This work received support through Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 1002 (subprojects A05 and B05 to S.E.L.) and KFO 155 (subproject 4 to S.E.L.), a Halbach Foundation award to S.E.L. supporting E.W.; a grant from the German Cardiac Society to S.B.; and a DAAD exchange program supporting T.K. as visitor at the University of Maryland. The research leading to these results has received funding from the European Community&#8217;s Seventh Framework Program FP7/2007-2013 under grant agreement No. HEALTH-F2-2009-241526, EUTrigTreat (to S.E.L.). S.E.L. is a principal investigator of the German Center of Cardiovascular Research (DZHK).

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The authors declare that no conflict of interest exists.

Obwohl Herzmuskelzellen wurden isoliert und untersucht seit Jahrzehnten 32, eine aktuelle Überprüfung ergab, dass eine gleichbleibend hohe Qualität myocyte Zellisolierungen bleiben 27-. Dies spiegelt relativ komplexe Protokolle für die Isolierung von primären Herzmuskelzellen gegenüber einem Mangel an gemeinsamen Standards Ansätze, gemeinsame Metadaten und transparente Zelle Qualitätsdokumentation. Zellisolierung Protokolle werden in der Regel von einzelnen Gruppen angepasst, produzieren unterschiedliche Ergebnisse von Zell isoliert, hängen von individuellen Modelleinstellungen (zB, Art, Alter, Herzerkrankungen nebeneinander), und sind in der Regel für bestimmte Versuchsbedingungen angepasst. Im Rahmen der quantitativen TATS Membran Studien und Protokolle hier vorgestellt, ein wesentlicher Niveau der Qualitätsbewertung und Dokumentation betrifft die konfokale Mikroskopie oder Superauflösung der einzelnen Zelle Membranstrukturen anfällig für metabolische und Isolation Protokoll abhängige Veränderungen, sowohlin AM oder VM. Wichtig ist, auch wenn hohe Ausbeuten an Zell Isolate vorschlagen gesunde, intakte Muskelzellen, müssen die Ermittler zu dokumentieren und kritisch jede einzelne Zelle sorgfältig gegen morphologischen Kriterien der Oberfläche und TATS Membranintegrität gegenüber nicht-spezifische Schäden durch Isolierungsverfahren gegen bestimmte Veränderungen durch verschiedene Arten zu beurteilen von Interventionen im Vergleich zu Bedingungen zu kontrollieren. Eine wichtige Größe bei Herzzellisolierung ist die spezifische Aktivität einer gegebenen Menge Kollagenase. Um eine neue Menge von Kollagenase zu wählen, sollten die enzymatische Aktivität der Kollagenase mehrere Proben gegeneinander durch die Auswertung Kardiomyozyten-Ausbeute und Qualität, und nach den Anweisungen des Herstellers getestet werden. Idealerweise wird eine neue Charge von Collagenase mit Kollagenase-Aktivität gegenüber den Vorjahren erfolgreich viele identifiziert (für erweiterte Evaluierung möglicher Enzymaktivitäten finden Sie in der &quot;Collagenase viel Auswahl-Werkzeug&quot; in der Materialien und Methoden Tabelle). Taken zusammen, quantitative Ansätze der Visualisierung TATS Membran hängen entscheidend von Zellisolierung Qualität und, umgekehrt, Herzzellisolierungen, die zu unspezifischen Membranschädigung durch TATS Mikroskopie dokumentiert sollten kritische Überprüfung und Korrektur der Isolationsverfahren auslösen. Da Zellisolierung Qualität und TATS Membran Visualisierung und Quantifizierung sind untrennbar miteinander verbunden, die in diesem Artikel beschriebenen Protokolle decken alle wichtigen Aspekte einer kontinuierlichen Strategie. Eine zusätzliche Herausforderung und gemeinsame Ausgabe von Herzuntersuchungen, Zellschäden und / oder Zellverlust entstehen durch metabolisch Kompromisse Interventionen zB nach Herzinfarkt 9, noch brauchen, um gegen mögliche unbeabsichtigte Beschädigung zB beurteilt werden, unbemerkt folgenden Luftembolie während der Zellisolierung. Isolierung von Herzmuskelzellen von erkrankten Herzen zu zusätzlichen, erheblichen Zellverlust führen und verminderte Zellausbeuten. Daher ComparIson der Gesamtzahl der isolierten intakten Zellen zwischen Kontrolle und kranken Herzen können sinnvoll sein, wenn der Zellisolierung und Zählung ist ständig durch standardisierte Protokolle eingesetzt. Folglich ist es wichtig, die Integrität der Zelle durch eine entsprechende Kontrollgruppe, die die bestmögliche myocyte Zellisolierung Qualität spiegelt beurteilen. Wichtig ist, dass einzelne Zellqualität und Lebendzellmikroskopie von gesunden gegenüber kranken gegenüber Muskelzellen versehentlich durch die Isolierung beschädigt Verfahren kann die Analyse von Membran TATS Netzwerke wesentlich beeinflussen. Die hier vorgestellten Protokolle betonen daher die Integrität und Stabilität des physiologischen Membrankomponenten während der Zellisolierung und Lebendzellmikroskopie von intakten Membranen. Der gesamte Workflow wird als eine kontinuierliche Strategie zu erreichen und zu bewahren intakt TATS Membrankomponenten unter Ausschluss beschädigte Zellen, da diese zeigen Isolierung abhängige Membran Artefakte wie gestört Membran Tubuli, membrane Bläschen, und veränderte TATS Netzwerke irrtümlich unter Kontrollbedingungen und Kompromisse weitere quantitative Analyse. Umgekehrt, sind die gleichen Strategien entscheidend für Interventionsstudien mit dem Potenzial, TATS Membranen, die sich kritisch auf aussagekräftigen Vergleich zwischen Kontrollen wahr gesunde gegenüber wahr erkrankten Zelle mit TATS Membran Veränderungen hängen zu stören. Darüber hinaus beschäftigen wir uns mit Verfahren, um die technisch viel anspruchsvoller Isolierung von AM Zellen zu erreichen. Trotz der Fortschritte und verbesserte Protokolle, ist es wichtig zu betonen, dass es nicht trivial ist, um qualitativ hochwertige Zell Isolierungen von VMs reproduzieren und noch weniger zuverlässig für AMS. Dies ist aufgrund der insgesamt geringeren Ertrag von AM Zellen, in denen auch kleine Fehler oder Abweichungen in der Zellisolierung kann zum Ausfall der Zellisolierung Uhr abzuschließen, während ein milder Grad der VM Zellschäden können in Zellsuspension weniger offensichtlich sein, aufgrund der relativ hohen Zell Zahlen im Vergleich zu Uhr. Seit AM Zellen