Name: effect of male accessory gland products on egg laying in gastropod molluscs
Uploaded: 2014-06-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 19 s
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Wir danken Herrn Helmus für die Voice-over, CM Popelier, S. und C. Ypenburg Levesque für technische Unterstützung. Diese Forschung wird finanziell von der Niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO), der Königlichen Niederländischen Akademie der Künste und Wissenschaften (KNAW) und der Japan Student Services Organization (JASSO) unterstützt. Diese Veröffentlichung wurde von einer Open-Access-Zuschuss von NWO zu JMK unterstützt.

1. Zuchtanlage <ol><li> Erhalten adulte Tiere Lymnaea stagnalis (L.) aus einer Laborkultur wie der an der VU University. </li><li> Pflegen Sie die kupferarme Wasser bei 20 ° C sowohl in der Zuchtanlage (molluscarium) und experimentelle Tanks, die kontinuierlichen Wasseraustausch. </li><li> Stellen Sie den Hell / Dunkel-Zyklus bei 12 Std.: 12 Std. </li><li> Für Zucht, füttern die erwachsenen Schnecken Pestizid-freie Salat ad libitum, füttern die jungen Jugendlichen mit TetraPhyll (Fischfutter) Flocken. Pflegen Schnecken in separaten Tanks nach ihrem Alter, ab Eiermassen, die innerhalb eines 24-Stunden-Zeitrahmen festgelegt sind. </li><li> Sobald Schnecken werden von den Zuchtbecken sie nicht zurückgegeben werden, um Effekte zu vermeiden entfernt mit der unter leicht veränderten Bedingungen sowie pseudoreplication verhindern gehalten worden. </li></ol> 2. Dissection <ol><li> Isolieren Sie die Schnecken für 1 Woche, und füttern sie ad libitum, um sicherzustellen, that sie haben die volle Spermien und Samenflüssigkeit speichert. </li><li> Bereiten Sie ein Stereo-Mikroskop, eine Dissektion Platte mit Stiften, kleine chirurgische Scheren, groben und feinen Pinzette, eine 10 ml Spritze mit einer 50 mM MgCl 2-Lösung, Injektionsnadeln (0,3 mm x 13 mm) und einige Papierhandtücher gefüllt. </li><li> Euthanize eine Schnecke durch die Injektion von MgCl 2-Lösung (in der Regel 3 ml oder mehr für erwachsene Schnecken mit einer Schalenlänge von 31,6 ± 2,1 mm und Nassgewicht von 2,89 ± 0,55 g). Dringen Sie den Fuß mit der Injektionsnadel in einem 45 °-Winkel und injizieren durch leichtes Anlegen von Druck kontinuierlich, bis die Schnecke bleibt entspannt und erweitert (in Sekunden). Entfernen Sie die Injektionsnadel und prüfen, ob die Schnecke wird eingeschläfert (zB durch Überprüfung, ob die Tentakel Rückzugsreflex fehlt). </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Schale nach ihrer Krümmung durch die Verwendung groben Pinzette. Auf halbem Weg, sanft lösen Sie den Spindelmuskel aus der Schale durch Kratzen mit der Zange. Sanft drehen ter Schnecke aus der Schale, nach der Wickelrichtung der Schale. </li><li> Legen Sie die Schnecke auf dem Dissektion Platte und fassen Sie das hintere Ende des Fußes. Legen Sie dann einen Stift durch den Kopf und etwas Spannung auf die Schnecke Dissektion erleichtern. </li><li> Lokalisieren der weiblichen Gonoporus, das wird ein Bezugspunkt für die Präparation später. </li><li> Mit den OP-Schere und feinen Pinzette, machen den ersten Schnitt, nur unter dem Rand des Mantels geschnitten und in Richtung der weiblichen Gonoporus. Wenn einer der Schere Klingen unter der Körperwand gedrückt wird, heben ihn leicht, um sicherzustellen, dass nur der Körperwand, und keiner der inneren Organe, geschnitten wird. Weiter Schnitt über dem Gonoporus Richtung Kopf und schneiden in einer geraden Linie. </li><li> Lokalisieren der Prostata (posterior) und Samenbläschen (anterior). Präparieren Sie diese sorgfältig und bewahren Sie sie auf Eis. Verwenden Sie diese, um die Testlösungen, die Samenflüssigkeit und / oder Spermien zu machen. Verwenden physiologischen Lymnaea saline (5,83 mmol / l CaCl 2 · 2H 2 O, 3,76 mmol / l MgCl 2 · 6 H 2 O, 42,69 mmol / L NaCl, 37,53 mmol / L KCl) als Trägermedium. </li><li> Sammeln der Samenflüssigkeit, die in das Lumen der Prostata sowie der Spermien aus den Samenbläschen vorliegt. Anschließend auszusetzen sowohl in Kochsalzlösung in separaten Fläschchen vorsichtig geben, ihre Inhalte und das Entfernen des Organgewebe mit einer Pinzette. Halten Sie sich auf Eis und nutzen am selben Tag. Später mischen diese Suspensionen, die verschiedenen Behandlungslösungen zu schaffen. </li></ol> 3. Intravaginale Injection <ol><li> Vor dem Start der intravaginale Injektionsverfahren, bereiten eine Silizium-Shell-Form (gemacht, um die Spitze der Schale passen), 1 mm Spritzen, 10-12 cm Silikonschlauch mit einem Durchmesser von 1 mm, abgestumpft Injektionsnadeln (0,3 mm x 13 mm ), Grob Zange und der gleichen 10-ml-Spritze mit einer 50 mM MgCl 2-Lösung mit einer scharfen Injektionsnadel angebracht gefüllt. </li><li> Sammeln Sie die Spermien, musste mit der Samenflüssigkeit (oder einzelne Samenflüssigkeit Proteine) in einigen Behandlungen hinzuzufügen; eine biologisch relevante Dosis entspricht 1/3 einer Prostata und Samenbläschen pro Injektion. HINWEIS: In der repräsentativen Ergebnisse Schnitt (Fig. 1) die Ergebnisse eines Experiments mit drei verschiedenen Behandlungen sind gezeigt: Kontrolle (Trägermedium, dh, Kochsalzlösung), Ovipostatin (eines der identifizierten Samenflüssigkeit Proteine) allein und Ovipostatin begleitet von Spermien. Darüber hinaus, um die biologisch relevanten Dosis in anderen Spezies zu schätzen, bestimmen die Gewichtsdifferenz der Prostata von Personen, die vor kurzem gepaart und Individuen, die sexuell-16 isoliert