Diese Methode demonstriert die auf Elektroporation basierende Transfektion von primären menschlichen Pigmentepithelzellen unter Verwendung des Dornröschen-Transposon-Systems, einem Nachweis für Transgenexpression und Proteinsekretion. Die Kombination des Dornröschen-Transposon-Systems und der Elektroporation ermöglicht eine effiziente Transfektion von primären menschlichen Pigmentepithelzellen sowie eine stabile und persistente Transgenexpression und Proteinsekretion. Übergeordnetes Ziel ist es, eine zellbasierte Genadditionstherapie zur Behandlung degenerativer Netzhauterkrankungen zu etablieren, die eine stabile und persistente Sekretion des therapeutisch aktiven Proteins voraussetzt.
Anne Freialdenhoven und Antje Schiefer, medizinisch-technische Assistentinnen aus dem Labor, demonstrieren das Verfahren. Um Plasmid-DNA für die primäre humane RPE-Zellelektroporation vorzubereiten, verwenden Sie ein Mikrovolumen-Spektralphotometer, um den Plasmid-DNA-Gehalt zu quantifizieren, und passen Sie die Konzentration auf 250 Nanogramm pro Mikroliter in 10 Millimolar Tris-HCL an. Mischen Sie ein Volumen von 250 Nanogramm pro Mikroliter SB100X-Transposase-Plasmid-DNA mit 16 Volumen von 250 Nanogramm pro Mikroliter Pigmentepithel-abgeleiteter Faktor Transposon-Plasmid-DNA.
Fügen Sie zwei Mikroliter der resultierenden Plasmamischung in ein steriles 1,5 Milliliter sicheres Schleusen-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis und füllen Sie ein Pufferrohr mit drei Milliliter Puffer E.Führen Sie dann das Röhrchen in die Pipettenstation ein, bis ein Klicken zu hören ist, und stellen Sie die Transfektionsvorrichtung auf 1.100 Volt, eine Pulsbreite von 20 Millisekunden und zwei Impulse ein. Um die Zellen für die Elektroporation vorzubereiten. Überprüfen Sie zunächst die Morphologie der primären RPE-Zellkulturen mittels Phasenkontrastmikroskopie, um deren Wachstum und Konfluenz zu beurteilen.
Behandeln Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern 0,05% Trypsin EDTA pro Vertiefung für sieben bis 15 Minuten im Zellkulturinkubator. Wenn sich die Zellen gelöst haben, sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation, resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter PBS und zentrifugieren Sie ein bis 10 mal 10 zu den vier Zellaliquoten pro Transfektionsreaktion. Resuspendieren Sie die Pellets in 11 Mikroliter Puffer R pro Röhrchen und fügen Sie jedem Röhrchen zwei Mikroliter der vorbereiteten Plasmidmischung hinzu.
Führen Sie den Kopf einer Transfektionspipette in eine 10-Mikroliter-Transfektionsspitze ein, bis die Klemme den Montageschaft des Kolbens vollständig aufnimmt, und laden Sie die Zelle und die Plasmidlösung in die Transfektionsspitze. Führen Sie die Transfektionspipette in das Pufferrohr innerhalb der Pipettenstation ein, bis ein Klicken zu hören ist, und drücken Sie Start, um den Elektroporationsvorgang zu starten. Nach der Transfektion vorsichtig die Transfektionspipette aus der Pipettenstation entfernen und sofort die Zell- und Plasmidlösung in die vorbereiteten Vertiefungen der Zellkulturplatte pipettieren.
Zur Reinigung seiner markierten Pigmentepithel-Faktor-Fusionsproteine aus RPE-Zellkulturüberständen. Verwenden Sie zunächst eine abgeschrägte Schnittspitze, um einen 30-Mikroliter-Aliquot Nickel-NTA-Schlamm pro Probe zu sammeln und das Nickel-NTA-Harz durch Zentrifugation zu pelletieren. Resuspendieren Sie das Nickel-NTA-Harz vorsichtig mit 200 Mikrolitern One X-Inkubationspuffer und pelletieren Sie die Lösung zweimal mit einer zusätzlichen Zentrifugation.
Nach der zweiten Zentrifugation werden die Nickel-NTA-Harzpellets vorsichtig mit 40 Mikrolitern Four X-Inkubationspuffer pro Probe resuspendiert. Als nächstes mischen Sie 55 Mikroliter eines Aliquots vorbehandelter Nickel-NTA-Aufschlämmung mit 260 Mikrolitern Four X-Inkubationspuffer und 900 Mikrolitern jedes transefcted RPE-Zellkulturüberstands. Die Mischung auf einem Schaukelschüttler bei Raumtemperatur 60 Minuten inkubieren und die Nickel-NTA-Harzmischungen erneut pelletieren.
Die Pellets in 175 Mikroliter One X Inkubationspuffer vorsichtig resuspendieren und die Mischungen zwei weitere Male zentrifugieren. Nach der zweiten Zentrifugation die Nickel-NTA-Harzpellets in 30 Mikroliter Elution-Puffer für eine 20-minütige Inkubation bei Raumtemperatur unter Schütteln vorsichtig resuspendieren und die Proben erneut zentrifugieren. Dann sammeln Sie die Überstände sorgfältig und mischen Sie sie mit Two X SDS Probenpuffer für die westliche Blutanalyse der gereinigten Proteine.
Kultivierte primäre RPE-Zellen, die aus menschlichen Spenderaugen isoliert wurden, zeigen eine typische Kopfsteinpflastermorphologie, unabhängig vom Alter des Spenders, dem postmortalen Zeitpunkt der Isolierung oder dem Zeitpunkt der Kultivierung. Die Anwendung von kurzfristigen elektrischen Impulsen auf primäre menschliche RPE-Zellen. Die Verwendung des Kapillartransfektionssystems beeinträchtigt die Epithelmorphologie nicht.
Westliche Blutanalysen von transfizierten primären humanen RPE-Zellkulturüberständen zeigen eine Sekretion von Pigmentepithel-abgeleiteten Faktoren in konsistenten Konzentrationen ohne Transgen-Silencing für mehr als 500 Tage. Wie in dieser repräsentativen westlichen Blutanalyse von Zellkulturmedium aus seriell durchgeführten Transfektionen beobachtet, wird 21 Tage nach der Transfektion eine universell höhere Sekretionsrate des Pigmentepithelsfaktors beobachtet. In einer verfolgten Kultur hält eine langfristig erhöhte PEDF-Sekretion mindestens 165 Tage an.
Darüber hinaus zeigt die ELISA-basierte Quantifizierung einen 20-fachen Anstieg der gesamten Sekretion des Pigmentepithels-abgeleiteten Faktors in transfizierten primären menschlichen RPE-Zellen im Vergleich zu entsprechenden nicht transfizierten Kontrollzellen. Dieser Zuwachs wurde auch auf der Genexpressionsebene bestätigt, bei der die gesamte PEDF-Expression um mehr als das 30-fache erhöht wurde. Beim Versuch dieses Protokolls ist es wichtig, Pigmentepithelzellen zu verwenden, deren Morphologie dem In-vivo-Status entspricht.
Denken Sie auch daran, die Zelllösung ohne Luftblasen in die Transfektionsspitze zu ziehen. Die stabil transfizierten Zellen können in verschiedenen Ex Vivo oder In vivo Modellen verwendet werden, um die Funktionalität dieser zellbasierten Genadditionstherapie zu verifizieren.