könnten c werdennach der Isolierung urved, kann die Analyse durch mehrere ROIs von Vorteil sein, wie unter Schritt 4.3 beschrieben. Nach einer detaillierten Verfahren der Zellisolierung Schritte, bieten wir ein Protokoll für den direkten integralen Membranfärbung und konfokaler Bildgebung oder STED-Superauflösung von TATS Netzwerke sowohl für VMs und AMS. Diese Protokolle ermöglichen sowohl quantitative Analyse und Differenzierung von ausgewählten Komponenten der TATS Membranen durch vorher festgelegten Parametern. Im Vergleich zu VMs, sind die 3D-Organisation und funktionale Verhaltensweisen des Vorhof TATS Netzwerk AMS derzeit weniger verstanden. Die Verfahren, die Bild TATS Membranen in lebenden Zellen (Schritte 3.1 bis 3.7) wurden mit kommerziellen konfokalen (Tabelle der Materialien / Ausrüstung) und maßgeschneiderte STED Fluoreszenzmikroskope 9 entwickelt. Um die Einstellungen für Fluoreszenzmikroskop Bilderzeugung und quantitative Analyse TATS zu optimieren, von allgemeiner Bedeutung, die die folgenden Punkte: <ul><li> Ziel </strong&gt; Um kleine Details TATS Membranstrukturen lösen, empirisch testen, welche Zielsetzung die höchste Bildqualität bietet bei gleichzeitiger Konzentration mehrere Mikrometer tief in der Zelle. Bestimmte konfokale Mikroskope können besser mit Wasser oder Glycerol Ziele durchzuführen, im Gegensatz zu dem 63X 1,4 NA Öl-Objektiv verwendet. Ziele mit 100-facher Vergrößerung für Superresolution-STED-Mikroskopie verwendet wird, den Handel aus einer kleineren Sichtfeld für Nanometerauflösung 34. </li><li> Anregung und Gewinn Die optimalen Einstellungen der Erregerleistung und Detektorverstärkung hängen von Lichtwegs im Mikroskop, Laser-Leistung und Probeneigenschaften. Im Idealfall, Laserleistung und Verstärkung eingestellt werden, um die gesamte Bandbreite des Detektors zu nutzen, noch zu vermeiden Bildsättigung. Handels Mikroskopie-Software-Pakete bieten in der Regel Lookup-Tabellen, die die untere und obere Grenze des Dynamikbereichs zu visualisieren. Darüber hinaus minimiert Farbbleichung beschäftigen die bestmöglichen lAser Macht, die immer noch eine ausreichende Struktur TATS Membran Details. Auch sollte Erregerleistung niedrig genug sein, um zu vermeiden, kumulative Foto Schäden, die zu myocyte Kontrakturen und Tod. </li><li> Pixelgröße Verwenden Sie einen Pixelgröße mit Nyquist-kompatibel, etwa die Hälfte der mit den gegebenen Einstellungen erreichte Auflösung. Für die konfokale Abbildung eine Pixelgröße von 100 nm x 100 nm kompatibel ist, was auch begrenzen Bleichen. Superresolution-Mikroskopie für deutlich kleinere Pixelgrößen sind zB 20 nm x 20 nm für die STED-Mikroskopie 9 verwendet. </li><li> Verweilzeit Konfokale Mikroskope bieten eine Mittelungsfunktion. In der Regel verwenden die kürzest mögliche Pixelverweilzeit Bleich in Kombination mit Signalmittelung zB vermeiden, Line-Mittelung ≥ 8, um das Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu verbessern. </li><li> Dokumentieren Sie die Angewandte Mikroskopie Einstellungen Durch Meta-Daten Sobald die Einstellungen wieBilddetails TATS Membranstrukturen wurden auf einem bestimmten konfokalen Mikroskop optimiert, sicher und / oder dokumentieren Sie die Einstellungen (Protokoll Meta-Daten). Erwerben Sie alle Bilder in einem (oder zwischen) Gruppe (n) von Zellen mit dem gleichen Ziel, Erregerleistung, Verstärkung, Pixelgröße, Pixel Verweilzeit und Mittelungsfunktion. Gleich Abbildungsbedingungen ermöglichen den direkten Vergleich und die Quantifizierung in einem (oder zwischen) Gruppe (n) der Zellen. </li><li> Zur allgemeinen Orientierung und weitere Details zu Grundlagen und Anwendungen der konfokalen Mikroskopie beziehen sich auf das Handbook of Biological konfokale Mikroskopie (Pawley JB, 3. Auflage, 2006, Springer Science + Business Media, LLC). </li></ul> Im Gegensatz zu den direkten Analyse Strategien hier vorgestellten bisherigen Publikationen beschreiben TATS Membranen und krankheitsbedingte Veränderungen wurden regionale Gesamtanzeigen von T-Tubuli Dichte wie quantitative Strategie 16,17 oder indirekte regionale Strategien basierend auf Fourier transf verwendetormationen Analyse der quergestreiften Membran Signale, um T-Tubuli Komponente Regelmäßigkeit 7 zu bewerten. Im Gegensatz dazu sind die hier beschriebenen quantitativen Ansätzen direkt an einzelne TATS Komponenten bezogen und bieten eine Reihe von zusätzlichen Parametern, einschließlich Membranwerkeigenschaften und spezifische Komponenten wie der Anteil der A-Tubuli. Weiterhin kann die Netzwerkdichte TATS als normierte Länge des gesamten Skeletts extrahiert pro ROI-Bereich quantifiziert werden. Die Anzahl der Dreifachübergänge der drei einzelnen, kontinuierlich verbunden Tubulus Komponenten als Maß für die Komplexität der Verzweigungs TATS Membran Netzwerk verwendet werden. Wir stellen fest, dass eine Analyse der kleinsten TATS Komponenten hängt von den Färbeverfahren. Nach unserer Erfahrung sind 800 ul einer 50 uM di-8-ANEPPS Lösung ausreicht, um komplette TATS Netzwerke in einer Zelle Pellet mit 50.000 VM 9 Zellen färben. Wenn jedoch das Zellpellet enthält, eine geringere Anzahl von HerzmuskelzellenWenn leistungsstarke Fluoreszenzdetektoren vorhanden sind, und wenn die konfokale Abbildung der gesamten TATS Netzverteilung statt kleinsten Membrandaten und quantitative Veränderungen von Interesse sind, niedriger Farbstoffkonzentrationen können anhand von empirischen Tests verwendet werden. Schließlich kann ein Software-Makros für die beschriebene Analyse geschrieben werden die Bildverarbeitungsschritte zur Analyse großer Datenmengen, die für den Vergleich zwischen den verschiedenen Behandlungsgruppen (zum Beispiel Arzneimittel), Zelltypen, besonders nützlich ist, zu erleichtern automatisieren (zB AM gegen VM ) und pathophysiologischen Interventionen (zB Schein gegen Myokardinfarkt). Für die Bildanalyse von TATS Netzwerken wird die folgende Sequenz von Schritten aufgetragen Prinzip: 1) rollenden Ball Hintergrund-Subtraktion (4.5.1), um räumliche Schwankungen in der Hintergrundintensität zu entfernen; 2) lokale Kontrastverstärkung (4.5.2). 