geblieben. </li><li> Herstellung von 1-ml-Spritzen für jede der Testlösungen. Füllen Sie jede Spritze mit einer Lösung, und sicherzustellen, dass sich keine Luftblasen im Inneren. </li><li> Setzen Sie einen abgestumpften Injektionsnadel auf jeder Spritze. </li><li> Für die Injektion verwenden A 1mm Silikonschlauch mit einer Länge von mindestens 10 cm. </li><li> Der Silikonschlauch Schieben über die Injektionsnadel, was sicher nicht, um das Rohr zu durchbohren, und entfernen Sie die Luft aus der Röhre durch leichtes Anlegen der Druck auf die Spritze. </li><li> Betäuben eine Schnecke nach dem gleichen Protokoll wie in Punkt 2.3. Dieses Mal stellen Sie sicher nicht mehr als 2-3 ml 50 mM MgCl 2 zu injizieren. </li><li> Legen Sie die Schnecke in der Shell-Form, um es in einer stabilen Lage zu halten. </li><li> Suchen Sie den weiblichen Gonoporus, was eindeutig als weißer Fleck auf der rechten Seite des Tieres, anterior der rechten Tentakel und männlichen Gonoporus sichtbar (diese Position gilt auch für andere Arten von Süßwasserschnecken). Achten Sie auf ungehinderten Zugang haben. </li><li> Verwenden Sie eine Zange, um das Ende des Silizium-Rohr zu halten und schieben Sie ca. 2-4 mm der Silikonschlauch in die weibliche Gonoporus. </li><li> Druck auf die Spritze vorsichtig anwenden und injizieren 0,03 ml der Testlösung. Warten Sie eine halbe minute, um den Druck in der Röhre, in die weiblichen Trakt, bevor Sie das Rohr ausbreiten können. </li><li> Bringen Sie die behandelt Schnecke seiner Isolation Behälter, wo sie überwacht werden können, und lassen Sie es von Sedierung in der Versuchstank erholen. </li></ol> 4. Bioassay <ol><li> Beschriften Sie jede Schnecke für die Identifikation und Messung der Schale der Länge. Letzteres ist ein guter Indikator für die Größe, die relevant ist, wenn die Quantifizierung Reproduktionsleistung. </li><li> Halten Sie jede Schnecke isoliert in einem 460-ml-Behälter, die perforiert ist, um für den Wasseraustausch im Rahmen der experimentellen Tank zu ermöglichen. Es ist wichtig, dass alle Behälter in der richtigen Orientierung, legen mit den Perforationen in der Richtung des Wasserstroms, um eine effiziente Wasseraustausch zu ermöglichen. </li><li> Während der Bioassay, Schnecken ernähren sich regelmäßig mit einer standardisierten Menge an Salat. Verwenden Sie eine Runde, Metall Puncher zu Kopfsalat geschnitten. In diesem Protokoll Salat Scheiben von 19,6 cm 2 verwendet werden, die die eine angenähertmontieren sie maximal an einem Tag essen. </li><li> Sammeln Sie ein Ei Masse mit der flachen Seite eines Spachtels und kratzen die Eimasse von der Behälterwand. Verwenden Sie den Löffel Seite, um die Eimasse zu sammeln. HINWEIS: Opaque Eiermassen, die gerade verlegt wurden, können nicht zum Scannen verwendet werden (sie transparent innerhalb weniger Stunden nach der Verlegung zu werden). Für die Modellarten in diesem Protokoll, Lymnaea stagnalis, überprüfen Eiermassen jeden Tag, da sie 2-3 Eigelege pro Woche zu produzieren. Dies kann in anderen Arten unterscheiden. </li><li> Scannen Sie die gesammelten Eiermassen digital mit Hilfe eines (Laptop) Computer den Scanner-Treiber enthält, einen Flachbett-Scanner, ein Standard-Millimeter-Skala, eine Spachtel, Übertragungsplatten und Glasfliesen. </li><li> Legen Sie jedes Ei Masse auf den Übertragungsplatten und wiederholen, bis die Platten voll sind. Anschließend tupfen Sie die Eiermassen trocken auf Küchenpapier und übertragen Sie sie auf die Glasplatten in der gleichen Reihenfolge wie auf den Übertragungsplatten. </li><li> Drehen Sie jede Fliese auf den Kopf (dieEiermassen werden dem Glasfliese Stick) und sorgfältig legen Sie es auf den Flachbettscanner, nur unter der Millimeterskala. Tragen Sie eine wenig Druck, um die Eigelege zu glätten, die die Eier gleichmäßig verteilen, so dass sie alle in der gleichen Fokusebene sichtbar. Setzen Sie die Fliesen mit einer standardisierten Menge Klebeband um zwei Kanten, um sicherzustellen, dass alle Eier gleichmäßig abgeflacht. </li><li> Stellen Sie die Scanner-Einstellungen. Es ist wichtig, um die Auflösung auf die maximale einzustellen, machen Sie einen Vorschau-Scan, schneiden Sie den Arbeitsbereich und die Helligkeit und den Kontrast. Scannen Sie die Eiermassen. </li><li> Legen Sie jedes Ei Masse im eigenen markierten 20 ml Glasröhrchen für die weitere Entwicklung und Brut. </li><li> Aktualisieren Sie die Wasser in Brut Fläschchen jeden zweiten Tag, um es richtig mit Sauerstoff angereicherten halten. Tun Sie dies nach Jungtier Zahlen und Größe in der folgenden Reihenfolge: Dekantieren / Gießen an (keine Jungtiere), überfüllt (Beginn der Brut) und Extrahieren Sie das Wasser mit einer Pipette (viele Jungtiere). </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. Messen und Zählen Eier <ol><li> Installieren Sie den frei verfügbaren Bildanalyse-Software ImageJ (NIH, USA) und die Zellzähler Plugin. </li><li> Offene ImageJ sowie ein Tabellenkalkulationsprogramm, um die Daten zu übertragen. Dann öffnen Sie ein gescanntes Bild von Eiermassen in ImageJ. </li><li> Stellen Sie die Skala mit Hilfe der Zoom-Werkzeug, um die Millimeter-Skala zu navigieren. Zoom hinein und stellen Sie das Fenster für 1 mm zu füllen den Bildschirm. Ziehen Sie eine Linie mit der Linienfunktion zwischen den beiden Linien, die 1 mm anzuzeigen. Navigieren Sie zum Analysieren und Set-Skala. In dem Pop-Up-Menü die Option gemessene Länge wird sichtbar, stellen bekannte Strecke zu 1 und Längeneinheit auf mm. Aktivieren Sie das