Wir danken Herrn Helmus für die Voice-over, CM Popelier, S. und C. Ypenburg Levesque für technische Unterstützung. Diese Forschung wird finanziell von der Niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO), der Königlichen Niederländischen Akademie der Künste und Wissenschaften (KNAW) und der Japan Student Services Organization (JASSO) unterstützt. Diese Veröffentlichung wurde von einer Open-Access-Zuschuss von NWO zu JMK unterstützt.

1. Zuchtanlage <ol><li> Erhalten adulte Tiere Lymnaea stagnalis (L.) aus einer Laborkultur wie der an der VU University. </li><li> Pflegen Sie die kupferarme Wasser bei 20 ° C sowohl in der Zuchtanlage (molluscarium) und experimentelle Tanks, die kontinuierlichen Wasseraustausch. </li><li> Stellen Sie den Hell / Dunkel-Zyklus bei 12 Std.: 12 Std. </li><li> Für Zucht, füttern die erwachsenen Schnecken Pestizid-freie Salat ad libitum, füttern die jungen Jugendlichen mit TetraPhyll (Fischfutter) Flocken. Pflegen Schnecken in separaten Tanks nach ihrem Alter, ab Eiermassen, die innerhalb eines 24-Stunden-Zeitrahmen festgelegt sind. </li><li> Sobald Schnecken werden von den Zuchtbecken sie nicht zurückgegeben werden, um Effekte zu vermeiden entfernt mit der unter leicht veränderten Bedingungen sowie pseudoreplication verhindern gehalten worden. </li></ol> 2. Dissection <ol><li> Isolieren Sie die Schnecken für 1 Woche, und füttern sie ad libitum, um sicherzustellen, that sie haben die volle Spermien und Samenflüssigkeit speichert. </li><li> Bereiten Sie ein Stereo-Mikroskop, eine Dissektion Platte mit Stiften, kleine chirurgische Scheren, groben und feinen Pinzette, eine 10 ml Spritze mit einer 50 mM MgCl 2-Lösung, Injektionsnadeln (0,3 mm x 13 mm) und einige Papierhandtücher gefüllt. </li><li> Euthanize eine Schnecke durch die Injektion von MgCl 2-Lösung (in der Regel 3 ml oder mehr für erwachsene Schnecken mit einer Schalenlänge von 31,6 ± 2,1 mm und Nassgewicht von 2,89 ± 0,55 g). Dringen Sie den Fuß mit der Injektionsnadel in einem 45 °-Winkel und injizieren durch leichtes Anlegen von Druck kontinuierlich, bis die Schnecke bleibt entspannt und erweitert (in Sekunden). Entfernen Sie die Injektionsnadel und prüfen, ob die Schnecke wird eingeschläfert (zB durch Überprüfung, ob die Tentakel Rückzugsreflex fehlt). </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Schale nach ihrer Krümmung durch die Verwendung groben Pinzette. Auf halbem Weg, sanft lösen Sie den Spindelmuskel aus der Schale durch Kratzen mit der Zange. Sanft drehen ter Schnecke aus der Schale, nach der Wickelrichtung der Schale. </li><li> Legen Sie die Schnecke auf dem Dissektion Platte und fassen Sie das hintere Ende des Fußes. Legen Sie dann einen Stift durch den Kopf und etwas Spannung auf die Schnecke Dissektion erleichtern. </li><li> Lokalisieren der weiblichen Gonoporus, das wird ein Bezugspunkt für die Präparation später. </li><li> Mit den OP-Schere und feinen Pinzette, machen den ersten Schnitt, nur unter dem Rand des Mantels geschnitten und in Richtung der weiblichen Gonoporus. Wenn einer der Schere Klingen unter der Körperwand gedrückt wird, heben ihn leicht, um sicherzustellen, dass nur der Körperwand, und keiner der inneren Organe, geschnitten wird. Weiter Schnitt über dem Gonoporus Richtung Kopf und schneiden in einer geraden Linie. </li><li> Lokalisieren der Prostata (posterior) und Samenbläschen (anterior). Präparieren Sie diese sorgfältig und bewahren Sie sie auf Eis. Verwenden Sie diese, um die Testlösungen, die Samenflüssigkeit und / oder Spermien zu machen. Verwenden physiologischen Lymnaea saline (5,83 mmol / l CaCl 2 · 2H 2 O, 3,76 mmol / l MgCl 2 · 6 H 2 O, 42,69 mmol / L NaCl, 37,53 mmol / L KCl) als Trägermedium. </li><li> Sammeln der Samenflüssigkeit, die in das Lumen der Prostata sowie der Spermien aus den Samenbläschen vorliegt. Anschließend auszusetzen sowohl in Kochsalzlösung in separaten Fläschchen vorsichtig geben, ihre Inhalte und das Entfernen des Organgewebe mit einer Pinzette. Halten Sie sich auf Eis und nutzen am selben Tag. Später mischen diese Suspensionen, die verschiedenen Behandlungslösungen zu schaffen. </li></ol> 3. Intravaginale Injection <ol><li> Vor dem Start der intravaginale Injektionsverfahren, bereiten eine Silizium-Shell-Form (gemacht, um die Spitze der Schale