3) Bildglättung (4.5.3); 4) statistische Region Verschmelzung (4.5.4); 5) definiert, dieSchwelle von Bild Binarisierung (4.5.6); und 6) Berechnung der Skelettdaten (4.5.8). Ein entscheidender Schritt bei der Skelettierung von Fluoreszenzbildern TATS ist die in 6 gezeigte Bild Binarisierung. Die zugehörigen Schwellen Schritten letztlich bestimmen, welche wahre Membranstrukturen erkannt werden, um die darunterliegende Komponenten gegen TATS durch Fehler vom Hintergrundrauschen erkannt potentiell falsche Strukturen darstellen. Die Ermittlung der richtigen Schwelle für binäre Bildanalyse sollte mit den wahren TATS Membranstrukturen, die auf einem ausreichend hohen Signal-zu-Rausch-(SNR) jedes der konfokalen Mikroskopie und Hochauflösungs-Ansätze hängt entsprechen. Daher sollte eine ausreichende Bildqualität und anschließend mit ersten kritischen Urteil von Einzelzellqualität einschließlich Dokumentation von Hellfeld-Bildern kombiniert, wie beschrieben eingerichtet werden. Alternativen, um die Bildsegmentierung Protokoll für einen gegebenen Objektdatenausgang und / oder anzupassen physiologische Fragen sind Bilddekonvolution und andere Schwellenwertverfahren wie &quot;Otsu&quot; oder &quot;Iso-Daten&quot;, wie ImageJ Plugins zur Verfügung. Unabhängig von der letzten Segmentierungsverfahren halten wir den Vergleich zwischen extrahiert und Rohdaten von Bild-Overlay die obligatorische Qualitätskontrolle Schritt. Zusammenfassend wird morphologischen und Membranintegrität der einzelnen isolierten Myocyten ausreichende Färbung von intrazellulären Membranen TATS, Parameteroptimierung für die Fluoreszenzbildgebung und Lagerungssteuer extrahierter Gerippedaten tragen zur Qualität von Fluoreszenz TATS Bildern und quantitative Ergebnisse. Wenn größere Arten als Maus zur Zellisolierung verwendet wird, kann die Protokolle ohne weiteres entsprechend angepasst werden. Für die nächsten größeren Arten kann Rattenherzen mit einer stumpfen Kanüle 14 G (Außendurchmesser 2,1 mm) kanüliert und 8 ml / min durchströmt werden. Deutlich älter oder krank Herzen können auch größere Kanüle Größen erfordern. In der Gen-RAL kann Herzperfusion entweder mit konstantem Druck durchgeführt werden, zB unter Verwendung einer 1 m hohen Wassersäule zwischen dem Behälter und der Aorta oder durch konstante Strömung unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe. Zur Zellisolierung von kleinen Nagetieren Herzen wie Mäusen und Ratten kann konstant Fluss vorteilhaft sein, da Kollagenaseverdau schließlich stören koronaren Widerstandsgefäße, die zu übermäßiger Perfusionsraten aus undichten Gefäßbetten, die zu einem gewissen Grad durch konstante Durchflussprotokolle gesteuert wird. Im Gegensatz dazu ist konstanter Druck Perfusion vorteilhaft, wenn die Überwachung der Durchflussrate und korrekte Kanülierung eine Priorität, die zur Intervention Modelle mit veränderten Blutgefäßwiderstandsverhalten als auch für die Ausbildung der Zellisolierungsverfahren vorteilhaft ist. Wie oben dargelegt, ist ausreichend Zellqualität für quantitative Studien der endogenen Membransystemen sehr wichtig. Doch während der Herzdurchblutung und Kollagenaseverdau zahlreichen Faktoren CRitically Einfluss auf die Qualität der Zellisolation, die nie während der Protokolloptimierung oder Fehlersuche, 27 zu unterschätzen ist. Insbesondere sollte die Aktivität einer gegebenen Menge Collagenase für den spezifischen Gewebe von Interesse zB Atrien oder Ventrikel vor der Ausführung der Versuchs bona fide Studien zur Isolierung Bedingungen fest bestimmt den Rest der Studie aufrechterhalten wird. Außerdem wird die Wasserqualität, pH, Temperatur, Optimierung und Reinigung der Perfusion Einrichtung die Gefahr einer unbeabsichtigten Beschädigung durch Verunreinigungen und Embolien zu minimieren, und möglicherweise weiteren Faktoren überwacht werden müssen, um eine optimale homöostatischen Bedingungen während der Zellisolierung zu schaffen. BDM (2,3-Butandion-monoxim) ein reversibler Inhibitor der Myosin-ATPase Querbrücken wird üblicherweise während Gewebedissektion und Verdauung verwendet, um die Herzmuskelentspannung, die die Ausbeute an Zellisolierungen erhöht aufrechtzuerhalten. Dennoch müssen die Ermittler to beachten Sie, dass BDM kann unspezifische Phosphatase-Aktivitäten, die zu Off-Target-Effekte zB Hemmung der Na + / Ca 2 + Wechselströme unter bestimmten Bedingungen 33 auszuüben. Bei einigen Experimenten es vorteilhaft, BDM durch blebbistatin als Kardioplegie-Lösung, einem Inhibitor mit einer hohen Affinität für Myosin in mikromolaren Konzentrationen, ist jedoch toxisch und relativ teuer zu ersetzen sein könnte und kann andere Nebeneffekte haben. Ruhen gesunden Herzmuskelzellen sollten keine Kontraktionen in Abwesenheit von elektrischer Stimulation und solche Zellen von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden, zeigen. Auf der anderen Seite, Kardiomyozyten-Kontraktion und Relaxation als Reaktion auf elektrische Stimulation bei physiologischen extrazellulären Ca 2 +-Konzentrationen können verwendet werden, um normale kontraktile Verhalten als zusätzliche Maßnahme zu schaffen, um funktionelle Zellqualität und / oder Verhaltensstörungen in der Herzkrankheit und gesunden Kontroll beurteilen Zellen. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Zusammenfassend sind die Protokolle für die Einzelzellisolierung und quantitative hier beschriebenen Bildanalyse wurden erfolgreich für die konfokale Mikroskopie und Superresolution des TATS Membran-Netzwerk in VM 9 Zellen 21 sowie für die quantitative Analyse der Mikrotubuli-Netzwerke in der angewandten und AM feste Herzmuskelzellen (Daten nicht gezeigt). Diese und zukünftige Anwendungen der Protokolle kann Wege für eine Vielzahl von experimentellen Fragen wie die Charakterisierung von Membranen TATS in verschiedenen Entwicklungsstadien oder die Analyse von membranassoziierten Protein oder Organellen Strukturen, die die TATS Netzwerk Kontakt offen auszuüben stark lokalisierten, Domain-spezifische Signal Funktionen in AM und VM-Zellen.