Feld Global, und schließen Sie das Fenster. </li><li> Stellen Sie die bevorzugte Maße (Länge, Breite, Umfang), indem Sie zum Analysieren und Set Maße durch Auswahl Area und Feret-Durchmesser (Länge und Breite). Klicken Sie auf OK, um zu bestätigen und fahren Sie mit der Bildanalyse. </li><li> Um die Eier zu messen, zoom auf einem Ei in der ersten Ei-Masse, die gemessen werden muss. Ein Zoom von 800% empfohlen. Dann, mit der Ellipsenwerkzeug zeichnen Sie ein Oval genau um das Ei, drücken Sie Strg + D, um den Umfang auf das Bild ziehen (zum Messen der gleichen Ei zweimal zu verhindern). Dann drücken Sie Strg + M, um das Maß der Eigenschaften des oval (Länge, Breite, Umfang) aufnehmen; ein Popup-Fenster öffnet sich und zeigt die Messungen. HINWEIS: Die Verwendung der elliptischen Werkzeug, um Eier zu messen gilt nicht für alle Arten. Bei Arten mit ungleichmäßig geformten Eier, verwenden Sie stattdessen die Freihand-Auswahl. </li><li> Messen Sie so viele Eier wie erforderlich, und speichern Sie dann die Maßnahmen. Xls Arbeitsblatt. Optional, kopieren Sie die Daten direkt in einem Arbeitsblatt. </li><li> Anschließend zählen Sie die Eier in einem Eiermasse, mit Hilfe des Zählerfenster und legte die Hand zählt in das Arbeitsblatt. </li><li> Alternativ zählen die einzelnen Eier pro Ei Masse mit Hilfe der Zellzähler-Plug-in. Dazu navigieren Sie zu Plug-Ins,dann, Analysieren und wählen Handy-Zähler. Die Zellzähler Fenster erscheint, prüfen Sie den &#39;halten ursprüngliche &quot;-Feld und drücken Sie&quot; initialisieren &quot;. Eine neue Zählerfenster erscheint, wählen Sie den Fadenkreuz-Werkzeug aus der Werkzeugleiste und wählen einen Zähler Typ in der Zellzähler-Menü. Zählen Sie die einzelnen Eier durch Klicken auf die einzelnen Eier in den Zellzähler-Fenster. Beachten Sie die Gesamtzahl neben dem Zählertyp im Zellzähler-Menü. Kopieren Sie diese Nummer manuell in eine Tabellenkalkulation oder die Ergebnisse zu erhalten, indem Sie Ergebnisse. </li><li> Graf mehrere Eiermassen innerhalb einer Zählereignis indem Zählertypen, falls erforderlich. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Das vorgestellte Protokoll zeigt, wie Samenflüssigkeit und wie dies in einem biologisch sinnvoll testen zu sammeln. Obwohl dieses Verfahren wird hier unter Verwendung des Prostata-Extrakt gezeigt, kann die Wirkung einer einzelnen Samenflüssigkeit gereinigte Protein auch nach dem gleichen Verfahren getestet werden. Offensichtlich in solchen Tests ist es immer wichtig, angemessene Kontrollen (Schein-Behandlungen) enthalten, um sicherzustellen, dass die Verfahren und / oder das Trägermedium nicht beeinflussen die Parameter in Fragen 14,16. Unter Verwendung dieses Verfahrens wurde bereits gezeigt, dass es einen einzigen Samenflüssigkeit Protein, nämlich Ovipostatin, die eine Verringerung der Eiablage 14,16 vermittelt. Dieses Protein, in der Prostata produziert und während der Paarung zusammen mit Spermien übertragen, stellt die erste vollständig charakterisierte Samenflüssigkeit Komponente in einem gleichzeitiger Zwitter und hat, so weit, keine Ähnlichkeit zu bekannten Proteinen zeigen. Der Befund, dass OvipostaZinn reduziert Ei Massenproduktion in den Empfänger bestätigt frühere Arbeit angibt, dass Substanzen in der Samenflüssigkeit kann über 13-15 Ei beeinflussen. Durch die Übertragung von biologisch relevanten Mengen (siehe 3.2 16), kann man überzeugend nachweisen, dass es ein Samenflüssigkeit Protein und nicht die Anwesenheit von Spermien selbst, dass die beobachtete Reduktion der Eiablage (Abbildung 1) vermittelt ist. Da wiederholt Erhalt der Samenflüssigkeit durch natürliche Paarung erhöht die Investition pro Ei 15, wird es nun von großer Bedeutung, um andere Parameter der Eiablage zu quantifizieren. Die dargestellte Protokoll bietet nun die notwendigen Verfahren, dies zu tun. Obwohl kein Effekt von Ovipostatin auf Schlupferfolg der Eier durch den Empfänger 16 festgestellt, kann es andere Samenflüssigkeit Proteine, die im Konzert mit diesem Protein handeln. Daher Parameter, die in diesem Zusammenhang quantifiziert werden müssen - neben über Frequenz-und Eiernummern - gehören Eier Größe, hatcHing Zeit, Jungtier Entwicklung und Jungtier groß. Darüber hinaus ist es möglich, Auswirkungen auf andere Prozesse als die weiblichen Eierlegen, wie Spermien Speicherung und Nutzung, sowie die Zuweisung von Ressourcen auf die reproduktiven weiblichen und männlichen Funktion 14,17 aussehen. Offensichtlich ist die vorgestellte Methode instrumental bei der Bewältigung dieser Folgefragen, die beide in Lymnaea stagnalis und anderen Süßwasserschnecken. In der Summe Experimente mit diesem Protokoll zeigen, dass die Samenflüssigkeit übertragen Proteine ​​beeinflussen die weiblichen Fortpflanzungsleistung der Empfänger in diesen gleichzeitige Hermaphroditen. Da nur wenige Studien haben diese gerichtet ist, ist wahrscheinlich sehr viel häufiger bei intern Dünge Hermaphroditen als derzeit in der wissenschaftlichen Literatur reflektiert werden. Vor allem, wenn man bedenkt, dass vor der Paarungspartnerwahl und Spermienkonkurrenz haben gezeigt, dass eine wichtige Rolle in diesen Hermaphroditen 14, spielen die zentrats das Potenzial solcher männlichen Accessoire Drüsenproteine ​​zu sexuell in diesem System gewählt werden. Schließlich hilft diese Forschung, um die Entwicklung von Vorstellung, dass Samenflüssigkeit Proteine ​​sind von gleicher Bedeutung für die gleichzeitige Hermaphroditen, wie sie für die getrennte sexed-Arten sind zu unterstützen.

