In-situ-Hybridisierung ist eine sehr informative Technik, um mRNA- und IncRNA-Expressionsmuster bestimmter Gene in Geweben darzustellen. Unser Ziel in diesem Artikel ist es, eine empfindliche Methode zum Nachweis der spezifischen mRNA-Lokalisierung in koelomischer Flüssigkeit von Sipunculus nudus zu entwickeln, die eine wichtige Fischereiressource ist. Mit dieser Methode haben wir die repräsentativen Ergebnisse unserer erfolgreichen Experimente vorgestellt.
Es ist zu hoffen, dass unsere Methode auf andere Sipuncula-Arten angewendet wird, um die Expressionsmuster der spezifischen mRNA und IncRNA in koelomischer Flüssigkeit zu identifizieren. Fixieren Sie den Sipunculus nudus auf dem Seziertisch. Öffnen Sie den Körper des Sipunculus nudus mit einer kleinen autoklaven Schere.
Dann sammeln und übertragen Sie die coelomische Flüssigkeit mit Pipette auf Poly-D-Lysin behandelt Mikroskop-Dias, leicht verteilt. Die Rutschen werden eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius lufttrocken getrocknet. Waschen Sie die Dias mit DEPC-PBS dreimal, fünf Minuten pro Wäsche mit sanfter Rührung.
Die PBS abtropfen lassen, die Proteinase-K-Lösung bei Raumtemperatur fünf Minuten lang auf die Dias geben. Die Proteinase-K-Lösung abtropfen lassen. Fügen Sie die PFA-Lösung 20 Minuten bei Raumtemperatur auf die Dias.
Entleeren Sie die PFA-Lösung. Waschen Sie die Dias mit DEPC-PBS dreimal, fünf Minuten pro Wäsche mit sanfter Rührung. Entleeren Sie die PBS.
50 Mikroliter Riboprobe hinzufügen. Fügen Sie einen Coverslip hinzu. Die Dias in die Nassbox stecken und mit Paraffinfolie gut versiegeln.
Hybridisieren Sie über Nacht bei 60 Grad Celsius. Tauchen Sie die Dias in den Waschpuffer ein und lassen Sie ihn stehen, bis der Deckelrutsch automatisch abrutscht. Waschen Sie die Dias mit dem vorgeheizten Waschpuffer zweimal bei 65 Grad Celsius, 30 Minuten pro Wäsche mit sanfter Rührung.
Waschen Sie die Dias mit der vorgeheizten SSC-Lösung zweimal bei 65 Grad Celsius, 30 Minuten pro Wäsche mit sanfter Rührung. Waschen Sie die Dias mit der MABT-Lösung zweimal bei Raumtemperatur. 30 Minuten pro Wäsche mit sanfter Rührung.
Entleeren Sie den MABT. Fügen Sie den Blockierungspuffer hinzu. Inkubieren Sie die Dias bei Raumtemperatur für drei bis vier Stunden.
Entleeren Sie den Sperrpuffer. Fügen Sie den Antikörper hinzu, inkubieren Sie die Dias bei vier Grad Celsius über Nacht. Entleeren Sie die Antikörperlösung.
Waschen Sie die Dias mit der MABT-Lösung viermal, 25 Minuten pro Wäsche mit sanfter Rührung. Entleeren Sie den MABT. Fügen Sie den alkalischen Phosphatasepuffer dreimal, fünf Minuten pro Inkubation hinzu.
Entfernen Sie den alkalischen Phosphatasepuffer. Fügen Sie die BCIP-NBT-Färbelösung hinzu. Halten Sie die Dias im Dunkeln.
Die Färbezeit variiert von Minuten bis Stunden, auch über Nacht, was von der Signalintensität abhängt. Der Färbezustand sollte zu Beginn der Färbung häufiger überprüft werden. Zum Beispiel mit einem Intervall von mehreren Minuten und spätestens mit mehreren Stunden der Färbung.
Die Prüfzeit sollte so kurz wie möglich sein, um ein hohes Hintergrundsignal aufgrund der Lichteinwirkung zu vermeiden. Die repräsentativen Signale der In-situ-Hybridisierung werden gezeigt. In situ Hybridisierung von Sipunculus nudus coelomic Fluid mit Anti-Sense-Riboprobe, die auf dmrt1 abzielt, zeigt violette Färbung konzentriert in Trophoblast-Zellen der Spermatozeugmata, Abbildung 2A und B.Sense Riboprobe für dmrt1 kein Hybridisierungssignal, Abbildung 2C.
Nach dem Anschauen dieses Videos haben Sie ein sehr gutes Verständnis dafür, wie Sie die Expressionsmuster von Ziel-mRNA oder IncRNA in der coelomischen Flüssigkeit von Sipunculus nudus visualisieren können.
