellen in die Medien und die Verteilung (aktiv Migration) der gesamten BMT suspendiert. Nachdem beobachtet diese Fähigkeiten der BMT, erwarten wir, dass BMTS werden Knochenmarkzellen, Wachstumsfaktoren und Nährstoffen von der Peripherie unter physiologischen Bedingungen zu absorbieren. Die BMT können derzeitigen Einschränkungen über schnelle Infiltration, homogene Verteilung und inhabita lösennce von Zellen in großen Volumen Vorlagen zu massiven Skelettdefekte zu reparieren.

Die Gesamtstruktur der BMT weist eine einzigartige dreidimensionale Schablone mit Trabekelknochen artigen internen Strukturen. Die BMT enthält Makroporen, Mikrokanäle, und Nano-Poren. Klare Konfigurationen vollständig vernetzte Makroporen (Durchschnittsgröße von 320 &amp; mgr; m) Mikrokanäle (mittlerer Durchmesser 50 um) und Nanoporen (Durchschnittsgröße von 100 nm) wurden mit einem Rasterelektronenmikroskop überprüft (EVO-40; ZEISS) sowie durch Mikrotomographie. Abbildung 1 zeigt schrittweise ausführliche Protokolle Erstellen eines BMT. Durch genaue Steuerung der Protokolle aus der Herstellung der PUR-Schwämme dem Sinterprozess (P1 - P7; Abbildung 1), die folgenden Merkmale erzielt werden: eine hoch dichte und glatte Oberfläche nach der HA-Beschichtung und Trocknen; eine präzise geformten und dimensioniert 3-D-Matrize; eine vollständig vernetzte poröse trabekulären Netzwerk ähnlich dem trabekulären Knochen; und Mikrokanäle witHin jeweils Trabekel, die enossale Kanäle wie Havers-Kanäle und Volkmann-Kanal (Abbildungen 2 und 3) zu imitieren. Weiterhin relativ hohe mechanische Festigkeit (~ 3,8 MPa), die ähnlich der der menschlichen trabekulären Knochen wurde durch ein Druckfestigkeitsprüfung gemessen. Sehr ähnlich histomorphometrische Parameter mit denen der menschlichen Lendenwirbel Trabekelknochen wurden von Mikro-CT-Analyse 12 bestätigt. Unterschiedliche Größen der Kapillarwirkung wurden durch verschiedene Kapillardurchmesser in Abbildung 4 mit Computersimulation gezeigt. Durch diesen Simulationen projiziert wir, dass der BMT würde unterschiedlichen Absorptionsraten innerhalb der Primärporen (300-400 um) und Mikrokanäle (25-70 &amp; mgr; m), bezogen auf die Durchmesser aufweisen. Kleineren Kapillaren wiesen stärkere Aufnahmekapazitäten. Diese Annahme wurde in diesem Experiment bestätigt als in Figur 5 gezeigt. Die BMT zeigten sehr effektivFlüssigkeitsabsorption und Retention durch die Kapillarwirkung der Mikrokanalstrukturen; stevenel die Bläue als dem flüssigen Medium, um leicht verfolgen den Fluss (Abbildung 5) verwendet wird. Basierend auf Computersimulation wurden die BMT mit diesen Konfigurationen gesehen zu absorbieren und zurückzuhalten Zellsuspensionen bis zu 8,5 cm in der Gesamtdistanz innerhalb von 10 sec. Aufgrund eines starken Kapillarwirkung von den inneren Strukturen induziert wird, das gefärbte Medium erreicht das andere Ende eines 3 cm (Höhe) x 4 cm (Länge) x 1 cm (Breite) brückenförmige Vorlage innerhalb von 1 min und 40 sec. Darüber hinaus wurde aktive Zelle Mobilisierung und Einbindung in die BMT beobachtet (Abbildung 6). Anschließend wird die homogene Zellmobilisierung und Befestigung zu einer verstärkten Proliferation und Matrixbildung in einer gleichmäßig verteilten Bildung. Außerdem wurde Fern (~ 10 cm) Wanderung von Zellen durch die BMT sofort validiert, nachdem der BMT mit der Zellsuspension gesättigt. Se<html> EDED Zellen überlebten im Template-Segment, das der Luft ausgesetzt wurde und nicht in das Kulturmedium eingetaucht ist. In diesem Experiment wurde das Kulturmedium zu den Zellen, die durch die ausschließlich in den Vertiefungen berühren nur die Beine des Gerüstes vorgesehen. Die Kapillarwirkung durch die Mikrokanäle zeigten dann frisches Medium erlaubt, das top, Brückenabschnitt des Gerüsts zu erreichen. Nach 3 Tagen der Kultur, wurde die Vorlage mit rasch wuchernden Zellen besetzt. Nach 7 Tagen Kultur wurde jede Trabekel von extrazellulären Matrizen gewickelt und mit Zellen 13 eingebettet. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig1.jpg" /> Abbildung 1. Die Gesamtknochenähnlichen Vorlage Herstellungsprotokoll von der Vorbehandlung des PU-Schwamm (P1) zu der abschließenden Wärmebehandlung (P7). Halten Sie die genauen Sinterprofil nach P7 ist von entscheidender Bedeutung bei der Erreichung günstige mechanische Festigkeit.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig1large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig2.jpg" /> . Abbildung 2 Vertreter Stereomikroskop (AmScope; SM-2TZ-M) Bilder (x4) eines 80 ppi bemessen PU Schwamm (links), HA beschichtet und getrocknet, BMT (Mitte) und Sinter BMT (rechts) (Dimension: 3. cm Höhe x 4 cm Länge x 1 cm in der Breite). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig3.jpg" /> Abbildung 3. REM-und Mikro-CT-Bilder eines biogenen Vorlage: (A) einem Gesamtbild eines biogenen Vorlage, <st<html> rong&gt; (B, C, D) Bilder für Mikrokanäle. Um klare Mikrokanäle in der Trabekeln zu markieren, die Vorlage granuliert wurde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig4.jpg" /> . Abbildung 4. Computational Berechnung der Kapillarwirkung mit unterschiedlichen Kanaldurchmessern innerhalb der gleichen Zeitperiode (0,4 ms), während der größten Kapillare (d = 300 um: bezieht sich auf Primärporen) absorbiert das Medium (blau) bis zu 0,16 mm Höhe, dem kleinsten Kapillare (d = 30 &amp; mgr; m: bezieht sich auf Mikro-Kanal) das Medium bis zu 0.415 mm in der Höhe absorbiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig5.jpg" /> Figur 5. Die Bilder zeigten Unterschiede der Absorptionsfähigkeiten der Kapillarwirkung anhand von verschiedenen Größen der Primärporen und Mikrokanäle (primäre Porengröße bezieht sich auf den Durchschnittsdurchmesser: 60 ppi ≈ 470 &amp; mgr; m, 80 ppi ≈ 320 um, 100 ppi ≈ 200 &amp; mgr; m). Die gelben Linien die Kapillarwirkung durch die Kombination von Primärporen und Mikrokanäle induziert. Die roten Linien stellen die Kapillarwirkung durch die vor allem Mikrokanäle in jedem Trabekel ausgestellt induziert. Wie in (F) gezeigt, wird die 100 ppi Vorlage induzierte die stärkste Kapillarwirkung, was zur vollständigen Sättigung der Vorlage innerhalb von 39 sec. Die 80 ppi und 60 ppi Vorlagen wurden danach getestet. (B) 0 s, (C) 0,5 s, (D) 1,5 sec, (E) 17,0 sec, (F) 39,0 sec, (G) 50,0 sec, und (H) 1 min 18 sec nach dem Eintauchen. (Template Dimension: 1cm x 1 cm x 4 cm in der Höhe quaderförmig). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig6.jpg" /> Abbildung 6. Das Eindringen und die Einwanderung von Zellen aus den Vertiefungen ausgesät (Teil I) zu ungeimpften Brunnen (Teil V) durch die biogenen Vorlagen durch Kapillarwirkung induziert. Die anfänglich ausgesäten Zellen erreicht das Ende der ungeimpften Bein (Teil V) unmittelbar nach voller Sättigung. Nach 3 Tagen wird das Zusammenfließen der Zellen wurde in der gesamten Vorlage offensichtlich. Nach 7 Tagen erfolgte raumzeitliche Kollagenmatrixbildung innerhalb der Zellpopulationen (H &amp; E-Färbung). (Template Dimension: 3 cm Höhe x Länge von 4 cm x 1 cm in der Breite). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig6large.jpg" target="_blank">Bitte cl</a>ick hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Distinctive Capillary Action by Micro-channels in Bone-like Templates can Enhance Recruitment of Cells for Restoration of Large Bony Defect