passen), 1 mm Spritzen, 10-12 cm Silikonschlauch mit einem Durchmesser von 1 mm, abgestumpft Injektionsnadeln (0,3 mm x 13 mm ), Grob Zange und der gleichen 10-ml-Spritze mit einer 50 mM MgCl 2-Lösung mit einer scharfen Injektionsnadel angebracht gefüllt. </li><li> Sammeln Sie die Spermien, musste mit der Samenflüssigkeit (oder einzelne Samenflüssigkeit Proteine) in einigen Behandlungen hinzuzufügen; eine biologisch relevante Dosis entspricht 1/3 einer Prostata und Samenbläschen pro Injektion. HINWEIS: In der repräsentativen Ergebnisse Schnitt (Fig. 1) die Ergebnisse eines Experiments mit drei verschiedenen Behandlungen sind gezeigt: Kontrolle (Trägermedium, dh, Kochsalzlösung), Ovipostatin (eines der identifizierten Samenflüssigkeit Proteine) allein und Ovipostatin begleitet von Spermien. Darüber hinaus, um die biologisch relevanten Dosis in anderen Spezies zu schätzen, bestimmen die Gewichtsdifferenz der Prostata von Personen, die vor kurzem gepaart und Individuen, die sexuell-16 isoliert geblieben. </li><li> Herstellung von 1-ml-Spritzen für jede der Testlösungen. Füllen Sie jede Spritze mit einer Lösung, und sicherzustellen, dass sich keine Luftblasen im Inneren. </li><li> Setzen Sie einen abgestumpften Injektionsnadel auf jeder Spritze. </li><li> Für die Injektion verwenden A 1mm Silikonschlauch mit einer Länge von mindestens 10 cm. </li><li> Der Silikonschlauch Schieben über die Injektionsnadel, was sicher nicht, um das Rohr zu durchbohren, und entfernen Sie die Luft aus der Röhre durch leichtes Anlegen der Druck auf die Spritze. </li><li> Betäuben eine Schnecke nach dem gleichen Protokoll wie in Punkt 2.3. Dieses Mal stellen Sie sicher nicht mehr als 2-3 ml 50 mM MgCl 2 zu injizieren. </li><li> Legen Sie die Schnecke in der Shell-Form, um es in einer stabilen Lage zu halten. </li><li> Suchen Sie den weiblichen Gonoporus, was eindeutig als weißer Fleck auf der rechten Seite des Tieres, anterior der rechten Tentakel und männlichen Gonoporus sichtbar (diese Position gilt auch für andere Arten von Süßwasserschnecken). Achten Sie auf ungehinderten Zugang haben. </li><li> Verwenden Sie eine Zange, um das Ende des Silizium-Rohr zu halten und schieben Sie ca. 2-4 mm der Silikonschlauch in die weibliche Gonoporus. </li><li> Druck auf die Spritze vorsichtig anwenden und injizieren 0,03 ml der Testlösung. Warten Sie eine halbe minute, um den Druck in der Röhre, in die weiblichen Trakt, bevor Sie das Rohr ausbreiten können. </li><li> Bringen Sie die behandelt Schnecke seiner Isolation Behälter, wo sie überwacht werden können, und lassen Sie es von Sedierung in der Versuchstank erholen. </li></ol> 4. Bioassay <ol><li> Beschriften Sie jede Schnecke für die Identifikation und Messung der Schale der Länge. Letzteres ist ein guter Indikator für die Größe, die relevant ist, wenn die Quantifizierung Reproduktionsleistung. </li><li> Halten Sie jede Schnecke isoliert in einem 460-ml-Behälter, die perforiert ist, um für den Wasseraustausch im Rahmen der experimentellen Tank zu ermöglichen. Es ist wichtig, dass alle Behälter in der richtigen Orientierung, legen mit den Perforationen in der Richtung des Wasserstroms, um eine effiziente Wasseraustausch zu ermöglichen. </li><li> Während der Bioassay, Schnecken ernähren sich regelmäßig mit einer standardisierten Menge an Salat. Verwenden Sie eine Runde, Metall Puncher zu Kopfsalat geschnitten. In diesem Protokoll Salat Scheiben von 19,6 cm 2 verwendet werden, die die eine angenähertmontieren sie maximal an einem Tag essen. </li><li> Sammeln Sie ein Ei Masse mit der flachen Seite eines Spachtels und kratzen die Eimasse von der Behälterwand. Verwenden Sie den Löffel Seite, um die Eimasse zu sammeln. HINWEIS: Opaque Eiermassen, die gerade verlegt wurden, können nicht zum Scannen verwendet werden (sie transparent innerhalb weniger Stunden nach der Verlegung zu werden). Für die Modellarten in diesem Protokoll, Lymnaea stagnalis, überprüfen Eiermassen jeden Tag, da sie 2-3 Eigelege pro Woche zu produzieren. Dies kann in anderen Arten unterscheiden. </li><li> Scannen Sie die gesammelten Eiermassen digital mit Hilfe eines (Laptop) Computer den Scanner-Treiber enthält, einen Flachbett-Scanner, ein Standard-Millimeter-Skala, eine Spachtel, Übertragungsplatten und Glasfliesen. </li><li> Legen Sie