Nach der Übertragung werden in der Regel von Spermien von männlichen akzessorischen Drüsen produziert Samenflüssigkeit begleitet. Während einige Ejakulat Komponenten spielen eine Rolle bei der Ernährung und Aktivierung Spermien ein, andere beeinflussen weiblichen Physiologie, um die Befruchtung Erfolg der Samenspender 04.02 zu erhöhen. Solche Effekte werden vor allem für ausgewählte, über sexuelle Selektion, wenn eine Spezies ist sehr promiskuitiv und verfügt über effiziente Speicher Spermien und Samen Verdauung. Unter solchen Bedingungen konkurrieren Samenspender stark für die Befruchtung der Eier 5. Zwar gibt es reichlich Korrelations Beweis für die Bedeutung der Samenflüssigkeit Stoffe für männliche Befruchtungserfolg ist der direkte Nachweis seltener und nur wenige Studien haben in den Details der physiologische Veränderung und / oder Substanzen beteiligt 6 befasst. Bei Arten mit getrennten Geschlechtern (dh Männer und Frauen; Gonochoristen, dh) gibt es ein paar gut untersuchten Modell Spezies, wenn es um Samenflüssigkeit Zusammensetzung und deren Auswirkungen geht. Beispiele hierfür sind die Fruchtfliege, Drosophila melanogaster 6, die Malaria-Mücke Anopheles gambiae 7, und die rote Mehlkäfer, Tribolium castaneum 8. Solche Samenflüssigkeit Studien sind viel seltener, wenn es um Arten, die gleichzeitig sind Zwitter (dh Individuen sind funktional männlich und weiblich zugleich), auch wenn diese Art der Fortpflanzung ist im gesamten Tierreich 9 gemeinsamen geht. Die bemerkenswerteste Zwitter Beispiel für die Übertragung eines Zubehördrüsensubstanz ist wahrscheinlich die Erschießung von sogenannten Liebes Darts in Landschnecken 2,10, wo der Stoff von der Samenspender über subkutane Injektion 11,12, also nicht übertragen zusammen mit der Spermatozoen. Aber es gibt viele gleichzeitiger Zwitter, die männliche Accessoire Drüse Produkte zusammen mit ihren Spermien zu übertragen,wie den hier verwendeten Modellarten, der große Teich Schnecke Lymnaea stagnalis. Zurück Forschung hat bereits gezeigt, dass der Erhalt der Samenflüssigkeit beeinflusst die weibliche Reproduktionsleistung dieser Art 13-15, und mehrere der beteiligten Samenflüssigkeit Proteine ​​identifiziert wurden 16,17. Das Gesamtziel dieses Protokoll, das eine Erweiterung der in Koene et al 16 beschriebenen Verfahren ist, ist die Wirkung von Samenflüssigkeit Proteine ​​auf verschiedene Parameter der Eiablage in Schnecken testen. Dies wird durch Zergliederung der Prostata (dh der akzessorischen Drüse Herstellung der Samenflüssigkeit) von sexuell isoliert Donor Schnecken aus einem standardisierten Laborkultur erreicht. Zweitens wird das Spendersamenzellen aus den Samenbläschen gesammelt und verschiedenen Behandlungslösungen hergestellt werden. Anschließend werden die Test Schnecken betäubt und intravaginal mit einer Testlösung (zum Beispiel eingespritzt wird,Prostata-Extrakt allein, Prostata-Extrakt mit Sperma, Sperma allein, allein Trägermedium). Diese Test Schnecken werden dann für die folgenden Tage unter Standardbedingungen überwacht, um Wochen, um die Eiablage zu erfassen. Egg Massen werden gesammelt, digital zum Zählen und Messen verschiedener Parameter gescannt und dann in einzelnen Fläschchen setzen Brut. Nach etwa zwei Wochen werden die Jungtiere gezählt und digital gescannt. Alle Scans, beider Eiermassen und Jungtiere, werden dann mit Hilfe eines frei verfügbaren Bildanalyse-Software analysiert. Aus diesem Protokoll der Laborstamm des großen Schlammschnecke, Lymnaea stagnalis, verwendet, der an der VU Universität in Amsterdam gezüchtet wird. Diese Art dient als Modellsystem für die Untersuchung von Fragen über die sexuelle Selektion und Vermehrung in Hermaphroditen. Relativ großen Größe des Tieres macht es experimentell sehr zugänglich. Darüber hinaus, weil sie als Modell in vielen Arten b verwendet wird,iologische Disziplinen wissen wir bereits viel über die Grundlagen der Biologie dieser Tiere. Dieses Verfahren wird helfen, Fragen zu Prozessen der sexuellen Selektion, die über Samenflüssigkeit Proteinen im allgemeinen vermittelt werden, zu studieren. Darüber hinaus, weil diese gleichzeitige Hermaphroditen, ist es möglich, anzusprechen, ob solche Proteine ​​wirken in ähnlicher und / oder unterschiedlicher Weise, wie sie in der Art, wo die Geschlechter getrennt 16,17 tun.