A step-by-step generic process to create a bone-like template with engineered micro-channels is presented. High absorption and retention capabilities of the template are demonstrated by capillary action via micro-channels.

Distinctive Kapillarwirkung durch Mikrokanäle in knochenähnliche Vorlagen können Rekrutierung von Zellen für die Wiederherstellung der Große Knochendefekt Enhance

Without an active, thriving cell population that is well-distributed and stably anchored to the inserted template, exceptional bone regeneration does not ...

distinctive-capillary-action-micro-channels-bone-like-templates-can

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.6K Aufrufe.  Columbia University. A step-by-step generic process to create a bone-like template with engineered micro-channels is presented. High absorption and retention capabilities of the template are demonstrated by capillary action via micro-channels. 

Serie: Distinctive Capillary Action by Micro-channels in Bone-like Templates can Enhance Recruitment of Cells for Restoration of Large Bony Defect

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

Optische Mapping von Aktionspotentialen und Calcium Transienten in der Maus Herz

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Forschung

Biotechnik

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

Kapillar-Force-Lithographie für Herz-Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

Ein Vollhautdefekt Modell zur Vaskularisierung von Biomaterialien Bewerten<em&gt; In Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

Quantifizierung der globalen diastolischen Funktion durch kinematische Modellierung basierende Analyse der transmitralen Fluss über die diastolische Füllung Parametrisierte Formalismus

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

Nährstoff Verordnung durch kontinuierliche Zufuhr für eine groß angelegte Expansion von Mammalian Cells in Sphäroiden

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Optische Kontrolle von lebenden Zellen elektrische Aktivität von konjugierten Polymeren

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds during repair, which gives rise to a lack of sufficient blood supply and causes necrosis of the new tissues. Rapid vascularization is a vital prerequisite for new tissue survival and integration with existing host tissue. The de novo generation of vasculature in scaffolds is one of the most important steps in making bone regeneration more efficient, allowing repairing tissue to grow into a scaffold. To tackle this problem, the genetic modification of a biomaterial scaffold is used to accelerate angiogenesis and osteogenesis. However, visualizing and tracking in vivo blood vessel formation in real-time and in three-dimensional (3D) scaffolds or new bone tissue is still an obstacle for bone tissue engineering. Multiphoton microscopy (MPM) is a novel bio-imaging modality that can acquire volumetric data from biological structures in a high-resolution and minimally-invasive manner. The objective of this study was to visualize angiogenesis with multiphoton microscopy in vivo in a genetically modified 3D-PLGA/nHAp scaffold for calvarial critical bone defect repair. PLGA/nHAp scaffolds were functionalized for the sustained delivery of a growth factor pdgf-b gene carrying lentiviral vectors (LV-pdgfb) in order to facilitate angiogenesis and to enhance bone regeneration. In a scaffold-implanted calvarial critical bone defect mouse model, the blood vessel areas (BVAs) in PHp scaffolds were significantly higher than in PH scaffolds. Additionally, the expression of pdgf-b and angiogenesis-related genes, vWF and VEGFR2, increased correspondingly. MicroCT analysis indicated that the new bone formation in the PHp group dramatically improved compared to the other groups. To our knowledge, this is the first time multiphoton microscopy was used in bone tissue-engineering to investigate angiogenesis in a 3D bio-degradable scaffold in vivo and in real-time.