jedes Ei Masse auf den Übertragungsplatten und wiederholen, bis die Platten voll sind. Anschließend tupfen Sie die Eiermassen trocken auf Küchenpapier und übertragen Sie sie auf die Glasplatten in der gleichen Reihenfolge wie auf den Übertragungsplatten. </li><li> Drehen Sie jede Fliese auf den Kopf (dieEiermassen werden dem Glasfliese Stick) und sorgfältig legen Sie es auf den Flachbettscanner, nur unter der Millimeterskala. Tragen Sie eine wenig Druck, um die Eigelege zu glätten, die die Eier gleichmäßig verteilen, so dass sie alle in der gleichen Fokusebene sichtbar. Setzen Sie die Fliesen mit einer standardisierten Menge Klebeband um zwei Kanten, um sicherzustellen, dass alle Eier gleichmäßig abgeflacht. </li><li> Stellen Sie die Scanner-Einstellungen. Es ist wichtig, um die Auflösung auf die maximale einzustellen, machen Sie einen Vorschau-Scan, schneiden Sie den Arbeitsbereich und die Helligkeit und den Kontrast. Scannen Sie die Eiermassen. </li><li> Legen Sie jedes Ei Masse im eigenen markierten 20 ml Glasröhrchen für die weitere Entwicklung und Brut. </li><li> Aktualisieren Sie die Wasser in Brut Fläschchen jeden zweiten Tag, um es richtig mit Sauerstoff angereicherten halten. Tun Sie dies nach Jungtier Zahlen und Größe in der folgenden Reihenfolge: Dekantieren / Gießen an (keine Jungtiere), überfüllt (Beginn der Brut) und Extrahieren Sie das Wasser mit einer Pipette (viele Jungtiere). </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. Messen und Zählen Eier <ol><li> Installieren Sie den frei verfügbaren Bildanalyse-Software ImageJ (NIH, USA) und die Zellzähler Plugin. </li><li> Offene ImageJ sowie ein Tabellenkalkulationsprogramm, um die Daten zu übertragen. Dann öffnen Sie ein gescanntes Bild von Eiermassen in ImageJ. </li><li> Stellen Sie die Skala mit Hilfe der Zoom-Werkzeug, um die Millimeter-Skala zu navigieren. Zoom hinein und stellen Sie das Fenster für 1 mm zu füllen den Bildschirm. Ziehen Sie eine Linie mit der Linienfunktion zwischen den beiden Linien, die 1 mm anzuzeigen. Navigieren Sie zum Analysieren und Set-Skala. In dem Pop-Up-Menü die Option gemessene Länge wird sichtbar, stellen bekannte Strecke zu 1 und Längeneinheit auf mm. Aktivieren Sie das Feld Global, und schließen Sie das Fenster. </li><li> Stellen Sie die bevorzugte Maße (Länge, Breite, Umfang), indem Sie zum Analysieren und Set Maße durch Auswahl Area und Feret-Durchmesser (Länge und Breite). Klicken Sie auf OK, um zu bestätigen und fahren Sie mit der Bildanalyse. </li><li> Um die Eier zu messen, zoom auf einem Ei in der ersten Ei-Masse, die gemessen werden muss. Ein Zoom von 800% empfohlen. Dann, mit der Ellipsenwerkzeug zeichnen Sie ein Oval genau um das Ei, drücken Sie Strg + D, um den Umfang auf das Bild ziehen (zum Messen der gleichen Ei zweimal zu verhindern). Dann drücken Sie Strg + M, um das Maß der Eigenschaften des oval (Länge, Breite, Umfang) aufnehmen; ein Popup-Fenster öffnet sich und zeigt die Messungen. HINWEIS: Die Verwendung der elliptischen Werkzeug, um Eier zu messen gilt nicht für alle Arten. Bei Arten mit ungleichmäßig geformten Eier, verwenden Sie stattdessen die Freihand-Auswahl. </li><li> Messen Sie so viele Eier wie erforderlich, und speichern Sie dann die Maßnahmen. Xls Arbeitsblatt. Optional, kopieren Sie die Daten direkt in einem Arbeitsblatt. </li><li> Anschließend zählen Sie die Eier in einem Eiermasse, mit Hilfe des Zählerfenster und legte die Hand zählt in das Arbeitsblatt. </li><li> Alternativ zählen die einzelnen Eier pro Ei Masse mit Hilfe der Zellzähler-Plug-in. Dazu navigieren Sie zu Plug-Ins,dann, Analysieren und wählen Handy-Zähler. Die Zellzähler Fenster erscheint, prüfen Sie den &#39;halten ursprüngliche &quot;-Feld und drücken Sie&quot; initialisieren &quot;. Eine neue Zählerfenster erscheint, wählen Sie den Fadenkreuz-Werkzeug aus der Werkzeugleiste und wählen einen Zähler Typ in der Zellzähler-Menü. Zählen Sie die einzelnen Eier durch Klicken auf die einzelnen Eier in den Zellzähler-Fenster. Beachten Sie die Gesamtzahl neben dem Zählertyp im Zellzähler-Menü. Kopieren Sie diese Nummer manuell in eine Tabellenkalkulation oder die Ergebnisse zu erhalten, indem Sie Ergebnisse. </li><li> Graf mehrere Eiermassen innerhalb einer Zählereignis indem Zählertypen, falls erforderlich. </li></ol>