Bei gesunden gestreiften Muskelzellen, sind röhrenförmige Membranstrukturen mit &quot;quer&quot; Orientierungen (T-Tubuli) senkrecht zu den Hauptzellenachse reichen. Folglich haben T-Tubuli als kontinuierliche Verlängerungen der Hauptmuskelzelle &quot;seitlich&quot; Oberflächenmembran (Sarkolemm), die tief in das Cytosol der Zelle zu durchdringen Zentrum gekennzeichnet. Die physiologische Rolle der T-Tubuli kontinuierlich mit der Außenfläche der Membran eine schnelle elektrische Kopplung der Fernintrazellulären Kompartimenten durch SER Organell Kontaktbereiche im gesamten verhältnismäßig großen Herzmuskelzellvolumens von nanometrischen Nähe Kopplung von spannungsaktivierten L-Typ-Ca 2 + gebildet Kanäle (Cav1.2) nach innen (I Ca) Aktivieren benachbarten Ryanodinrezeptor (RyR2) SER Ca 2 +-Releases. In ventrikulären Myozyten (VMs), die nicht-kontinuierliche Membran Kontakte (&quot;junctions&quot;) zwischen den Knoten-SER-Domänen und T-tubules sind gedacht, um Tausende von Einzelintrazelluläre Ca2 + Freisetzung Nanodomänen in jeder Zelle 1 zu steuern. Für jede gegebene Kontakt Domäne die nebeneinander liegenden Membranteile jeder der T-Tubuli und dem Peripheriegerät (junctions) SER etwa 15 nm nahe zueinander, also als Nanodomänen definiert. Dadurch werden sehr kleine zytoplasmatische einzelnen Teilräume getrennt, welche quasi-autonomen Zellenabteil Verhalten ermöglichen. Wenn ein eingehender Aktionspotential aktiviert Cav1.2-Kanäle in den T-Tubuli von VMs, einem relativ kleinen Ca 2 + Einstrom wird rasch zunehmen den Unterraum Ca 2 +-Konzentration [Ca2 +] S in der Größe Attolitervolumina Nanodomänen 1. Nächsten, aktiviert der S Zunahme [2 + Ca] Ca 2 + -regulierte Ryanodinrezeptoren (RyR2) in Nanometer in der Nähe nebeneinander SER Membran Kreuzung, und das Kupplungsvorgang in ganz elektrisch Paar auftrittd myocyte Nanodomänen. RyR2s auftreten als dichte Multi-Channel-Cluster mit einem geschätzten Stöchiometrie von 1 Cav1.2-Kanal für 5-10 RyR2 Kanäle 2. Seit der SER-to-Cytosol [Ca 2 +] Steigung ist sehr steil (Verhältnis 10 4: 1) und RyR2s funktionieren als Hoch Leitfähigkeit Ca2 +-Kanäle in Release funktionell gekoppelt Cluster, RyR2 Aktivierung führt zu einer quantitativ großen Ca 2 + Auslösestrom von T-Tubuli gekoppelt junctional SER Domains Erhöhung der lokalen Unterraum [Ca 2 +] S bis 100 um oder mehr innerhalb von 1-2 ms 3,4. Diese Herzsignalverstärkung Verhalten wird auch als Ca 2 + induzierten Ca2 + Freisetzung (ZPK) bezeichnet. Zusammengenommen T-Tubuli sind wesentliche Membranstrukturen, die während der Erregung und Kontraktion (EG) Kupplung schnell aktivieren Ca2 + Freisetzung Signale durch junktionale Nanodomänen SER Kontakte und Zell-breite IKRK. Neben T-Tubuli, axial Tubuluss (A-Tubuli) mit deutlich unterschiedlicher Ausrichtung parallel zu den Haupt (längs) Zellenachse durch Elektronenmikroskopie (EM), konfokale und 2-Photonen-Mikroskopie Studien dokumentiert. So wurde beispielsweise eine Zelle weiten kontinuierlichen Gitter von A-Tubuli zwischen Myofibrillen mit T-Tubuli in der Nähe von Sarkomer Z-Leitungen miteinander verbunden durch extrazelluläre Tracer und EM-Bildgebung des Anlage Meerschweinchen VMs 5 gezeigt. Mit extrazellulären Dextran-linked Fluoreszeinfärbung und leben 2-Photonen-Imaging von Ratten VMs, wurde eine komplexe netzartige 3D-Röhrchen Netzwerk visualisiert, bestehend aus ~ 60% T-Tubuli und ~ 40% A-Tubuli 6. Diese Studie nicht nur 3D-Visualisierung von reichlich A-Röhrchen geführt, sondern auch zu der Erkenntnis, dass die Schneiden zum EM-Visualisierung ist inhärent für die Analyse von komplexen und dynamischen Membran Netzwerke wie queraxialer Tubulus System (TATS) begrenzt. Folglich konfokale Live Cell Imaging TATS Membranen direkt mit Bunt di-8-ANNEPS entwickelt. Wenn Live CellTATS Netzwerke werden durch Fourier-Transformation analysiert werden, wird der reguläre Auftreten von T-Tubuli Komponenten im Raum in der Nähe Sarkomerlänge Z-Linien von dem Ensemble Leistungsspektrums von einem Bereich der quergestreiften Signale 7 reflektiert. Diese indirekte Analyse Strategie wurde verwendet, um die Zellweit regionale Veränderungen in TATS Komponente Regelmäßigkeit in Krankheitsmodellen 7 zu erkennen. Zum Beispiel verursacht shRNA vermittelten junctophilin-2 knock-down Herzinsuffizienz und die Isoform spezifische Protein-Mangel führte zu T-Tubuli Reorganisation mit Nanodomänen Ca 2 + Release 8 Dysfunktion. Wir haben vor kurzem erweitert die Analyse von Membran TATS Netze durch direkte quantitative Ansätze und weiter durch Superresolution-Mikroskopie an lebenden Zellen der einzelnen Komponenten in TATS Maus VMs, die stimulierte Emission Depletion (STED) Nanoskopie 9. Nanometrischen Bildauflösung für die direkte Analyse von kleineren Einzel TATS Komponenten, die eine 50:50 Verteilung der Quernähern erlaubtgegenüber dem axialen Röhrchen Orientierungen, quantitativ bestätigt zwei reichlich noch unterschiedlich orientierte Einzel TATS Komponenten bei gesunden Mäuseherzen 9. Diese Strategien werden in dem Protokoll weiter unten beschrieben werden. Während die physiologische Rolle der reichlich vorhandenen A-Tubulus Komponenten im erwachsenen Herzen hat rätselhafte blieb, haben EM-Studien SER mit A-Tubuli was darauf hindeutet, endogenen Ca2 + Freisetzung Nanodomänen in Meerschweinchen und Ratte VMs 5,10 verbundenen Membranstrukturen dokumentiert. Konfokale Analyse der Cav1.2 und RyR2 fanden eine hohe Kolokalisation bei A-Tubulus Gänge 10. Da ca. 20% der spontanen Ca2 + Funken in Ratten VMs entstand relativ weit entfernt von Z-Linie Streifen, wo T-Tubuli treten typischerweise auf, hat ein Argument gewesen, dass A-Röhrchen verbunden Nanodomänen kann in der Tat existieren und funktionieren, wie Ca2 + Freisetzung Websites 11,12. Interessant ist, dass T-Tubuli Bildung und Reifung ocCURS erst nach der Geburt und verläuft parallel zum Wachstum der Herzzellen, beispielsweise durch Austreiben von Vorläufer sarkolemmalen Einstülpungen an P5 und unreife verzweigte TATS Netzwerk Baugruppen bei P10 in 13 Mäuse. Es scheint, dass Junctophilin-2 ist besonders wichtig für postnatalen Reifung TATS Netzwerk seit shRNA knock-down verhindert die Verankerung der T-Tubuli Membranen SER Gänge, die zu verzögerten Ca2 + Freisetzung und pathologischen TATS Organisation, die mit unreifen A-Tubulus dominiert Architekturen VMs 13. Diese Beobachtungen können letztlich zu Proof-of-Concept, die T-Tubuli bilden durch Membranprozesse während eine Einstülpung-Tubuli kann durch zusätzliche oder sogar alternative intrazelluläre Mechanismen 14 morphen