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Here, we present a protocol to visualize blood vessel formation in vivo and in real-time in 3D scaffolds by multiphoton microscopy. Angiogenesis in genetically modified scaffolds was studied in a murine calvarial critical bone defect model. More new blood vessels were detected in the treatment group than in controls.

Visualisierung von Angiogenese durch Multiphoton Mikroskopie In Vivo in gentechnisch veränderten 3D-PLGA/nHAp Gerüst für Calvarial kritische Knochen defekt Reparatur

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently needed in disease diagnosis, microbial monitoring, genetically modified organism (GMO) detection, and forensic analysis. We have previously described the platform called CALM (Capillary Array-based Loop-mediated isothermal amplification for Multiplex visual detection of nucleic acids). Herein, we describe improved fabrication and performance processes for this platform. Here, we apply a small, ready-to-use cassette assembled by capillary array for multiplex visual detection of nucleic acids. The capillary array is pre-treated into a hydrophobic and hydrophilic pattern before fixing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primer sets in capillaries. After assembly of the loading adaptor, LAMP reaction mixture is loaded and isolated into each capillary, due to capillary force by a single pipetting step. The LAMP reactions are performed in parallel in the capillaries. The results are visually read out by illumination with a hand-held UV flashlight. Using this platform, we demonstrate monitoring of 8 frequently appearing elements and genes in GMO samples with high specificity and sensitivity. In summary, the platform described herein is intended to facilitate the detection of multiple nucleic acids. We believe it will be widely applicable in fields where high-throughput nucleic acid analysis is required.

This protocol describes the fabrication of a small, ready-to-use cassette that can be applied for visual detection of multiple nucleic acids in a single, test that is easy to operate. In this approach, a capillary array was used for multiplex and highly efficient detection of GMO targets.

Visuelle Erkennung von mehreren Nukleinsäuren in einem Kapillar Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Nachweis von Endotoxin im Nano-Rezepturen mit Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated researchers in the stem cell and bioengineering fields to develop in vitro high-fidelity human myocardium for both basic research and clinical applications. However, the immature phenotype of cardiac cells is a limitation on obtaining tissues that functionally mimic the adult myocardium, which is mainly characterized by mechanical and electrical signals. Thus, the purpose of this protocol is to prepare and mature the target cell population through electromechanical stimulation, recapitulating physiological parameters. Cardiac tissue engineering is evolving toward more biological approaches, and strategies based on biophysical stimuli, thus, are gaining momentum. The device developed for this purpose is unique and allows individual or simultaneous electrical and mechanical stimulation, carefully characterized and validated. In addition, although the methodology has been optimized for this stimulator and a specific cell population, it can easily be adapted to other devices and cell lines. The results here offer evidence of the increased cardiac commitment of the cell population after electromechanical stimulation. Electromechanically stimulated cells show an increased expression of main cardiac markers, including early, structural, and calcium-regulating genes. This cell conditioning could be useful for further regenerative cell therapy, disease modeling, and high-throughput drug screening.

Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells&#039; Cardiomyogenic Potential

Here we present a protocol for training a cell population using electrical and mechanical stimuli emulating cardiac physiology. This electromechanical stimulation enhances the cardiomyogenic potential of the treated cells and is a promising strategy for further cell therapy, disease modeling, and drug screening.

Gleichzeitige elektrische und mechanische Stimulation, Cells Cardiomyogenic Potenzial zu steigern

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated ...