Diese Arbeit wurde von der Abteilung für Genetik, Entwicklung und Zellbiologie und Iowa State University und von NIH Zuschusses EY024941 (WJ) .Dr finanziert. Jeffrey Essner Bemerkungen zu dem Manuskript.

Alle Tier Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health und wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der Iowa State University und der University of Maryland genehmigt. 1. TALEN Entwurf <ol><li> Eingabe gewünschte Zielsequenz zu einem TALEN Design Website. (Zum Beispiel: <a href="https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen">https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen</a> ). Eingang gewählt Spacer / Wiederholung Array Längen. <ol><li> Kopieren Sie die genomische Sequenz in das Feld mit der Bezeichnung &quot;Sequence&quot;. </li><li> Im Rahmen der &quot;Bereitstellung von benutzerdefinierten Spacer / RVD Lengths&quot; wählen Sie die Registerkarte Distanzlänge und Feldlänge. Hinweis: Distanzlängen von 15 Basenpaaren und wiederholen Array Längen von 15-17 Arbeit gut und machen Montage weniger komplex. </li></ol></li><li> Wählen Sie ein TALEN Paar. TALEN Paare entworfen um einen einzigartigen Ort Restriktionsenzym ermöglichen für die Genotypisierung durch Restriktionsenzym-Verdauungein PCR-Produkt. </li><li> Design - Primer der genomischen Region um die TALEN Zielstelle mit einer Website wie Primer3 30-32 zu verstärken. Wenn sie mit einem Restriktionsenzym, Genotypisierung, design Primer eine Region amplifizieren, die nur einmal die Restriktionsenzymstelle enthält. Es wird empfohlen , dass diese Region amplifiziert wird und vor dem Aufbau TALEN sequenziert keine Polymorphismen in der A. zu identifizieren mexicanus Labor Bevölkerung für die Mikroinjektion verwendet werden. </li></ol> 2. TALEN Assembly (Geändert vom TALEN Kit Protocol) 33,34 Weitere Details und Fehlerbehebung finden Sie das Protokoll 34. <ol><li> Vorbereitung und notwendigen Plasmide aus den TALEN kit-Sequenz nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Eingerichtet, um die # 1-Reaktionen für Reaktionen A und B. repeat-variable Include diresidues (RVDS) 1-10 und der Zielvektor pFUS_A in Reaktion A. einschließen RVDS 11- (N-1) -ten unde Zielvektor pFUS_B (N-1) in Reaktion B, wobei N die Gesamtzahl der in der RVDS TALEN ist. <ol><li> In jeder Reaktion: 1 &amp; mgr; l jedes Plasmids jedes RVD (100 ng / &amp; mgr; l) enthält, den Zielvektor (100 ng / ul), 1 ul Bsa I Restriktionsenzym, 1 &amp; mgr; l Rinderserumalbumin (BSA) (2 mg / ml ), 1 ul Ligase, 2 ul 10fach Ligasepuffer und x &amp; mgr; l Wasser für ein Gesamtvolumen von 20 &amp; mgr; l. Zum Beispiel finden Sie in Tabelle 1. Hinweis: Halbreaktionen können auch verwendet werden. </li><li> Reaktionen in einen Thermocycler und der Zyklus ausgeführt: 10x (37 ° C / 5 min + 16 ° C / 10 min) + 50 ° C / 5 min + 80 ° C / 5 min. </li></ol></li><li> Inkubieren Sie die Reaktionen mit Nuklease. Zu jeder Reaktion hinzufügen 1 ul 25 mM ATP und 1 ul Nuklease. Inkubieren Reaktionen bei 37 ° C für 1 Stunde. </li><li> Verwandeln Reaktionen. <ol><li> Trans 2,5 ul jeder Reaktion in 25 ul chemisch kompetente Zellen. Hinweis: Selbst gemachte zuständigen cells verwendet werden. Allerdings Zellen mit geringer Kompetenz in Mangel an Kolonien führen. <ol><li> Mischungs 2,5 ul der Reaktion mit 25 &amp; mgr; l chemisch kompetente Zellen. Inkubieren auf Eis für fünf Minuten. Inkubieren der Zellen für 30 sec bei 42 ° C. </li><li> Die Röhrchen auf Eis für 2 min. In 125 ul SOB-Medium mit Katabolitenrepression (SOC). Schütteln der Röhrchen bei 37 ° C für 1 Stunde. </li></ol></li><li> Platte 100 &amp; mgr; l der transformierten Zellen auf LB-Platten mit Spectinomycin (50 ug / ml), X-gal und Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG). Wachsen O / N bei 37 ° C. </li></ol></li><li> Wählen Sie 2-3 weiße Kolonien für jede Reaktion und prüfen Sie durch Kolonie - PCR unter Verwendung von Primern pCR8_F1 und pCR8_R1 (Tabelle 2). <ol><li> Machen Sie einen Master-Mix der Reagenzien. Zum Beispiel finden Sie in Tabelle 3. </li><li> Wählen Sie eine Kolonie und schmiert sie in den Boden eines PCR-Röhrchen, und setzen Sie dann die Reste der Kolonie in 2 ml LB mit Spectinomycin(50 ug / ml). Legen Sie 15 ul des Master-Mix in das Röhrchen mit der Kolonie. </li><li> Führen Sie das folgende PCR - Programm (Tabelle 4) </li><li> Überprüfen Sie die PCR (das gesamte Volumen laufen) auf einem 1,5% Agarose-Gel durch Elektrophorese. Die richtigen