<table><tbody><tr><td>Fish food flakes</td><td>TetraPhyll</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small surgical scissors</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coarse and fine forceps</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml syringe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Injection needles (0.3 mm x 13 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5.83 mmol/L CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#183;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.76 mmol/L MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#183;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>42.69 mmol/L NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37.53 mmol/L KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Two component Silicon</td><td>Sylgard</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mm syringes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicon tubing (diameter 1 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blunted injection needles (0.3 mm x 13 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes</td><td>Eppendorff</td><td></td><td></td></tr><tr><td>460 ml perforated containers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metal leaf puncher (19.6 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spatula/spoon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Laptop) computer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flatbed scanner</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millimeter scale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transferring plates</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass tiles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 ml glass vials</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

effect of male accessory gland products on egg laying in gastropod molluscs

In intern Dünge Tiere, Samenflüssigkeit wird in der Regel auf die Spermien hinzugefügt, zusammen die Samen oder Ejakulat. Neben der nährenden und aktivierenden Spermien können die Komponenten in der Samenflüssigkeit beeinflussen auch weiblichen Physiologie der Befruchtung Erfolg des Samenspenders zu erweitern. Während viele Studien solche Effekte bei Arten mit getrennten Geschlechtern berichtet, haben nur wenige Studien dies gleichzeitig Zwitter Tiere gerichtet. Das Video-Protokoll stellt eine Methode, um Auswirkungen von Samenflüssigkeit in Schnecken zu studieren, mit einer gleichzeitig Zwittersüßwasserschnecke, die große Schlammschnecke Lymnaea stagnalis, als Modellorganismus. Während das Verfahren mit vollständiger Prostata Extrakte dargestellt, können die einzelnen Komponenten (dh Proteine, Peptide und andere Verbindungen) der Samenflüssigkeit auf die gleiche Weise getestet werden. Auswirkungen der Erhalt des Ejakulats Komponenten auf die Eiablage kann in Bezug auf die Häufigkeit der Eiablage quantifiziert undsubtiler Schätzungen der weiblichen Reproduktionsleistung wie Ei-Zahlen innerhalb der einzelnen Ei Massen. Die Ergebnisse zeigen, dass Samenflüssigkeit Proteine ​​beeinflussen weibliche Reproduktionsleistung in diesem gleichzeitiger Zwitter, Hervorhebung ihrer Bedeutung für die sexuelle Selektion.