führen. Charakterisierung von Membran TATS Veränderungen der Herzkrankheit ist zu einem wichtigen Forschungsbereich für pathophysiologische Fragen. Erste Berichte in einem Hundemodell der Stimulation-induzierte Herz failure zeigte einen Verlust von T-Tubuli und Cav1.2 (I Ca) 15. Ein Schweinemodell des ischämischen Kardiomyopathie zeigte T-Tubuli Dichten reduziert und ein reduziertes Synchronität der intrazellulären Ca 2 + frei 16. Mit Hilfe eines spontan hypertensiven Ratten (SHR) Modell der Herzinsuffizienz, wurde ein Verlust von T-Tubuli mit reduzierter Nanodomänen Kopplung von Cav1.2 und RyR2 durch die vorgeschlagene Mechanismus der &quot;RyR2 verwaisen&quot; assoziiert 7. Ein Verlust der T-Tubuli hat auch in der Human VMs von ischämischen, erweiterte und hypertrophe Kardiomyopathie Proben 17 gezeigt. Darüber hinaus wurde eine Zunahme in A-Tubuli in Gewebeschnitten von menschlichen Kardiomyopathie 18 gemeldet. Nach Myokardinfarkt, zeigten wir eine Differentialmechanismus TATS Reorganisation in der Maus VMs mit einer signifikanten Abnahme der T-Tubuli im Gegensatz zu Erhöhungen der A-Tubulus Komponenten 9. Wichtig ist, Verbesserung der lokalen Membran dagegen durch Lebendzell superre erreichtLösung der STED-Mikroskopie konnten detaillierte quantitative Komponentenanalyse durch direkte Messungen, die erhebliche Vermehrung der A-Tubuli mit insgesamt steigt der TATS Netzlänge und Verzweigung Komplexität 9 zeigte. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass körperliches Training kann T-Tubuli Umbau bei Ratten nach Myokardinfarkt und 19, dass die kardiale Resynchronisationstherapie kann dazu führen, Umbau der T-Tubuli bei Hunden mit Vorhof tachypacing induzierten Herzinsuffizienz 20 rückwärts umzukehren. Zusammengenommen werden Studien sowohl in erkrankten menschlichen und tierischen VMs sowie mögliche therapeutische Interventionen wohl aus hochwertigen Zellisolationsverfahren und detaillierte quantitative Analyse Strategien profitieren, wie im Protokoll beschrieben und Ergebnisse Abschnitten. Darüber, wie kürzlich durch Seitenfläche demonstriert gegen TATS Membrantransport von KATP-Kanal-Isoformen 21, ist es wichtig, Vorhof m betrachtenyocytes (AMS) als biologisch verschieden sowie vergleichende Herzzellmodell gegenüber VMs. T-Tubuli wurden kürzlich bei Schafen und menschlichen BM 22 dokumentiert. Aktuelle Hinweise darauf, dass einige T-Tubuli existieren in AM-Zellen und in der Regel in größeren Säugetieren wie Schafe und Menschen, aber nicht in 23 kleine Nagetiere. Im Gegensatz zu VMs, AMS intrazelluläre Ca2 + Freisetzung wird durch Diffusion in Richtung der Zellenmitte, die in räumlicher und zeitlicher gekennzeichnet Ca 2 +-Gradienten führt zu 23 von der Zelloberfläche ausbreitet, auftritt. In diesem Rahmen erscheint es wichtig, die Mechanismen der intrazellulären Ca 2 +-Signalisierungs Instabilität für die gemeinsame Krankheitsformen wie Vorhofflimmern 24 aufzuklären. Zusammenfassend werden sowohl AM und VM Zellisolierung und jeweils für gesunde und kranke Herz üblicherweise verwendeten Protokolle. Nur wenn der Zellisolierung richtig gemacht wird, wie durch mikroskopische Dokumentation ausreichender Zellqualität erachtet wird, sollte AM und VM Proben ca seinrried vorwärts für die quantitative Analyse TATS. Dementsprechend sind die folgenden Abschnitte Protokoll entscheidend von Qualitätszelle Isolate aus der Maus oder anderen Spezies, gefolgt von Lebendzellmikroskopie zu intakten Membranen TATS analysieren. Wie zuvor erwähnt, Charakterisierung von Membranen TATS ist eine anspruchsvolle Forschungsbereich mit einem Hang zur Fixierung und Vorbereitung Artefakte 6, Membranveränderungen durch osmotische Änderungen und Auflösung Grenzen der konventionellen Lichtmikroskopie 9. Wir stellen fest, dass die jüngsten state-of-the-Art-Protokolle für die Isolierung von humanen BM für Ca2 + Imaging und Patch-Clamp-und Ratten VMs für die Zellkultur wurden bereits in dieser Zeitschrift veröffentlicht 25,26.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1552">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Chemicals and enzymes</td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td style="width:759px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">2,3-Butanedione monoxime</td>
			<td style="width:376px;">Sigma-Aldrich, Munich, Germany</td>
			<td style="width:113px;">B0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Bovine calf serum</td>
			<td style="width:376px;">Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td>
			<td style="width:113px;">SH30073</td>
			<td>Triple 0.1 &#181;m sterile filtered.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">CaCl2</td>
			<td style="width:376px;">Sigma-Aldrich, Munich, Germany</td>
			<td style="width:113px;">21115</td>
			<td style="width:759px;">Diluted 1:10 in MQ water to obtain 100 mM CaCl2 stock concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Collagenase type II</td>
			<td style="width:376px;">Worthington via Cell Systems, Troisdorf, Germany</td>
			<td style="width:113px;">on request</td>
			<td>Enzymatic activity depends on individual collagenase batches. Collagenase II&#160; and other enzyme activities (Caseinase, Clostripain, Tryptic) can be assessed in the &#34;collagenase lot selection tool&#34;. Determine cell yield and quality individually for each new lot of collagenase.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Glucose</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">HN06.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Heparin</td>
			<td style="width:376px;">Rotexmedica, Trittau, Germany</td>
			<td style="width:113px;">PZN-03862340</td>
			<td>Diluted in 0,9 % NaCl and injected subcutaneuosly in abdominal skin.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">HEPES</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">9105.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Forene 100% (V/V)</td>
			<td style="width:376px;">Abbott, Libertyville, IL, USA</td>
			<td style="width:113px;">B506</td>
			<td>Active agent: isoflurane, 250 ml. Use approximately 2 Vol% in air/oxygen dispenser instrument.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">KCl</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">6781.3</td>
			<td style="width:759px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">3904.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Laminin (2 mg/ml)</td>
			<td style="width:376px;">BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:113px;">354232</td>