Klone eine Bande bei der erwarteten Größe haben sowie einen Abstrich und eine Leiter von Bands. Ein Beispiel für den entsprechenden Abstrich, siehe 34,33. </li><li> Wachsen 2 ml Kulturen der richtigen Klone in LB-Medien O / N bei 37 ° C in einem Schüttelinkubator. </li></ol></li><li> Miniprep der Plasmide gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Sequenz zu überprüfen TALEN-Sequenz mit pCR8_F1 und pCR8_R1. Folgen zuvor beschriebenen Verfahren 35. </li><li> Unter Verwendung der richtigen Klone durch Sequenzierung verifiziert, stellen Sie die Reaktion # 2 (TALEN Kit) auf, der den RVDS aus den A- und B-Vektoren und die endgültige RVD in den Zielvektor platzieren wird. <ol><li> Vorbereitung Mischung für die Reaktion 2 (Tabelle 5). Hinweis: Half Reaktionen verwendet werden. </li><li> Legen Sie die Reaktionen in einem Thermocycler und führen Sie das folgende Programm: 37 ° C / 10 min + 16 ° C / 15 min + 37 ° C / 15 min + 80 ° C / 5 min. </li></ol></li><li> Verwandeln Reaktionen. <ol><li> Trans 2,5 ul jeder Reaktion in 25 ul chemisch kompetente Zellen. <ol><li> Mischungs 2,5 ul der Reaktion mit 25 &amp; mgr; l chemisch kompetente Zellen. Inkubieren auf Eis für 5 min. Hitzeschock der Zellen für 30 Sekunden bei 42 ° C. </li><li> Die Röhrchen auf Eis. In 125 ul SOC. Die Röhrchen in einem Schüttelinkubator bei 37 ° C für 1 Stunde. </li></ol></li><li> Platte 100 &amp; mgr; l der transformierten Zellen auf LB-Platten mit Ampicillin (100 ug / ml), X-gal und IPTG. Wachsen O / N bei 37 ° C </li></ol></li><li> Wählen Sie 1-3 weiße Kolonien für jede Reaktion und prüfen Sie durch Kolonie - PCR unter Verwendung von Primern TAL_F1 und TAL_R2 (Tabelle 2). <ol><li> Machen Sie eine Lösung der Polymerase Mastermix, Wasser und Primer, wiein Tabelle 3 beschrieben. eine Kolonie Auswahl und in den Boden eines PCR - Röhrchen verschmieren, und setzen Sie dann die Reste der Kolonie in 2 ml LB mit Ampicillin (100 ug / ml). Platzieren 15 ul der Lösung in das Röhrchen mit der Kolonie. </li><li> Führen Sie das PCR - Programm (Tabelle 6). </li><li> Überprüfen Sie die PCR auf einem 1,5% Agarosegel durch Elektrophorese. Die richtigen Klone ein Verschmieren und eine Leiter von Bands haben. Ein Beispiel für den entsprechenden Abstrich, siehe 34,33. </li><li> Wachsen 2 ml Kulturen der richtigen Klone in LB-Medien O / N bei 37 ° C in einem Schüttelinkubator. </li></ol></li><li> Miniprep der Plasmide gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Sequenz zu überprüfen TALEN - Sequenz mit TAL_F1 und TAL_R2 folgenden zuvor 35 beschriebenen Verfahren. </li></ol> 3. mRNA Transkription von Talens <ol><li> Digest 4 ug von sequenzüberprüft Vorlage mit 2 ul Sac I für 2 Stunden bei 37 ° C. </li&gt; <li> Lauf 2 ul der Sac I-verdaute Plasmid auf einem 1,5% Agarosegel durch Elektrophorese. Plasmide, die richtig verdaut werden, wird eine einzelne Bande angezeigt werden soll. </li><li> Reinige den verbleibenden Sac I-verdaute Plasmid nach dem PCR Purification Kit - Protokoll. Wasche zweimal mit der Waschlösung vor der Elution. Eluieren in 30 ul Nuklease-freies Wasser. </li><li> Folgen Sie dem Standardprotokoll für die T3-mRNA-Produktion. <ol><li> Richten Sie die Hälfte Reaktionen 0,5 ug linearisierte Vorlage (oben hergestellt). Inkubieren bei 37 ° C für 2 Stunden. </li><li> In 0,5 ul DNase (im Bausatz enthalten) und Inkubation bei 37 ° C für 15 min. </li></ol></li><li> Reinige die mRNA, nach den Anweisungen des Herstellers. Eluieren in 30 ul Nuklease-freies Wasser. </li><li> Führen Sie einen 1,5% Agarose-Gel durch Elektrophorese der mRNA zu überprüfen. <ol><li> Reinigen Sie die Gel-Apparatur mit einem Produkt RNase Kontamination zu beseitigen und eine 1,2% Gel herzustellen. </li><li> Mix 1 &amp; mgr; l mRNA + 4 &amp;# 181; l Nuklease-freies Wasser + 5 ul Glyoxyl Laden Farbstoff. Inkubieren Proben bei 50 ° C für 30 min. Zentrifugieren Sie die Röhrchen kurz und auf Eis, bevor das Gel läuft. </li></ol></li><li> Überprüfen Sie die Konzentration ein Verfahren zur Quantifizierung von Nukleinsäurekonzentrationen und speichern Sie die RNA in Aliquots bei -80 ° C verwendet wird. Wählen Sie eine aliquote Größe, so dass RNA wird nicht mehr eingefroren / aufgetaut als einmal. Hinweis: Die Konzentrationen von 500-1000 ng / nl sind in der Regel erhalten. RNA mit einer geringeren Konzentration kann so lange verwendet werden, wie RNA-Integrität aufrechterhalten wird (wie durch eine Bande beurteilt eher als ein Abstrich auf dem