Abbildung 1 zeigt den Anteil der Tiere, Eier zu legen, nachdem intravaginale Injektion von entweder der Kontrollsubstanz (Kochsalzlösung), Ovipostatin oder Ovipostatin begleitet mit Sperma. N = 15 für jede Behandlung; siehe Koene et al 16 für Details und Statistiken (Quelle: Bild 3 von Koene et al 2010, PLoS ONE.).. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51698/51698fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Effekt der Ovipostatin auf Ei Massenproduktion von Lymnaea stagnalis. Die Grafik zeigt den Anteil der Tiere, Eier zu legen, nachdem intravaginale Injektion von entweder der Kontrollsubstanz (Kochsalzlösung), Ovipostatin oder Ovipostatin begleitet mit Sperma. N = 15 für jede Behandlung; siehe Koene et al. 2.010 Details und Statistiken. Nachdruck mit Genehmigung von Koene et al 2010 PLoS ONE 5:. E10117.

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Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.

Effect of Male Zubehör Gland Produkte auf die Eiablage in Schnecken

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and ...

effect-male-accessory-gland-products-on-egg-laying-gastropod

Research

JoVE Journal

Biology

10.6K Aufrufe.  VU University. This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.

Serie: Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters (Homarus americanus)

Despite being one of the most productive fisheries in the Northwest Atlantic, much remains unknown about the natural reproductive dynamics of American lobsters. Recent work in exploited crustacean populations (crabs and lobsters) suggests that there are circumstances where mature females are unable to achieve their full reproductive potential due to sperm limitation. To examine this possibility in different regions of the American lobster fishery, a reliable and noninvasive method was developed for sampling large numbers of female lobsters at sea. This method involves inserting a blunt-tipped needle into the female&#39;s seminal receptacle to determine the presence or absence of a sperm plug and to withdraw a sample that can be examined for the presence of sperm. A series of control studies were conducted at the dock and in the laboratory to test the reliability of this technique. These efforts entailed sampling 294 female lobsters to confirm that the presence of a sperm plug was a reliable indicator of sperm within the receptacle and thus, mating. This paper details the methodology and the results obtained from a subset of the total females sampled. Of the 230 female lobsters sampled from George&#39;s Bank and Cape Ann, MA (size range = 71-145 mm in carapace length), 90.3% were positive for sperm. Potential explanations for the absence of sperm in some females include: immaturity (lack of physiological maturity), breakdown of the sperm plug after being used to fertilize a clutch of eggs, and lack of mating activity. The surveys indicate that this technique for examining the mating success of female lobsters is a reliable proxy that can be used in the field to document reproductive activity in natural populations.

A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters Homarus americanus

Fishery-induced changes to exploited crustacean fisheries, such as the American lobster fishery, could potentially influence their reproductive dynamics, leading to a reduction in mating success. This study&#39;s goal was to develop a noninvasive method for ascertaining the mating success of female lobsters that may be physiologically or functionally mature.

Eine nichtinvasive Methode zur<em&gt; In situ</em&gt; Bestimmung des Gegen Erfolg im Frauen amerikanischen Hummer (<em&gt; Homarus americanus</em&gt;)

Despite being one of the most productive fisheries in the Northwest Atlantic, much remains unknown about the natural reproductive dynamics of American ...

Forschung

Umwelt

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

Beziehen Eier von Xenopus laevis Weibchen

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Biologie

Mechanical Separation and Protein Solubilization of the Outer and Inner Perivitelline Sublayers from Hen's Eggs

The perivitelline layer that surrounds the egg yolk plays a fundamental role in fertilization, in egg defense, and in the development of the avian embryo. It is formed by two proteinaceous sublayers that are tightly associated and formed by distinct female reproductive organs. Both structures are assumed to have their own functional specificities, which remain to be defined. To characterize the function of proteins composing each sublayer, the first challenge is to establish the conditions that would allow for the mechanical separation of these two intricate layers, while limiting any structural damage. The second step is to optimize the experimental conditions to facilitate protein solubilization from these two sublayers, for subsequent biochemical analyses. The efficiency of this approach is assessed by analyzing the protein profile of each sublayer by Sodium Dodecyl Sulfate-Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE), which is expected to be distinct between the two structures. This two-step procedure remains simple; it requires classical biochemical equipment and reagents; and is compatible with further in-depth proteomics. It may also be transposed to other avian eggs for comparative biology, knowing that the structure and the composition of the perivitelline layer has been shown to have species-specific features. In addition, the non-denaturing conditions developed for sublayers separation (step 1) allow their structural analyses by scanning and transmission electron microscopy. It may also constitute the initial step for subsequent protein purification to analyze their respective biological activities and 3D structure, or to perform further immunohistochemical or functional analyses. Such studies would help to decipher the physiological function of these two sublayers, whose structural and functional integrities are determinant criteria of the reproductive success.

This article reports a simple method to isolate the outer and inner perivitelline sublayers of chicken eggs while minimizing structural alteration and to optimize protein solubilization of each sublayer for proteomic analyses.

Mechanische Trennung und Proteinlöslichkeit der äußeren und inneren Perivitelline-Sublayer aus Henneneiern

The perivitelline layer that surrounds the egg yolk plays a fundamental role in fertilization, in egg defense, and in the development of the avian embryo. ...