			<td>Lamination is described under step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">MgCl2 &#183; 6 H2O</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">2189.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">MgSO4 &#183; 7 H2O</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">8283.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Na2HPO4 &#183; 2 H2O</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">4984.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">HN01.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Taurin</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">4721.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;"></td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Dyes</td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Di-8-ANEPPS</td>
			<td>Molecular Probes, Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:113px;">D-3167</td>
			<td>Stock solution 2 mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:376px;">Sigma-Aldrich, Munich, Germany</td>
			<td style="width:113px;">T8154</td>
			<td>Trypan blue is gently mixed 1:1 via tip-cut 1 ml plastic pipette with cell suspension prior to cell counting in Neubauer cytometer.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;"></td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Langendorff perfusion setup</td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Circulation thermostat</td>
			<td style="width:376px;">Lauda, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>Please refer to Louch et al. (JMCC 2011). Heat up thermostat und buffers in perfusion tubing to 37 &#176;C 15 min prior to use.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Flexible silicone tubing Tygon for peristaltic pump</td>
			<td style="width:376px;">VWR, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:113px;">224-2252</td>
			<td rowspan="2">Tubing needs to be changed regularly.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Flexible silicone tubing Tygon for thermostat</td>
			<td style="width:376px;">VWR, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:113px;">228-4340</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:304px;">Heating coil surroundung perfusion tubing</td>
			<td style="width:376px;">Rettberg, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td style="width:113px;">custom-made</td>
			<td style="width:759px;">Heating coil and tubing needs to be cleaned thoroughly via MQ water after using. Do not use detergents. Glass components should be bathed regularly&#160; in 10 mM NaOH overnight.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:376px;">Ismatec, Wertheim, Germany</td>
			<td style="width:113px;">ISM830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Three way stop cock Discofix C Luer Lock 10 cm</td>
			<td style="width:376px;">Braun, Melsungen, Switzerland</td>
			<td style="width:113px;">16500C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Three way stop cock Discofix 3SC</td>
			<td style="width:376px;">Braun, Melsungen, Switzerland</td>
			<td style="width:113px;">4095146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;"></td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Instruments</td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">42 mm glass coverslips</td>
			<td style="width:376px;">Menzel Gl&#228;ser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td>
			<td style="width:113px;">on request</td>
			<td>0.13 - 0.16 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Cannula 21G</td>
			<td style="width:376px;">Becton, Dickinson and Company, Franklin Lake, NY, USA</td>
			<td style="width:113px;">304432</td>
			<td>Cut to a length of ~ 5 mm, roughened with sandpaper.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Coverslips for Neubauer cytometer 24 x 24 mm</td>
			<td style="width:376px;">Menzel Gl&#228;ser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td>
			<td style="width:113px;">on request</td>
			<td>0.38 - 0.42 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Graefe forceps, 0.5 mm tips, slight curve</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11151-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">LSM 710 NLO</td>
			<td style="width:376px;">Carl Zeiss, Jena, Germany</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>63x 1.4 NA oil objective</td>
		</tr>
		<tr height="124">
			<td height="124" style="height:124px;width:304px;">Neubauer improved cytometer</td>
			<td style="width:376px;">Labor Optik, Friedrichsdorf, Germany</td>
			<td style="width:113px;">1100000</td>
			<td style="width:759px;">Counting procedure: Wipe cytometer and coverslip provided with the counting chamber with 70 % ethanol. Press coverslip gently on the counting chamber so that the two glass surfaces are in contact and Newton&#39;s rings can be observed. Subsequently, 10 - 20 &#181;l cell suspension can be applied to the edge of the coverslip to be sucked into the void by capillary action. Count the intact vs. defect myocytes using the squares of the cytometer grid which reflects 100 nl. Repeat counting procedure on the second grid provided on the cytometer. Calculate the density of cells in your original cell suspension by taking account of any dlutions and counting shortcuts.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">POC-R2 Imaging Chamber</td>
			<td style="width:376px;">Pecon, Erbach, Germany</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>Cell suspension volume: 800 &#181;l; desired plating density: ~ 1000 AM and ~ 10,000 VM</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Spring scissors, 8 mm blades straight, blunt</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:113px;">15025-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Student dumont #7 forceps, inox</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>91197-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Student iris scissors, curved, 11.5 cm</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>91461-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Student iris scissors, straight, 11.5 cm</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Student surcigal scissors, straight, sharp, 12 cm</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>91402-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Tissue forceps, 1x2 teeth, slim, 10 cm</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11023-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of tubular membrane networks in cardiac myocytes from atria and ventricles