Gel). </li></ol> 4. Inject Astyanax mexicanus Embry mit TALEN mRNA <ol><li> Bereiten Sie Werkzeuge für die Injektion. <ol><li> Gießen Injektion Platten durch Gießen 1,2% Agarose in Fischwasser (Wasseranlage mit Natriumbicarbonat und Meersalz auf pH 7,4 und die Leitfähigkeit 700 uS) in eine Petrischale. Legen Sie eine Form (Kunststoffteil mit Vorsprüngen Vertiefungen für Fische zu machenEier) im Inneren der Schale. Entfernen Sie die Form, wenn die Agarose bei 4 ° C gehärtet und zu speichern ist. Einzelheiten zu der Form siehe 36. </li><li> Ziehen Nadeln für die Injektion einer Nadel Abzieher nach den Anweisungen des Herstellers. Hinweis: Passende Nadellänge für Injektionszwecke wichtig ist. Nadeln, die zu lang sind, werden für Injektionen zu flexibel sein. Das Protokoll zum Ziehen Nadeln werden mit der Ausstattung variieren verwendeten Nadeln zu ziehen. Ein Beispiel einer geeigneten Nadel wird in 1 gezeigt. Für unsere Ausrüstung, wir ziehen Nadeln , die 5-6 cm lang sind, und einen Außendurchmesser an der Spitze von etwa 0,011 mm , wenn sie gebrochen. Nadeln sollten jedoch kalibriert werden (Schritt 4.3.4) Öffnungsweite zu bestimmen. Ein Beispielprogramm Nadeln zum Ziehen in Tabelle 7 zu finden. </li><li> Bereiten Glaspipetten für Embryotransfer durch die Pipette zu brechen, so dass die Öffnung groß genug ist, um ein Ei durch. Flamme das gebrochene Ende bises ist nicht mehr scharf. Hinweis: Es ist wichtig , Glaspipetten und Glasschalen zu verwenden , wenn sie mit A. Arbeits mexicanus Eier und Embryonen , wie sie sind klebrig und wird Kunststoff haften. </li></ol></li><li> Sammeln Sie 1-Zell-Stadium Eier. <ol><li> Rasse A. mexicanus nach Standardprotokollen 37. Hinweis: Wenn zum Beispiel Fisch auf einem 14 Licht gehalten werden: 10 Dunkel-Zyklus und mit Zeitgerber Zeit (ZT) mit ZT0 als Lichter an und ZT14 als Licht aus, unsere Oberflächen Fischlaich zwischen ZT15 und ZT19. Genaue Laichzeit ist für jeden einzelnen Labor bestimmt werden. </li><li> Induce Laich von Fisch für 3-4 Tage vor der Paarung überfüttert und Fische in Süßwasser platzieren. Erhöhen Sie die Temperatur 2 ° F. Hinweis: Unsere anfängliche Wassertemperatur liegt bei etwa 74 ° C. </li><li> Sammeln Oberfläche Fischeier im Dunkeln, alle 15 min Kontrolle Eier an der 1-Zellstadium zu erhalten. Hunderte von Eiern aus einem einzigen Paar von Oberflächen Fisch erhalten werden. </li><li> Sammelnin Glasschalen Eier kleben an Kunststoffoberflächen zu verhindern und zu sortieren Embryonen in der 1-Zellstadium vor der Injektion zu isolieren, indem Eier unter dem Mikroskop und sammeln Eier, die eine einzelne Zelle beobachten. Halten Sie Eier in frischem Systemwasser (Tank Wasser, in dem erwachsene Fische untergebracht sind, die für pH-Wert und Leitfähigkeit behandelt wurde). </li></ol></li><li> Injizieren TALEN mRNA. <ol><li> Injizieren Sie unterschiedliche Mengen an Gesamt-mRNA (gleiche Mengen von jedem TALEN im Paar) die optimale Konzentration zur Injektion, um zu bestimmen, wie Toxizität und Wirksamkeit von TALEN Paar variieren. Beginnen Sie mit Konzentrationen von Gesamt-mRNA Injektion, die 400-800 pg sind. Verdünnen und kombinieren mRNA, um die gewünschten Konzentrationen zur Injektion von 1,5 nl. </li><li> Laden verdünnte mRNA in die Rückseite der Nadel und befestigen Sie die Nadel in einem Mikro Injektor. </li><li> Brechen Sie die Nadel mit einer Pinzette. </li><li> Kalibrieren Sie die Nadel. Beispielsweise 10 mal auswerfen und die sich ergebende Abfall in einer Mikrokapillare sammeln. Für 10 x 100 Einweg-1.081; l, 32 mm Mikrokapillare, der Tropfen sollte die Mikrokapillare bis 0,5 mm für 1,5 nl / 1 Injektion zu füllen. Stellen Sie die Einspritzzeit und Druck nach Bedarf. </li><li> Führen Sie die Nadel in die einzelne Zelle und injizieren, um die mRNA. Injizieren Sie die mRNA direkt in die Zelle, nicht in den Dotter. </li><li> Sammeln Sie injizierten Embryonen in Glasschalen. Halten Embryonen bei 23-25 ​​° C. Entfernen Sie tote Embryonen (Embryonen, die trüb und unregelmäßig geformte) regelmäßig für die ersten paar Tage nach der Injektion. Eine Rekordzahl von toten und deformierten Embryonen aus Kontrolle (ohne Injektion) und injiziert Platten. Hinweis: Erhöhte mRNA-Konzentration zu erhöhter Toxizität und Deformierung / Tod von Embryonen führen kann. Somit muss die Toxizität gegenüber Effizienz ausgeglichen werden, um die beste Konzentration der mRNA zu bestimmen, zu injizieren. </li></ol></li></ol> 5. Phänotyps Gründer Fisch