<ol>
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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+accessory+gland+protein+reduces+egg+laying+in+a+simultaneous+hermaphrodite.">Male accessory gland protein reduces egg laying in a simultaneous hermaphrodite.</a> PLoS ONE. (5), (2010).</li><li>Nakadera, Y., Swart, E. M., Hoffer, J. N. A., Den Boon, O., Ellers, J., Koene, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receipt+of+seminal+fluid+proteins+causes+reduction+of+male+investment+in+a+simultaneous+hermaphrodite.">Receipt of seminal fluid proteins causes reduction of male investment in a simultaneous hermaphrodite.</a> Current Biology. 24, 1-4 (2014).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Das vorgestellte Protokoll zeigt, wie Samenflüssigkeit und wie dies in einem biologisch sinnvoll testen zu sammeln. Obwohl dieses Verfahren wird hier unter Verwendung des Prostata-Extrakt gezeigt, kann die Wirkung einer einzelnen Samenflüssigkeit gereinigte Protein auch nach dem gleichen Verfahren getestet werden. Offensichtlich in solchen Tests ist es immer wichtig, angemessene Kontrollen (Schein-Behandlungen) enthalten, um sicherzustellen, dass die Verfahren und / oder das Trägermedium nicht beeinflussen die Parameter in Fragen 14,16. Unter Verwendung dieses Verfahrens wurde bereits gezeigt, dass es einen einzigen Samenflüssigkeit Protein, nämlich Ovipostatin, die eine Verringerung der Eiablage 14,16 vermittelt. Dieses Protein, in der Prostata produziert und während der Paarung zusammen mit Spermien übertragen, stellt die erste vollständig charakterisierte Samenflüssigkeit Komponente in einem gleichzeitiger Zwitter und hat, so weit, keine Ähnlichkeit zu bekannten Proteinen zeigen. Der Befund, dass OvipostaZinn reduziert Ei Massenproduktion in den Empfänger bestätigt frühere Arbeit angibt, dass Substanzen in der Samenflüssigkeit kann über 13-15 Ei beeinflussen. Durch die Übertragung von biologisch relevanten Mengen (siehe 3.2 16), kann man überzeugend nachweisen, dass es ein Samenflüssigkeit Protein und nicht die Anwesenheit von Spermien selbst, dass die beobachtete Reduktion der Eiablage (Abbildung 1) vermittelt ist. Da wiederholt Erhalt der Samenflüssigkeit durch natürliche Paarung erhöht die Investition pro Ei 15, wird es nun von großer Bedeutung, um andere Parameter der Eiablage zu quantifizieren. Die dargestellte Protokoll bietet nun die notwendigen Verfahren, dies zu tun. Obwohl kein Effekt von Ovipostatin auf Schlupferfolg der Eier durch den Empfänger 16 festgestellt, kann es andere Samenflüssigkeit Proteine, die im Konzert mit diesem Protein handeln. Daher Parameter, die in diesem Zusammenhang quantifiziert werden müssen - neben über Frequenz-und Eiernummern - gehören Eier Größe, hatcHing Zeit, Jungtier Entwicklung und Jungtier groß. Darüber hinaus ist es möglich, Auswirkungen auf andere Prozesse als die weiblichen Eierlegen, wie Spermien Speicherung und Nutzung, sowie die Zuweisung von Ressourcen auf die reproduktiven weiblichen und männlichen Funktion 14,17 aussehen. Offensichtlich ist die vorgestellte Methode instrumental bei der Bewältigung dieser Folgefragen, die beide in Lymnaea stagnalis und anderen Süßwasserschnecken. In der Summe Experimente mit diesem Protokoll zeigen, dass die Samenflüssigkeit übertragen Proteine ​​beeinflussen die weiblichen Fortpflanzungsleistung der Empfänger in diesen gleichzeitige Hermaphroditen. Da nur wenige Studien haben diese gerichtet ist, ist wahrscheinlich sehr viel häufiger bei intern Dünge Hermaphroditen als derzeit in der wissenschaftlichen Literatur reflektiert werden. Vor allem, wenn man bedenkt, dass vor der Paarungspartnerwahl und Spermienkonkurrenz haben gezeigt, dass eine wichtige Rolle in diesen Hermaphroditen 14, spielen die zentrats das Potenzial solcher männlichen Accessoire Drüsenproteine ​​zu sexuell in diesem System gewählt werden. Schließlich hilft diese Forschung, um die Entwicklung von Vorstellung, dass Samenflüssigkeit Proteine ​​sind von gleicher Bedeutung für die gleichzeitige Hermaphroditen, wie sie für die getrennte sexed-Arten sind zu unterstützen.

Nach der Übertragung werden in der Regel von Spermien von männlichen akzessorischen Drüsen produziert Samenflüssigkeit begleitet. Während einige Ejakulat Komponenten spielen eine Rolle bei der Ernährung und Aktivierung Spermien ein, andere beeinflussen weiblichen Physiologie, um die Befruchtung Erfolg der Samenspender 04.02 zu erhöhen. Solche Effekte werden vor allem für ausgewählte, über sexuelle Selektion, wenn eine Spezies ist sehr promiskuitiv und verfügt über effiziente Speicher Spermien und Samen Verdauung. Unter solchen Bedingungen konkurrieren Samenspender stark für die Befruchtung der Eier 5. Zwar gibt es reichlich Korrelations Beweis für die Bedeutung der Samenflüssigkeit Stoffe für männliche Befruchtungserfolg ist der direkte Nachweis seltener und nur wenige Studien haben in den Details der physiologische Veränderung und / oder Substanzen beteiligt 6 befasst. Bei Arten mit getrennten Geschlechtern (dh Männer und Frauen; Gonochoristen, dh) gibt es ein paar gut untersuchten Modell Spezies, wenn es um Samenflüssigkeit Zusammensetzung und deren Auswirkungen geht. Beispiele hierfür sind die Fruchtfliege, Drosophila melanogaster 6, die Malaria-Mücke Anopheles gambiae 7, und die rote Mehlkäfer, Tribolium castaneum 8. Solche Samenflüssigkeit Studien sind viel seltener, wenn es um Arten, die gleichzeitig sind Zwitter (dh Individuen sind funktional männlich und weiblich zugleich), auch wenn diese Art der Fortpflanzung ist im gesamten Tierreich 9 gemeinsamen geht. Die bemerkenswerteste Zwitter Beispiel für die Übertragung eines Zubehördrüsensubstanz ist wahrscheinlich die Erschießung von sogenannten Liebes Darts in Landschnecken 2,10, wo der Stoff von der Samenspender über subkutane Injektion 11,12, also nicht übertragen zusammen mit der Spermatozoen. Aber es gibt viele gleichzeitiger Zwitter, die männliche Accessoire Drüse Produkte zusammen mit ihren Spermien zu übertragen,wie den hier verwendeten Modellarten, der große Teich Schnecke Lymnaea stagnalis. Zurück Forschung hat bereits gezeigt, dass der Erhalt der Samenflüssigkeit beeinflusst die weibliche Reproduktionsleistung dieser Art 13-15, und mehrere der beteiligten Samenflüssigkeit Proteine ​​identifiziert wurden 16,17. Das Gesamtziel dieses Protokoll, das eine Erweiterung der in Koene et al 16 beschriebenen Verfahren ist, ist die Wirkung von Samenflüssigkeit Proteine ​​auf verschiedene Parameter der Eiablage in Schnecken testen. Dies wird durch Zergliederung der Prostata (dh der akzessorischen Drüse Herstellung der Samenflüssigkeit) von sexuell isoliert Donor Schnecken aus einem standardisierten Laborkultur erreicht. Zweitens wird das Spendersamenzellen aus den Samenbläschen gesammelt und verschiedenen Behandlungslösungen hergestellt werden. Anschließend werden die Test Schnecken betäubt und intravaginal mit einer Testlösung (zum Beispiel eingespritzt wird,Prostata-Extrakt allein, Prostata-Extrakt mit Sperma, Sperma allein, allein Trägermedium). Diese Test Schnecken werden dann für die folgenden Tage unter Standardbedingungen überwacht, um Wochen, um die Eiablage zu erfassen. Egg Massen werden gesammelt, digital zum Zählen und Messen verschiedener Parameter gescannt und dann in einzelnen Fläschchen setzen Brut. Nach etwa zwei Wochen werden die Jungtiere gezählt und digital gescannt. Alle Scans, beider Eiermassen und Jungtiere, werden dann mit Hilfe eines frei verfügbaren Bildanalyse-Software analysiert. Aus diesem Protokoll der Laborstamm des großen Schlammschnecke, Lymnaea stagnalis, verwendet, der an der VU Universität in Amsterdam gezüchtet wird. Diese Art dient als Modellsystem für die Untersuchung von Fragen über die sexuelle Selektion und Vermehrung in Hermaphroditen. Relativ großen Größe des Tieres macht es experimentell sehr zugänglich. Darüber hinaus, weil sie als Modell in vielen Arten b verwendet wird,iologische Disziplinen wissen wir bereits viel über die Grundlagen der Biologie dieser Tiere. Dieses Verfahren wird helfen, Fragen zu Prozessen der sexuellen Selektion, die über Samenflüssigkeit Proteinen im allgemeinen vermittelt werden, zu studieren. Darüber hinaus, weil diese gleichzeitige Hermaphroditen, ist es möglich, anzusprechen, ob solche Proteine ​​wirken in ähnlicher und / oder unterschiedlicher Weise, wie sie in der Art, wo die Geschlechter getrennt 16,17 tun.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="587">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:85px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">fish food flakes</td>
			<td style="width:85px;">TetraPhyll</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">stereo microscope</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">small surgical scissors</td>
			<td style="width:85px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">coarse and fine forceps</td>
			<td style="width:85px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 ml syringe</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">injection needles (0.3mmx13mm)</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 Mm MgCl2</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5.83 mmol L-1 CaCl2&#8226;2H2O</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">3.76 mmol L-1 MgCl2&#8226;6H2O</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">42.69 mmol L-1 NaCl</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">37.53 mmol L-1 KCl</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Two component Silicon</td>
			<td style="width:85px;">Sylgard</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 mm syringes</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Silicon tubing (diameter 1 mm)</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">blunted injection needles (0.3mmx13mm)</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tubes</td>
			<td style="width:85px;">Eppendorff</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">460-ml perforated containers</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">metal leaf puncher (19.6 cm2)</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">spatula/spoon</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">(laptop) computer</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">flatbed scanner</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">millimeter scale</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">transferring plates</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">glass tiles</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">20 ml glass vials</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of male accessory gland products on egg laying in gastropod molluscs

