Unser In-situ-Protokoll ist wichtig, weil es eine einfache Möglichkeit bietet, Genexpressionsmuster mit minimaler Hintergrundfärbung zu visualisieren. Diese Technik macht ein kompliziertes und langwieriges Protokoll relativ einfach durchzuführen. Benchtop richtet Vorschläge und Checklisten ein, die dieses Protokoll noch einfacher machen, um richtig zu arbeiten und zu reproduzieren.
Während die hier gezeigten Techniken spezifisch für Astyanax mexicanus sind, könnte es wahrscheinlich an andere Systeme vergleichbar großer Individuen mit kleinen Anpassungen des Protokolls angepasst werden. Verwenden Sie zunächst farbiges Laborband, um Fläschchen und Pipetten für jedes Gen zu bestimmen. Sortieren Sie die Embryonen mit einer Pasteur-Pipette.
Es gibt in der Regel nicht mehr als 12 Embryonen pro Durchstechflasche, einmal sortiert. Als nächstes stellen Sie ein schüttelendes Wasserbad auf 70 Grad Celsius. Ziehen Sie das Methanol sorgfältig in die Fläschchen sortierter Embryonen und ersetzen Sie es durch 500 Mikroliter frisches 100%Methanol.
Waschen Sie die Embryonen kurz für etwa eine Minute auf einem Plattform-Shaker. Danach rehydrieren Sie die Embryonen in einer zunehmenden Konzentration von 1x PBS mit Tween 20 auf einem Plattform-Shaker, wie im Textprotokoll beschrieben. Um zu beginnen, legen Sie eine kleine Dichtung mit einem Netzboden in das rotierende Wasserbad, das auf 70 Grad Celsius vorgewärmt wurde.
Setzen Sie Aliquots von Hybridisierungspuffer minus und Hybridisierungspuffer plus in die Dichtung. Fügen Sie den Durchstechflaschen von Embryonen vorsichtig eine vorbereitete PK-Lösung hinzu, um sicherzustellen, dass alle Gewebe vollständig in Lösung abgedeckt sind. Übertragen Sie die Fläschchen auf einen Plattform-Shaker und lassen Sie sie in der Proteinase K Arbeitslösung für ca. 12 Minuten verdauen.
Danach die PK-Lösung vorsichtig abziehen und die Durchstechflasche kurz mit PBT überfluten, um die restliche PK zu verdünnen. Ersetzen Sie die PBT-Lösung durch 500 Mikroliter frisches PBT und lassen Sie die Lösung fünf Minuten lang auf dem Plattform-Shaker abspülen. Dann ersetzen Sie die PBT-Lösung durch 500 Mikroliter aufgetaut4%PFA. Lassen Sie die Embryonen auf der Plattform schütteln bei Raumtemperatur für 20 Minuten.
Um mit der Vorhybridisierung zu beginnen, fügen Sie den embryonalen Fläschchen 500 Mikroliter vorgewärmten Hybridisierungspuffer minus Lösung hinzu. Die Fläschchen vorsichtig in die Dichtung im Wasserbad bei 70 Grad Celsius legen, ohne fünf Minuten zu zittern. Als nächstes ziehen Sie den Hybridisierungspuffer minus Lösung ab und überfluten Sie die Fläschchen mit 500 Mikrolitervorwärmungspuffer plus Lösung.
Legen Sie die Fläschchen wieder in die Dichtung im Wasserbad und bebrüten Sie vier Stunden oder über Nacht mit Schütteln. Um mit der Hybridisierung zu beginnen, ziehen Sie den Hybridisierungspuffer plus aus den Durchstechflaschen und ersetzen Sie ihn durch 500 Mikroliter frisch vorgewärmten Hybridisierungspuffer plus. Fügen Sie vorsichtig zwei Mikroliter RNA-Sonde zu jeder Durchstechflasche hinzu und wirbeln Sie vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung der Sonde zu gewährleisten.
Inkubieren Sie im Wasserbad bei 70 Grad Celsius über Nacht, während sie bei 40 Umdrehungen um 40 Umdrehungen abschütteln. Zu Beginn bereiten Sie Mikrozentrifugenröhren mit der Bezeichnung Hybridisierungspuffer plus mit dem Gen von Interesse RNA-Sonde, wie im Textprotokoll beschrieben. Legen Sie zwei 15-Milliliter konische Schläuche und fügen Sie 0,2 Gramm blockierendes Reagenz und 10 Milliliter MABT hinzu.
Legen Sie beide Schläuche auf einen Nutatmischer, bis das Reagenz vollständig in der Lösung gelöst ist. Mit einer gläsernen Pasteurpipette ziehen Sie den Hybridisierungspuffer plus und die Sondenlösung ab und legen Sie ihn in ein steriles, beschriftetes Mikrozentrifugenrohr. Bewahren Sie diese Röhre bei minus 20 Grad Celsius für die zukünftige Verwendung im Gefrierschrank auf.
500 Mikroliter des warmen saline Natriumcitrats und Hybridisierungspuffers minus Verdünnungen vorsichtig hinzufügen. Insekubieren Sie in sequenziellen Lösungen für jeweils 10 Minuten im schüttenden Wasserbad und dann bei Raumtemperatur auf einem Plattform-Shaker, wie im Textprotokoll beschrieben. Ersetzen Sie nach der letzten Inkubation die 100%PBT aus jeder Durchstechflasche durch 500 Mikroliter MABT.
Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal für jeweils fünf Minuten. Entfernen Sie zunächst den MABT aus jeder Durchstechflasche und überfluten Sie ihn mit einer vorgemischten Blockierlösung aus einem der 15-Milliliter-Konusrohre. Legen Sie beide Fläschchen vier Stunden bei Raumtemperatur auf den Nutmischer.
Fügen Sie zwei Mikroliter der Antikörperfragmente in die zweite Röhre der vorbereiteten Blockierlösung und kurz Wirbel. Dann jede Durchstechflasche fast vollständig mit Sperrlösung füllen und bei vier Grad Celsius über Nacht auf einen Nussmischer im Kühlschrank legen. Zu Beginn bereiten Sie eine Durchstechflasche mit 10%NGS in MABT vor.
Ersetzen Sie die Blockierlösung in jeder Durchstechflasche durch 500 Mikroliter dieser NGS-Lösung. 25 Minuten bei Raumtemperatur auf dem Plattform-Shaker inkubieren. Danach die NGS-Mischung durch 500 Mikroliter 100%MABT ersetzen.
Inkubieren Sie auf dem Plattform-Shaker bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Wiederholen Sie diese Spüle 11 weitere Male im Laufe des Tages, alle 30 Minuten. Dann jede Durchstechflasche mit 100%MABT füllen und bei vier Grad Celsius über Nacht auf einen Nussmischer im Kühlschrank stellen.
Ersetzen Sie zunächst den MABT in jeder Durchstechflasche durch einen Milliliter AP-Puffer und lassen Sie ihn fünf Minuten waschen. Wiederholen Sie diese Wäsche zweimal, um den MABT vollständig zu entfernen. Ersetzen Sie dann den AP-Puffer durch einen Milliliter frischen AP-Puffer, der 3,5 Mikroliter BCIP und 4,5 Mikroliter MBT enthält.
Ersetzen Sie dies durch eine frische Mischung aus AP-Puffer, der den BCIP und MBT jede Stunde enthält, bis die Reaktion abgeschlossen ist, und stellen Sie sicher, dass die Reaktion genau überwacht wird und alle 15 Minuten überprüft wird, bis der gewünschte Färbegrad erreicht ist. Beenden Sie die Färbungsreaktion, indem Sie die Embryonen in einer zunehmenden Konzentration von 1X PBT im AP-Puffer, wie im Protokoll beschrieben, spülen. Spülen Sie die Embryonen in etwa fünf Milliliter n.A. 100%PBT auf einem Nutatmischer, bis die gewünschte minimale Hintergrundfärbung erreicht ist.
Wenn die Spülung abgeschlossen ist, waschen Sie die Embryonen in 500 Mikroliter sterilen PBS auf einem Plattform-Shaker und postfixieren Sie die Proben, wie im Textprotokoll beschrieben. Nach dem Spülen der Embryonen in vier Milliliter 100% sterile PBS legen und bei Bedarf langfristig bei vier Grad Celsius lagern. In dieser Studie werden embryonale Astyanax-Proben für eine hochwertige Genexpressionsanalyse gekennzeichnet.
Dieser Prozess wurde sowohl in Pachon-Höhlenfischen als auch in Oberflächenfischen erfolgreich umgesetzt. Höhlenfisch-Embryonen, die für den Sox9-Ausdruck gekennzeichnet sind, zeigen eine klare Kennzeichnung in den sich entwickelnden Zweigbögen und der Brustflosse. Beachten Sie, dass Färbung praktisch fehlt im Dottersack oder die sich entwickelnden Soden an der Flanke.
In ähnlicher Weise ist die Tfap2a-Expression in den Teilen des sich entwickelnden Kopfes als frühe Migration neuronaler Kammzellen entlang der dorsalen Flankenregion des Embryos zu erkennen. Das dritte Gen, das für Höhlenfische embryonal präsentiert wird, Phf20a, ist in den Teilen des somatischen Mesoderms und des hinteren Kopfes zu sehen, die dazu bestimmt sind, knöchernes Gewebe hervorzurufen. Oberflächenfischembryonen, die für CXCR gekennzeichnet sind, zeigen eine positive Kennzeichnung in isolierten Bereichen des Kopfes und der Flanke sowie einige einzelne Zellen, die den Dottersack überlagern.
Das Gen Adcyap1a wird in Regionen des zentralen Nervensystems einschließlich Hypophysenzellen exprimiert. Beachten Sie die hochspezifische Expression in gepaarten bilateralen Zellclustern auf den dorsalen Aspekt des Embryos sowie einen größeren Bereich der Mittellinienexpression. Das letzte Gen, das auf Höhlenfisch-Embryonen untersucht wurde, Sox10, ist als früher Marker des neuralen Kamms auf der linken und rechten Seite des dorsalen Embryos offensichtlich.
Nach Abschluss in situ stellen wir uns unsere Ergebnisse in der Regel mit Hilfe der Lichtmikroskopie ab. Es ist am besten, dies innerhalb von zwei Wochen nach Abschluss zu tun, um eine Verschlechterung der Färbung zu vermeiden.