und TALEN Effizienz auswerten <ol><li> Sacrifice Embryonen nach dem institutionellen Tier Protokoll. Hinweis: Wir einschläferndurch schnelle Embryonen auf Eis schmetternd. </li><li> Sammeln Embryonen in 0,8 ul PCR-Streifen Röhrchen eine Transferpipette. Hinweis: Die Genotypisierung kann auf einzelne Embryonen oder Pools von Embryonen durchgeführt werden. </li><li> Extrakt DNA. <ol><li> Ort Embryonen in 100 ul 50 mM Natriumhydroxid (NaOH) und 30 min bei 95 ° C inkubieren, dann kühlen auf 4 ° C. </li><li> Hinzufügen 1/10 Volumen (10 ul) von 1 M Tris-HCl pH 8. </li></ol></li><li> Durchführen einer PCR auf die Region unter Verwendung der in Schritt entwickelt Primern 1.3 (siehe Tabellen 8 und 9 für die Probenprotokolle). Für einzelne Embryonen 1 ul DNA für die PCR-Reaktion ausreichend. </li><li> Digest das resultierende PCR-Produkt mit dem geeigneten Restriktionsenzym und führen ein 1,5% Agarosegel durch Elektrophorese. <ol><li> Beispielsweise für die Genotypisierung die oculocutaneous Albinismus 2 (OCA2) locus in injizierten Embryonen verdauen das PCR Produkt das Restriktionsenzym Bsr unter Verwendung von I 0 Zugabe0,5 ul Bsr I direkt auf 12,5 &amp; mgr; l der PCR - Reaktion fertiggestellt, für 2 Stunden bei 65 ° C inkubiert. Führen Sie das unverdaute und das verdaute Produkt auf einem Gel. Restriktionsenzym beständigen Bands (dh Bänder, die nicht verdauen) zeigen , dass TALEN-induzierten Mutationen vorhanden sind (Abbildung 2). </li></ol></li><li> (Optional) Berechnen Rate Prozentsatz Mutation durch den Prozentsatz der ungeschnittenen Produkt Bestimmung von Bildern von Gelen in Fidschi 38 Analyse der Gel - Analyse - Tool mit dem Intensitätswert jedes Bandes zu berechnen , wie zuvor 29 beschrieben. </li><li> Bestimmen Sie die Sequenz von mutierten Allelen durch TA das Gel gereinigt Restriktionsenzym resistente Mutante Band Klonierung und Sequenzierung Klone. <ol><li> Gel reinigt das Restriktionsenzym resistente Mutante Bande nach den Anweisungen des Herstellers. TA klonen die Band nach den Anweisungen des Herstellers. Pick-Kolonien und wachsen in 1,5 ml LB O / N bei 37 ° C in einem geschütteltenInkubator. </li><li> Miniprep Kulturen den Anweisungen des Herstellers folgen. Senden Sie die DNA für die Sequenzierung. </li><li> Mit einem Programm wie Menschenaffe, richten Sie die mutierten Sequenzen zu der Wildtyp-Sequenz. <ol><li> Kopieren Sie beide Sequenzen in ApE Dateien. Wählen Sie die &quot;Align zwei Sequenzen&quot; Werkzeug aus dem Menü &quot;Extras&quot;. </li><li> Geben Sie die beiden DNA-Sequenzen, die die Drop-Down-Menüs. Anmerkung: Die umgekehrte Komplement der klonierten Sequenz müssen die PCR ging in den Klonierungsvektor abhängig von der Richtung verwendet werden. Wenn die Sequenzen nicht fluchten, wiederholen Sie die Schritte, die &quot;Rev-Com&quot; in der Gruppe &quot;Align DNA&quot; Kästchens. </li></ol></li></ol></li><li> Gründer Fisch für Phänotypen bei geeigneten Zeitpunkt und unter Verwendung geeigneter Methoden für den erwarteten Phänotyp 29 (Beispiel : Abbildung 3) auswerten. Verfahren zur Phänotypisierung wird auf dem erwarteten Phänotyp für das Gen durch den Forscher mit Hilfe der Protoc gezielt basierenol. </li></ol> 6. Bildschirm Germline Transmission Anmerkung: A. mexicanus Geschlechtsreife bei 4-8 Monaten erreichen. <ol><li> Überqueren Sie sexuell reifen Gründer Fisch zu Wildtyp-Fisch. </li><li> Screen - Embryonen oder ausgewachsene Fische unter Verwendung von Verfahren in den Schritten 5,1-5,7 (Abbildung 4). Für erwachsene Fisch, kann ein Stück des Schwanzes folgenden anesthetization abgeschnitten. <ol><li> Anästhesieren Fisch von Fisch in einer Lösung von Tricaine (3-Aminobenzoesäure-ethylester) Eintauchen Stress während fin Abschneiden zu reduzieren. Nach Finne Clipping, erlauben Fische in Süßwasser zu erholen. Fisch erholen sich schnell; beobachten, bis sie gewonnen haben (schwimmen normalerweise). </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Große Fortschritte wurden in den letzten Jahren zum Verständnis der genetischen Grundlage der Entwicklung der Merkmale vorgenommen. Während Kandidatengene die Entwicklung einer Reihe von Merkmalen zugrundeliegenden identifiziert wurden, ist es schwierig geblieben , diese Gene in vivo zu testen , aufgrund des Fehlens von genetischen Lenkbarkeit der meisten evolutionarily interessante Arten. Hier berichten wir über ein Verfahren zur Genom Bearbeitung in A. mexicanus, eine Spezies verwendet , um die E...