In intern Dünge Tiere, Samenflüssigkeit wird in der Regel auf die Spermien hinzugefügt, zusammen die Samen oder Ejakulat. Neben der nährenden und aktivierenden Spermien können die Komponenten in der Samenflüssigkeit beeinflussen auch weiblichen Physiologie der Befruchtung Erfolg des Samenspenders zu erweitern. Während viele Studien solche Effekte bei Arten mit getrennten Geschlechtern berichtet, haben nur wenige Studien dies gleichzeitig Zwitter Tiere gerichtet. Das Video-Protokoll stellt eine Methode, um Auswirkungen von Samenflüssigkeit in Schnecken zu studieren, mit einer gleichzeitig Zwittersüßwasserschnecke, die große Schlammschnecke Lymnaea stagnalis, als Modellorganismus. Während das Verfahren mit vollständiger Prostata Extrakte dargestellt, können die einzelnen Komponenten (dh Proteine, Peptide und andere Verbindungen) der Samenflüssigkeit auf die gleiche Weise getestet werden. Auswirkungen der Erhalt des Ejakulats Komponenten auf die Eiablage kann in Bezug auf die Häufigkeit der Eiablage quantifiziert undsubtiler Schätzungen der weiblichen Reproduktionsleistung wie Ei-Zahlen innerhalb der einzelnen Ei Massen. Die Ergebnisse zeigen, dass Samenflüssigkeit Proteine ​​beeinflussen weibliche Reproduktionsleistung in diesem gleichzeitiger Zwitter, Hervorhebung ihrer Bedeutung für die sexuelle Selektion.