Biochemie

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

The two arms of the Transforming Growth Factor &#223; (Tgf&#223;) superfamily, represented by Tgf&#223;/Nodal or Bone morphogenetic protein (Bmp) ligands, respectively, play essential roles in embryonic development and adult homeostasis. Members of the Tgf&#223; family are made as inactive precursors that dimerize and fold within the endoplasmic reticulum. The precursor is subsequently cleaved into ligand and prodomain fragments. Although only the dimeric ligand can engage Tgf&#223; receptors and activate downstream signaling, there is growing recognition that the prodomain moiety contributes to ligand activity. This article describes a protocol that can be used to identify cleavage products generated during activation of Tgf&#223; precursor proteins. RNA encoding Tgf&#223; precursors are first microinjected into X. laevis embryos. The following day, cleavage products are collected from the blastocoele of&#160;gastrula stage embryos and analyzed on Western blots. This protocol can be completed relatively quickly, does not require expensive reagents and provides a source of concentrated Tgf&#223; cleavage products under physiologic conditions.

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

When Transforming Growth Factor &#223; family precursor proteins are ectopically expressed in Xenopus laevis embryos, they dimerize, get cleaved and are secreted into the blastocoele, which begins at the late blastula to early gastrula stage. We describe a method for aspirating cleavage products from the blastocoele cavity for immunoblot analysis.

Analyse der Umwandlung von Wachstumsfaktor ß Familie Spaltungsprodukte, die in die Blastokoele von Xenopus laevis Embryonen sezerniert werden

The two arms of the Transforming Growth Factor &#223; (Tgf&#223;) superfamily, represented by Tgf&#223;/Nodal or Bone morphogenetic protein (Bmp) ligands, ...

Entwicklungsbiologie

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. When selecting sites to deposit their eggs, female flies are capable of ranking the relative attractiveness of their options and choosing the &#34;greater of two goods.&#34; However, most egg-laying preference assays are not practical if one wants to take a systematic genetic screening approach to search for the circuit basis underlying this simple decision-making process, as they are population-based and laborious to set up. To increase the throughput of studying of egg-laying preferences of single females, we developed custom chambers that each can simultaneously assay egg-laying preferences of up to thirty individual flies as well as a protocol that ensures each female has a high egg-laying rate (so that their preference is readily discernable and more convincing). Our approach is simple to execute and produces very consistent results. Additionally, these chambers can be equipped with different attachments to allow video recording the egg-laying animals and to deliver light for optogenetics studies. This article provides the blueprints for fabricating these chambers and the procedure for preparing the flies to be assayed in these chambers.

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

This protocol describes a high throughput assay for testing egg-laying preferences of Drosophila melanogaster at single-animal resolution. This assay provides a simple, efficient, and scalable platform to identify genes and circuit components that control a simple decision-making process.

Assay mit hohem Durchsatz Eiablage Präferenzen der einzelnen zu untersuchen<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

Neurowissenschaften

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension and microscopically visualize sperm accumulation around the pipette1. Sperm chemoattraction in vertebrates such as frogs, rodents and humans is more difficult to detect and requires quantitative assays. Such assays are of two major types - assays that quantitate sperm movement to a source of chemoattractant, so-called sperm accumulation assays, and assays that actually track the swimming trajectories of individual sperm.
Sperm accumulation assays are relatively rapid allowing tens or hundreds of assays to be done in a single day, thereby allowing dose response curves and time courses to be carried out relatively rapidly. These types of assays have been used extensively to characterize many well established chemoattraction systems - for example, neutrophil chemotaxis to bacterial peptides and sperm chemotaxis to follicular fluid. Sperm tracking assays can be more labor intensive but offer additional data on how chemoattractancts actually alter the swimming paths that sperm take. This type of assay is needed to demonstrate the orientation of sperm movement relative to the chemoattrractant gradient axis and to visualize characteristic turns or changes in orientation that bring the sperm closer to the egg.
Here we describe methods used for each of these two types of assays. The sperm accumulation assay utilized is called a "two-chamber" assay. Amphibian sperm are placed in a tissue culture plate insert with a polycarbonate filter floor having 12 &mu;m diameter pores. Inserts with sperm are placed into tissue culture plate wells containing buffer and a chemoatttractant carefully pipetted into the bottom well where the floor meets the wall (see Fig. 1). After incubation, the top insert containing the sperm reservoir is carefully removed, and sperm in the bottom chamber that have passed through the membrane are removed, pelleted and then counted by hemocytometer or flow cytometer.
The sperm tracking assay utilizes a Zigmond chamber originally developed for observing neutrophil chemotaxis and modified for observation of sperm by Giojalas and coworkers2,3. The chamber consists of a thick glass slide into which two vertical troughs have been machined. These are separated by a 1 mm wide observation platform. After application of a cover glass, sperm are loaded into one trough, the chemoattractant agent into the other and movement of individual sperm visualized by video microscopy. Video footage is then analyzed using software to identify two-dimensional cell movements in the x-y plane as a function of time (xyt data sets) that form the trajectory of each sperm.

Eggs and the extracellular coatings around eggs frequently release peptides, proteins and small molecules that communicate with sperm to guide them to the egg thereby promoting fertilization. Using frog sperm we describe and compare two classes of assays used to detect sperm chemoattraction &#x2013; sperm accumulation assays and sperm tracking assays.