die genetische Basis der Trait Evolution zu verstehen, ist ein kritischer Forschungsziel von Evolutionsbiologen. Es wurden beträchtliche Fortschritte bei der Identifizierung von Loci zugrunde liegenden , die Entwicklung von Merkmalen und Ortung Kandidatengene innerhalb dieser Loci (zB 1-3) hergestellt. Allerdings Funktionsprüfung die Rolle dieser Gene so viele Organismen, die für die Untersuchung der Evolution von Merkmalen verwendet geblieben ist herausfordernd sind derzeit nicht genetisch manipulierbaren. Das Aufkommen der Genome Editing-Technologien hat sich stark genetische Manipulierbarkeit von einem breiten Spektrum von Organismen erhöht. Transkriptionsaktivator-like Effektor Nukleasen (TALENS) und gruppierten regelmäßig kurzen palindromischen Repeats (CRISPRs) voneinander beabstandete haben gezielte Mutationen in Gene in einer Anzahl von Organismen zu erzeugen , verwendet (beispielsweise 4-11). Diese Werkzeuge, angewandt auf eine evolutionär relevante System, haben das Potenzial, die Art und Weise Evolutionsbiologen die genetische Grundlage der Evolution studieren, um zu revolutionieren. Astyanax mexicanus ist eine Art der Fische, die in zwei Formen existiert: A. ein Fluss lebende Oberflächenform (surface Fisch) und mehrere höhlenbewohnenden Formen (cavefish). mexicanus cavefish von Oberflächenfische Vorfahren ( zusammengefasst in 12) entwickelt. Populationen von cavefish haben eine Reihe von Merkmalen , einschließlich Verlust von Augen, verringern oder Verlust der Pigmentierung entwickelt hat , eine erhöhte Anzahl von Geschmacksknospen und Schädelneuromasten und Veränderungen im Verhalten wie Verlust des Ausbildungsverhalten, erhöhte Aggression, Veränderungen in der Fütterung Haltung und hyperphagia 13 -19. Cavefish und Oberflächenfische sind interfertile und genetische Kartierung Experimente durchgeführt wurden Loci und Kandidatengene für Höhlen Züge 1,20-26 zu identifizieren. Einige Kandidatengene wurden für eine funktionelle Rolle in einen Beitrag zur Höhle Züge in der Zellkultur 1,19, in Modellorganismen anderer Arten 21 oder durch die Überexpression 27 oder transiente Knockdown u getestetMorpholinos 28 in A. singen mexicanus. Jedoch hat jedes dieser Verfahren Grenzen. Die Fähigkeit mutanten Allele dieser Gene in A. zu erzeugen mexicanus ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis ihrer Funktion in der Entwicklung der cavefish. Somit A. mexicanus ist ein idealer Kandidat Organismus für die Anwendung der Genombearbeitungstechnologien. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Genom Bearbeitung in A. mexicanus mit Talens. Dieses Verfahren kann verwendet werden mosaic injizierten Gründer Fisch für Phänotypen zu bewerten und für Linien von Fischen mit stabilen Mutationen in Genen von Interesse 29 zu isolieren.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Injection station</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel apparatus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Needle puller</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Note: As far as we know, supplies from different companies can be used unless otherwise indicated</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0</td><td>Addgene</td><td>Kit #1000000024</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents LB Agar, Miller (Granulated)</td><td>Fisher</td><td>BP9724-500</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller</td><td>Fisher</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Teknova TET-15 in 50% EtOH</td><td>Teknova (ordered through Fisher)</td><td>50-843-314</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin Dihydrochloride, Fisher BioReagents</td><td>Fisher</td><td>BP2957-1</td><td></td></tr><tr><td>Super Ampicillin (1,000x solution)</td><td>DNA Technologies</td><td>6060-1</td><td></td></tr><tr><td>ThermoScientific X-Gal Solution, ready-to-use</td><td>Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher)</td><td>FERR0941</td><td></td></tr><tr><td>IPTG, Fisher BioReagents</td><td>Fisher</td><td>BP1620-1</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Fisher</td><td>08-757-13</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Bsa&lt;/em&gt;I</td><td>New England Biolabs (ordered through Fisher)</td><td>50-812-203</td><td>Use BsaI, not BsaI-HF (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol)</td></tr><tr><td>BSA</td><td>New England Biolabs</td><td>provided with restriction enzymes</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 ligase buffer</td><td>Promega (ordered through Fisher)</td><td>PR-C1263</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green Master mix</td><td>Promega (ordered through Fisher)</td><td>PRM7123</td><td>Other Taq can be used, but the reaction should be adjusted accordingly</td></tr><tr><td>Quick ligation kit</td><td>New England Biolabs (ordered through Fisher)</td><td>50-811-728</td><td>We use Quick Ligase for all TALEN assembly reactions</td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-06</td><td>Other chemically competent cells or homemade competent cells can be used</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Esp&lt;/em&gt; 3I</td><td>Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher)</td><td>FERER0451</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid-Safe ATP-dependent DNase</td><td>Epicentre (Ordered through Fisher)</td><td>NC9046399</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>The Qiagen kit should be used for the initial plasmid preparation (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol)</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>GeneMate LE Quick Dissolve Agaraose</td><td>BioExpress</td><td>E-3119-125</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Sac&lt;/em&gt; I</td><td>Promega (Ordered through Fisher)</td><td>PR-R6061</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T3 Transcription kit</td><td>Ambion</td><td>AM1348M</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy MinElute Cleanup Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>NorthernMax-Gly Sample Loading Dye&amp;nbsp;</td><td>Ambion (ordered through Fisher)</td><td>AM8551</td><td></td></tr><tr><td>Eliminase</td><td>Decon (ordered through Fisher)</td><td>04-355-32</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Disposable Soda-Lime Glass Pasteur Pipets</td><td>Fisher</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Standard Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>Microcaps</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>1-000-0010</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector</td><td>Eppendorf (ordered through Fisher)</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Fisher</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td></td></tr></tbody></table>