Abbildung 1 zeigt den Anteil der Tiere, Eier zu legen, nachdem intravaginale Injektion von entweder der Kontrollsubstanz (Kochsalzlösung), Ovipostatin oder Ovipostatin begleitet mit Sperma. N = 15 für jede Behandlung; siehe Koene et al 16 für Details und Statistiken (Quelle: Bild 3 von Koene et al 2010, PLoS ONE.).. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51698/51698fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Effekt der Ovipostatin auf Ei Massenproduktion von Lymnaea stagnalis. Die Grafik zeigt den Anteil der Tiere, Eier zu legen, nachdem intravaginale Injektion von entweder der Kontrollsubstanz (Kochsalzlösung), Ovipostatin oder Ovipostatin begleitet mit Sperma. N = 15 für jede Behandlung; siehe Koene et al. 2.010 Details und Statistiken. Nachdruck mit Genehmigung von Koene et al 2010 PLoS ONE 5:. E10117.

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Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.

Effect of Male Zubehör Gland Produkte auf die Eiablage in Schnecken

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.6K Aufrufe.  VU University. This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.

Serie: Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Quantitative Real-Time PCR unter Verwendung der Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Forschung

Biologie

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop Mikrovolumen Quantifizierung von Nukleinsäuren

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

Messung der Auswirkungen von Bakterien auf<em&gt; C. Elegans</em&gt; Verhalten Mit einem Ei Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

Rekonstitution von β-Catenin-Abbau in<em&gt; Xenopus</em&gt; Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

A Functional Assay for Gap Junctional Examination; Electroporation of Adherent Cells on Indium-Tin Oxide

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. A variety of molecules, such as peptides or oligonucleotides can be introduced into essentially 100% of the cells in a non-traumatic manner.&#160; Here, we describe how it can be used to study intercellular, gap junctional communication. Lucifer yellow penetrates into the cells when an electric pulse, applied to the conductive surface on which they are growing, causes pores to form through the cell membrane. This is electroporation. Cells growing on the nonconductive&#160;glass surface immediately adjacent to the electroporated region do not take up Lucifer yellow by electroporation but do acquire the fluorescent dye as it is passed to them via gap junctions that link them to the electroporated cells. The results of the transfer of dye from cell to cell can be observed microscopically under fluorescence illumination. This technique allows for precise quantitation of gap junctional communication. In addition, it can be used for the introduction of peptides or other non-permeant molecules, and the transfer of small electroporated peptides via gap junctions to inhibit the signal in the adjacent, non-electroporated cells is a powerful demonstration of signal inhibition.

This presentation demonstrates a method whereby electroporation of adherent, cultured cells is used for the study of intercellular, junctional communication, while the cells grow on a slide coated with conductive and transparent indium-tin oxide.

Ein Funktionstest für Gap Junction-Prüfung; Elektroporation von adhärenten Zellen auf Indium-Zinn-Oxid

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple method for the immune detection of proteins, the mouse lactating mammary gland being taken as an example. A protocol for the preparation of the tissue samples, especially concerning the dissection of mouse mammary gland, tissue fixation and frozen tissue sectioning, are detailed. A standard protocol to perform indirect immunofluorescence, including an optional antigen retrieval step, is also presented. The observation of the labeled tissue sections as well as image acquisition and post-treatments are also stated. This procedure gives a full overview, from the collection of animal tissue to the cellular localization of a protein. Although this general method can be applied to other tissue samples, it should be adapted to each tissue/primary antibody couple studied.

The indirect immunofluorescence protocol described in this article allows the detection and the localization of proteins in the mouse mammary gland. A complete method is given to prepare mammary gland samples, to perform immunohistochemistry, to image the tissue sections by fluorescence microscopy, and to reconstruct images.