Zwei Arten von Assays zum Nachweis von Frog Sperm Chemotaxis

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a &#39;whole mount&#39; tissue preparation, or developmental stage (such as an embryo or larva) of interest. WMISH is extremely powerful because it can significantly contribute to the functional characterization of complex metazoan genomes, a challenge that is becoming more of a bottleneck with the deluge of next generation sequence data. Despite the conceptual simplicity of the technique much time is often needed to optimize the various parameters inherent to WMISH experiments for novel model systems; subtle differences in the cellular and biochemical properties between tissue types and developmental stages mean that a single WMISH method may not be appropriate for all situations. We have developed a set of WMISH methods for the re-emerging gastropod model Lymnaea stagnalis that generate consistent and clear WMISH signals for a range of genes, and across all developmental stages. These methods include the assignment of larvae of unknown chronological age to an ontogenetic window, the efficient removal of embryos and larvae from their egg capsules, the application of an appropriate Proteinase-K treatment for each ontogenetic window, and hybridization, post-hybridization and immunodetection steps. These methods provide a foundation from which the resulting signal for a given RNA transcript can be further refined with probe specific adjustments (primarily probe concentration and hybridization temperature).

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

Eine ganze Berg<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierungsverfahren für die Gastropod Mollusc<em&gt; Spitzschlammschnecke</em

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a ...

Standardizing a Non-Lethal Method for Characterizing the Reproductive Status and Larval Development of Freshwater Mussels (Bivalvia: Unionida)

Actively monitoring the timing, development, and reproductive patterns of endangered species is critical when managing for population recovery. Freshwater mussels are among the most imperiled organisms in the world, but information about early larval (glochidial) development and brooding periods is still lacking for many species. Previous studies have focused on the complex life history stage when female mussels are ready to parasitize host fish, but few studies have focused on the brooding period and timing of larval development. The protocol described here allows researchers to non-lethally evaluate the state of gravidity for female mussels. The results of this study show that this method does not affect a female mussel&rsquo;s ability to stay gravid or become gravid again after sampling has been performed. The advantage of this method may permit its use on federally threatened or endangered species or other populations of high conservation concern. This protocol can be adapted for use on both preserved or live individuals and was tested on a variety of mussel species. The database provided is a repository for a breadth of information on timing of reproductive habits and will facilitate future freshwater mussel research, conservation, and recovery efforts.

Standardizing a Non-Lethal Method for Characterizing the Reproductive Status and Larval Development of Freshwater Mussels Bivalvia: Unionida

Freshwater mussel conservation is dependent on monitoring reproductive patterns and processes of species. This study standardizes a non-lethal protocol for sampling gill contents, characterizing larval development, and providing a digital repository for data collected. This protocol-database package will be an important tool for mussel researchers in recovery of imperiled species.

Standardisierung einer nicht-tödlichen Methode zur Charakterisierung des Fortpflanzungsstatus und der Larval-Entwicklung von Süßwassermuscheln (Bivalvia: Unionida)

Actively monitoring the timing, development, and reproductive patterns of endangered species is critical when managing for population recovery. Freshwater ...

Eyestalk Ablation to Increase Ovarian Maturation in Mud Crabs

Mud crabs (Scylla spp.) are commercially important crustacean species that can be found throughout the Indo-West Pacific region. During culture, the induction of ovarian maturation is important to meet the consumer demand for mature mud crabs and hasten seed production. Eyestalk ablation is an effective tool to enhance ovarian maturation in mud crabs. However, there is no standard protocol for the eyestalk ablation of mud crabs. In this study, two eyestalk ablation techniques are described: cauterization (the use of hot metal to ablate the eyestalk of an anesthetized crab) and surgery (the removal of the eyestalk using surgical scissors). Before eyestalk ablation, sexually mature females (CW &#62; 86 mm) were anesthetized using an ice bag (&#8722;20 &#176;C) with seawater. When the water temperature reached 4 &#176;C, the ice bag was removed from the water. Flowing seawater (ambient temperature: 28 &#176;C) was used for recovery from the anesthesia immediately after eyestalk ablation. Mortality did not occur during or after the process of eyestalk ablation. The eyestalk ablation protocol presented here accelerated the ovarian maturation of the mud crabs.

Two eyestalk ablation protocols (i.e., cauterization and surgery&#160;approaches) were performed on anesthetized female crabs. The eyestalk ablation of mud crabs hastened the ripening of ovaries without decreasing the survival rate.

Augenstielablation zur Steigerung der Ovarialreifung bei Schlammkrabben

Mud crabs (Scylla spp.) are commercially important crustacean species that can be found throughout the Indo-West Pacific region. During culture, the ...

Drosophila Male Accessory Gland Dissection: A Method to Isolate Secondary Cells

Source: Immarigeon, C., et al. <a href="https://www.jove.com/video/60218/" target="_blank">A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands</a>. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes the dissection of the accessory glands from male flies and shows an example in which the isolated gland will be dissociated into a single cell suspension.

Drosophila Dissektion der männlichen akzessorischen Drüsen: Eine Methode zur Isolierung von Sekundärzellen

Source: Immarigeon, C., et al. A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands. J. Vis. Exp. (2019).
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Effect of Male Zubehör Gland Produkte auf die Eiablage in Schnecken

Zusammenfassung

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Eine nichtinvasive Methode zur