genome editing in astyanax mexicanus using transcription activator-like effector nucleases (talens)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

TALEN Paar Injektionen Ergebnis der RVDS an spezifische DNA - Nukleotide in der Bindung und damit die Dimerisierung von FokI - Domänen, in Doppelstrangbrüche 39 führt , die durch nicht-homologe Ende repariert werden kann Beitritt (NHEJ). NHEJ führt häufig Fehler, die in Insertionen oder Deletionen (indels) zur Folge haben. Indels kann durch Amplifizieren der Region um die Website TALEN Ziel identifiziert werden, und das resultierende Amplikon mit einem Restriktio...

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Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

Gene-Targeting-Mutagenese ist nun möglich, in einem breiten Spektrum von Organismen unter Verwendung von Genom Bearbeitungstechniken. Hier zeigen wir ein Protokoll für eine gezielte Genmutagenese mit Talens (Talens) in Astyanax mexicanus, Fischarten , die Oberflächenfische und cavefish enthält.

Genome Editing in<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; Verwendung von Transkriptionsaktivator- artigen Effektor Nukleasen (Talens)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

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Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

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Serie: Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the African clawed frog, Xenopus, a longstanding model organism for biomedical research. Traditional breeding schemes for creating homozygous mutant lines with CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis have several time-consuming and laborious steps. To facilitate the creation of mutant embryos, particularly to overcome the obstacles associated with knocking out genes that are essential for embryogenesis, a new method called leapfrogging was developed. This technique leverages the robustness of Xenopus embryos to &#34;cut and paste&#34; embryological methods. Leapfrogging utilizes the transfer of primordial germ cells (PGCs) from efficiently-mutagenized donor embryos into PGC-ablated wildtype siblings. This method allows for the efficient mutation of essential genes by creating chimeric animals with wildtype somatic cells that carry a mutant germline. When two F0 animals carrying &#34;leapfrog transplants&#34; (i.e., mutant germ cells) are intercrossed, they produce homozygous, or compound heterozygous, null F1 embryos, thus saving a full generation time to obtain phenotypic data. Leapfrogging also provides a new approach for analyzing maternal effect genes, which are refractory to F0 phenotypic analysis following CRISPR/Cas9 mutagenesis. This manuscript details the method of leapfrogging, with special emphasis on how to successfully perform PGC transplantation.