Die indirekte Immunfluoreszenz auf Gefrierschnitte von Mäusemilchdrüse

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a &#39;whole mount&#39; tissue preparation, or developmental stage (such as an embryo or larva) of interest. WMISH is extremely powerful because it can significantly contribute to the functional characterization of complex metazoan genomes, a challenge that is becoming more of a bottleneck with the deluge of next generation sequence data. Despite the conceptual simplicity of the technique much time is often needed to optimize the various parameters inherent to WMISH experiments for novel model systems; subtle differences in the cellular and biochemical properties between tissue types and developmental stages mean that a single WMISH method may not be appropriate for all situations. We have developed a set of WMISH methods for the re-emerging gastropod model Lymnaea stagnalis that generate consistent and clear WMISH signals for a range of genes, and across all developmental stages. These methods include the assignment of larvae of unknown chronological age to an ontogenetic window, the efficient removal of embryos and larvae from their egg capsules, the application of an appropriate Proteinase-K treatment for each ontogenetic window, and hybridization, post-hybridization and immunodetection steps. These methods provide a foundation from which the resulting signal for a given RNA transcript can be further refined with probe specific adjustments (primarily probe concentration and hybridization temperature).

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

Eine ganze Berg<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierungsverfahren für die Gastropod Mollusc<em&gt; Spitzschlammschnecke</em

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

Interzelluläre Gap Junction-Kommunikation: Eine funktionelle Biomarker zur Beurteilung Unerwünschte Auswirkungen von Schadstoffen und Toxinen und gesundheitlichen Vorteile von Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell imaging studies. Methods for detecting RNAs have expanded greatly since seminal studies linked site-specific mRNA localization to gene expression regulation. Dynamic mRNA processes can now be visualized via approaches that detect mRNAs, coupled with microscopy set-ups that are fast enough to capture the dynamic range of molecular behavior. The molecular beacon technology is a hybridization-based approach capable of direct detection of endogenous transcripts in living cells. Molecular beacons are hairpin-shaped, internally quenched, single-nucleotide discriminating nucleic acid probes, which fluoresce only upon hybridization to a unique target sequence. When coupled with advanced fluorescence microscopy and high-resolution imaging, they enable one to perform spatial and temporal tracking of intracellular movement of mRNAs. Although this technology is the only method capable of detecting endogenous transcripts, cell biologists have not yet fully embraced this technology due to difficulties in designing such probes for live cell imaging. A new software application, PinMol, allows for enhanced and rapid design of probes best suited to efficiently hybridize to mRNA target regions within a living cell. In addition, high-resolution, real-time image acquisition and current, open source image analysis software allow for a refined data output, leading to a finer evaluation of the complexity underlying the dynamic processes involved in the mRNA&#39;s life cycle.
Here we present a comprehensive protocol for designing and delivering molecular beacons into Drosophila melanogaster egg chambers. Direct and highly specific detection and visualization of endogenous maternal mRNAs is performed via spinning disc confocal microscopy. Imaging data is processed and analyzed using object detection and tracking in Icy software to obtain details about the dynamic movement of mRNAs, which are transported and localized to specialized regions within the oocyte.

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Here, we present a protocol for the visualization, detection, analysis and tracking of endogenous mRNA trafficking in live Drosophila melanogaster egg chamber using molecular beacons, spinning disc confocal microscopy, and open-source analysis software.

Visualisierung und Verfolgung endogenes mRNAs in Live Drosophila melanogaster Eierkammern

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a fluorescent reporter. The constantly evolving list of genetically encoded fluorescent proteins (FPs) presents users with several alternatives when it comes to fluorescent fusion design. Each FP has specific optical and biophysical properties that can affect the biochemical, cellular, and functional properties of the resulting fluorescent fusions. For instance, several FPs tend to form nonspecific oligomers that are susceptible to impede on the function of the fusion partner. Unfortunately, only a few methods exist to test the impact of FPs on the behavior of the fluorescent reporter. Here, we describe a simple method that enables the rapid assessment of the impact of FPs using polyglutamine (polyQ) toxicity assays in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. PolyQ-expanded huntingtin proteins are associated with the onset of Huntington&#39;s disease (HD), where the expanded huntingtin aggregates into toxic oligomers and inclusion bodies. The aggregation and toxicity of polyQ expansions in yeast are highly dependent on the sequences flanking the polyQ region, including the presence of fluorescent tags, thus providing an ideal experimental platform to study the impact of FPs on the behavior of their fusion partner.

This article describes protocols to assess the effect of fluorescent proteins on the aggregation and toxicity of misfolded polyglutamine expansion for the rapid evaluation of a newly uncharacterized fluorescent protein in the context of fluorescent reporters.

Wirkung von fluoreszierenden Proteinen auf Fusion Partner mit Trinukleotiderkrankungen Toxizität Assays in Hefe

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...