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. While the outer surface membrane and associated TATS membrane components appear to be continuous, there are substantial differences in lipid and protein content. In ventricular myocytes (VMs), certain TATS components are highly abundant contributing to rectilinear tubule networks and regular branching 3D architectures. It is thought that peripheral TATS components propagate action potentials from the cell surface to thousands of remote intracellular sarcoendoplasmic reticulum (SER) membrane contact domains, thereby activating intracellular Ca2+ release units (CRUs). In contrast to VMs, the organization and functional role of TATS membranes in atrial myocytes (AMs) is significantly different and much less understood. Taken together, quantitative structural characterization of TATS membrane networks in healthy and diseased myocytes is an essential prerequisite towards better understanding of functional plasticity and pathophysiological reorganization. Here, we present a strategic combination of protocols for direct quantitative analysis of TATS membrane networks in living VMs and AMs. For this, we accompany primary cell isolations of mouse VMs and/or AMs with critical quality control steps and direct membrane staining protocols for fluorescence imaging of TATS membranes. Using an optimized workflow for confocal or superresolution TATS image processing, binarized and skeletonized data are generated for quantitative analysis of the TATS network and its components. Unlike previously published indirect regional aggregate image analysis strategies, our protocols enable direct characterization of specific components and derive complex physiological properties of TATS membrane networks in living myocytes with high throughput and open access software tools. In summary, the combined protocol strategy can be readily applied for quantitative TATS network studies during physiological myocyte adaptation or disease changes, comparison of different cardiac or skeletal muscle cell types, phenotyping of transgenic models, and pharmacological or therapeutic interventions.