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Genes essential for survival pose technical hurdles for creating mutant lines. Leapfrogging circumvents lethality by combining genome editing with primordial germ cell transplantation to create wild-type animals carrying germline mutations. Leapfrogging also permits the efficient generation of homozygous null mutants in the F1 generation. Here, the transplantation step is demonstrated.

Keim Urzelle Transplantation für CRISPR/Cas9-basierte in Xenopus überspringen

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Forschung

Genetik

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development of a customizable platform to rapidly generate gene modifications in a wide variety of organisms, including zebrafish. CRISPR-based genome editing uses a single guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to a genomic DNA (gDNA) target of interest, where the Cas endonuclease generates a double-strand break (DSB). Repair of DSBs by error-prone mechanisms lead to insertions and/or deletions (indels). This can cause frameshift mutations that often introduce a premature stop codon within the coding sequence, thus creating a protein-null allele. CRISPR-based genome engineering requires only a few molecular components and is easily introduced into zebrafish embryos by microinjection. This protocol describes the methods used to generate CRISPR reagents for zebrafish microinjection and to identify fish exhibiting germline transmission of CRISPR-modified genes. These methods include in vitro transcription of sgRNAs, microinjection of CRISPR reagents, identification of indels induced at the target site using a PCR-based method called a heteroduplex mobility assay (HMA), and characterization of the indels using both a low throughput and a powerful next-generation sequencing (NGS)-based approach that can analyze multiple PCR products collected from heterozygous fish. This protocol is streamlined to minimize both the number of fish required and the types of equipment needed to perform the analyses. Furthermore, this protocol is designed to be amenable for use by laboratory personal of all levels of experience including undergraduates, enabling this powerful tool to be economically employed by any research group interested in performing CRISPR-based genomic modification in zebrafish.

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Targeted genome editing in the model system Danio rerio (zebrafish) has been greatly facilitated by the emergence of CRISPR-based approaches. Herein, we describe a streamlined, robust protocol for generation and identification of CRISPR-derived nonsense alleles that incorporates the heteroduplex mobility assay and identification of mutations using next-generation sequencing.

Effiziente Produktion und Kennzeichnung der CRISPR/Cas9 generiert gen Knockouts im Modellsystem Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

Verbesserte Genom Bearbeitung mit Cas9 Ribonucleoprotein in verschiedenen Zellen und Organismen

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and behavioral phenotypes. The remarkably diverse phenotypes that have evolved as marine populations adapt to countless freshwater environments, combined with the ability to cross marine and freshwater forms, provide a rare vertebrate system in which genetics can be used to map genomic regions controlling evolved traits. Excellent genomic resources are now available, facilitating molecular genetic dissection of evolved changes. While mapping experiments generate lists of interesting candidate genes, functional genetic manipulations are required to test the roles of these genes. Gene regulation can be studied with transgenic reporter plasmids and BACs integrated into the genome using the Tol2 transposase system. Functions of specific candidate genes and cis-regulatory elements can be assessed by inducing targeted mutations with TALEN and CRISPR/Cas9 genome editing reagents. All methods require introducing nucleic acids into fertilized one-cell stickleback embryos, a task made challenging by the thick chorion of stickleback embryos and the relatively small and thin blastomere. Here, a detailed protocol for microinjection of nucleic acids into stickleback embryos is described for transgenic and genome editing applications to study gene expression and function, as well as techniques to assess the success of transgenesis and recover stable lines.

Transgenic manipulations and genome editing are critical for functionally testing the roles of genes and cis-regulatory elements. Here a detailed microinjection protocol for the generation of genomic modifications (including Tol2-mediated fluorescent reporter transgene constructs, TALENs, and CRISPRs) is presented for the emergent model fish, the threespine stickleback.

Mikroinjektions für Transgenese und Genome Editing in Threespine Stichlinge

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Entwicklungsbiologie

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult forms has revealed the genetic basis of some of these differences. Less is known about how the populations differ at post-larval stages (at the onset of feeding). Such studies may provide insight into how cavefish survive through adulthood in their natural environment. Methods for comparing post-larval development in the laboratory require standardized aquaculture and feeding regimes. Here we describe how to raise fish on a diet of nutrient-rich rotifers in non-recirculating water for up to two-weeks post fertilization. We demonstrate how to collect post-larval fish from this nursery system and perform whole-mount immunostaining. Immunostaining is an attractive alternative to transgene expression analysis for investigating development and gene function in A. mexicanus. The nursery method can also be used as a standard protocol for establishing density-matched populations for growth into adults.

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

In this protocol, we demonstrate how to breed Astyanax mexicanus adults, raise the larvae, and perform whole-mount immunohistochemistry on post-larval fish to compare the phenotypes of surface and cave morphotypes.

Anhebung der mexikanischen Tetra Astyanax Mexicanus für Analyse der Post-larval Phänotypen und vollständig-hängen Immunohistochemistry

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, including eye degeneration, albinism, sleep loss, hyperphagia, and sensory processing. Species of cavefish from around the world display a convergent evolution of morphological and behavioral traits due to shared environmental pressures between different cave systems. Diverse cave species have been studied in the laboratory setting. The Mexican tetra, Astyanax mexicanus, with sighted and blind forms, has provided unique insights into biological and molecular processes underlying the evolution of complex traits and is well-poised as an emerging model system. While candidate genes regulating the evolution of diverse biological processes have been identified in A. mexicanus, the ability to validate a role for individual genes has been limited. The application of transgenesis and gene-editing technology has the potential to overcome this significant impediment and to investigate the mechanisms underlying the evolution of complex traits. Here, we describe a different methodology for manipulating gene expression in A. mexicanus. Approaches include the use of morpholinos, Tol2 transgenesis, and gene-editing systems, commonly used in zebrafish and other fish models, to manipulate gene function in A. mexicanus. These protocols include detailed descriptions of timed breeding procedures, the collection of fertilized eggs, injections, and the selection of genetically modified animals. These methodological approaches will allow for the investigation of the genetic and neural mechanisms underlying the evolution of diverse traits in A. mexicanus.&#160;

We describe approaches for the manipulation of genes in the evolutionary model system Astyanax mexicanus. Three different techniques are described: Tol2-mediated transgenesis, targeted manipulation of the genome using CRISPR/Cas9, and knockdown of expression using morpholinos. These tools should facilitate the direct investigation of genes underlying the variation between surface- and cave-dwelling forms.

Manipulation der Genfunktion in mexikanischen Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) throughout life, which proliferate to reform the ependymal tube and differentiate into lost neurons after spinal cord injury. Deciphering how these NSCs retain pluripotency post-development and proliferate upon spinal cord injury to reform the exact pre-injury structure can provide valuable insight into how mammalian spinal cords may regenerate as well as potential treatment options. Performing gene knock-outs in specific subsets of NSCs within a restricted time period will allow study of the molecular mechanisms behind these regenerative processes, without being confounded by development perturbing effects. Described here is a method to perform gene knock-out in axolotl spinal cord NSCs using the CRISPR-Cas9 system. By injecting the CAS9-gRNA complex into the spinal cord central canal followed by electroporation, target genes are knocked out in NSCs within specific regions of the spinal cord at a desired timepoint, allowing for molecular studies of spinal cord NSCs during regeneration.

Presented here is a protocol to perform time- and space-restricted gene knock-out in axolotl spinal cords by injecting CAS9-gRNA complex into the spinal cord central canal followed by electroporation.

Direkter Gene Knock-out von Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise heterozygous genetic modifications is challenging due to CRISPR-CAS9 mediated indel formation in the second allele. Here, we demonstrate a protocol to help overcome this difficulty by using two repair templates in which only one expresses the desired sequence change, while both templates contain silent mutations to prevent re-cutting and indel formation. This methodology is most advantageous for gene editing coding regions of DNA to generate isogenic control and mutant human stem cell lines for studying human disease and biology. In addition, optimization of transfection and screening methodologies have been performed to reduce labor and cost of a gene editing experiment. Overall, this protocol is widely applicable to many genome editing projects utilizing the human pluripotent stem cell model.

This protocol provides a method to facilitate the generation of defined heterozygous or homozygous nucleotide changes using CRISPR-CAS9 in human pluripotent stem cells.

Generierung definierter genomischer Modifikationen mit CRISPR-CAS9 in humanen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of genes. Prior research into this emerging model system capitalized on comprehensive genome-wide investigations that have identified numerous quantitative trait loci (QTL) associated with various cave-associated phenotypes. However, the ability to connect genes of interest to the heritable basis for phenotypic change remains a significant challenge. One technique that can facilitate deeper understanding of the role of development in troglomorphic evolution is whole-mount in situ hybridization. This technique can be implemented to directly compare gene expression between cave- and surface-dwelling forms, nominate candidate genes underlying established QTL, identify genes of interest from next-generation sequencing studies, or develop other discovery-based approaches. In this report, we present a simple protocol, supported by a flexible checklist, that can be widely adapted for use well beyond the presented study system. It is hoped that this protocol can serve as a broad resource for the Astyanax community and beyond.

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

This protocol enables visualization of gene expression in embryonic Astyanax cavefish. This approach has been developed with the goal of maximizing gene expression signal, while minimizing non-specific background staining.

Wholemount In Situ Hybridisierung für Astyanax Embryonen

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well as for modeling human diseases and testing therapeutic strategies. Recent advances in the use of designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system for site-specific genome engineering open the possibility to perform rapid targeted genome modification in virtually any laboratory species without the need to rely on embryonic stem (ES) cell technology. A genome editing experiment typically starts with identification of designer nuclease target sites within a gene of interest followed by construction of custom DNA-binding domains to direct nuclease activity to the investigator-defined genomic locus. Designer nuclease plasmids are in vitro transcribed to generate mRNA for microinjection of fertilized mouse oocytes. Here, we provide a protocol for achieving targeted genome modification by direct injection of TALEN mRNA into fertilized mouse oocytes.

Designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs) and transcription activator-like effector nucleases (TALENs) can be used to modify the genome of mouse preimplantation embryos by triggering both the nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR) pathways. These advances enable the rapid generation of mice with precise genetic modifications.

Maus-Genom-Engineering mit Designer Nukleasen

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

Genome Editing in

Zusammenfassung

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