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Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

In Herzmuskelzellen, röhrenförmigen Membranstrukturen intrazellulären Netzwerken. Wir beschreiben optimierte Protokolle für i) Isolierung von Myozyten aus Maus Herz einschließlich der Qualitätskontrolle, ii) Lebendzellfärbung für state-of-the-Art-Fluoreszenzmikroskopie, und iii) die direkte Bildanalyse, um die Komponente Komplexität und die Plastizität der intrazellulären Membran quantifizieren Netzwerken.

Analyse von Membranrohrnetze in Herzmuskelzellen von Vorhöfe und Kammern

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

analysis-tubular-membrane-networks-cardiac-myocytes-from-atria

Research

JoVE Journal

Bioengineering

20.4K Aufrufe.  Heart Research Center Goettingen.  In Herzmuskelzellen, röhrenförmigen Membranstrukturen intrazellulären Netzwerken. Wir beschreiben optimierte Protokolle für i) Isolierung von Myozyten aus Maus Herz einschließlich der Qualitätskontrolle, ii) Lebendzellfärbung für state-of-the-Art-Fluoreszenzmikroskopie, und iii) die direkte Bildanalyse, um die Komponente Komplexität und die Plastizität der intrazellulären Membran quantifizieren Netzwerken. 

Serie: Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular phenomena. To address this requirement, we have developed a plasma lithography technique to manipulate the cellular microenvironment by creating a patterned surface with feature sizes ranging from 100 nm to millimeters. The goal of this technique is to be able to study, in a controlled way, the behaviors of individual cells as well as groups of cells and their interactions.
This plasma lithography method is based on selective modification of the surface chemistry on a substrate by means of shielding the contact of low-temperature plasma with a physical mold. This selective shielding leaves a chemical pattern which can guide cell attachment and movement. This pattern, or surface template, can then be used to create networks of cells whose structure can mimic that found in nature and produces a controllable environment for experimental investigations. The technique is well suited to studying biological phenomenon as it produces stable surface patterns on transparent polymeric substrates in a biocompatible manner. The surface patterns last for weeks to months and can thus guide interaction with cells for long time periods which facilitates the study of long-term cellular processes, such as differentiation and adaption. The modification to the surface is primarily chemical in nature and thus does not introduce topographical or physical interference for interpretation of results. It also does not involve any harsh or toxic substances to achieve patterning and is compatible for tissue culture. Furthermore, it can be applied to modify various types of polymeric substrates, which due to the ability to tune their properties are ideal for and are widely used in biological applications. The resolution achievable is also beneficial, as isolation of specific processes such as migration, adhesion, or binding allows for discrete, clear observations at the single to multicell level.
This method has been employed to form diverse networks of different cell types for investigations involving migration, signaling, tissue formation, and the behavior and interactions of neurons arraigned in a network.

A versatile plasma lithography technique has been developed to generate stable surface patterns for guiding cellular attachment. This technique can be applied to create cell networks including those that mimic natural tissues and has been used for studying several, distinct cell types.

Plasma Lithography Oberflächenstrukturierung für die Erzeugung von Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Forschung

Biotechnik

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

Quantifizierung der globalen diastolischen Funktion durch kinematische Modellierung basierende Analyse der transmitralen Fluss über die diastolische Füllung Parametrisierte Formalismus

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range of 10-100 &#197;. By measuring the distances under various ligated conditions, conformational changes of the protein can be easily assessed. With LRET, a lanthanide, most often chelated terbium, is used as the donor fluorophore, affording advantages such as a longer donor-only emission lifetime, the flexibility to use multiple acceptor fluorophores, and the opportunity to detect sensitized acceptor emission as an easy way to measure energy transfer without the risk of also detecting donor-only signal. Here, we describe a method to use LRET on membrane proteins expressed and assayed on the surface of intact mammalian cells. We introduce a protease cleavage site between the LRET fluorophore pair. After obtaining the original LRET signal, cleavage at that site removes the specific LRET signal from the protein of interest allowing us to quantitatively subtract the background signal that remains after cleavage. This method allows for more physiologically relevant measurements to be made without the need for purification of protein.

We describe here an improved Luminescence Resonance Energy Transfer (LRET) method where we introduce a protease cleavage site between the donor and acceptor fluorophore sites. This modification allows us to obtain specific LRET signals arising from membrane proteins of interest, allowing for the study of membrane proteins without protein purification.

Lumineszenz-Resonanzenergietransfer zu Konformationsänderungen in Membranproteinen in Säugerzellen exprimiert Studieren

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these procedures in basic research and preclinical drug development, it is important to develop protocols for automated generation and analysis under standardized conditions. Here, we present a technique to generate engineered heart tissue (EHT) from cardiomyocytes of different species (rat, mouse, human). The technique relies on the assembly of a fibrin-gel containing dissociated cardiomyocytes between elastic polydimethylsiloxane (PDMS) posts in a 24-well format. Three-dimensional, force-generating EHTs constitute within two weeks after casting. This procedure allows for the generation of several hundred EHTs per week and is technically limited only by the availability of cardiomyocytes (0.4-1.0 x 106/EHT). Evaluation of auxotonic muscle contractions is performed in a modified incubation chamber with a mechanical interlock for 24-well plates and a camera placed on top of this chamber. A software controls a camera moved on an XYZ axis system to each EHT. EHT contractions are detected by an automated figure recognition algorithm, and force is calculated based on shortening of the EHT and the elastic propensity and geometry of the PDMS posts. This procedure allows for automated analysis of high numbers of EHT under standardized and sterile conditions. The reliable detection of drug effects on cardiomyocyte contraction is crucial for cardiac drug development and safety pharmacology. We demonstrate, with the example of the hERG channel inhibitor E-4031, that the human EHT system replicates drug responses on contraction kinetics of the human heart, indicating it to be a promising tool for cardiac drug safety screening.

Here, we show the generation of human engineered heart tissue from induced pluripotent stem cells (hiPSC)-derived cardiomyocytes. We present a method to analyze contraction force and exemplary alteration of contraction pattern by the hERG channel inhibitor E-4031. This method shows high level of robustness and suitability for cardiac drug screening.

Automatische Kontraktions Analyse menschlicher Engineered Herzgewebe für Herz Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the interface with a liquid core. The latter is removed post-printing, leaving behind a hollow tube. Integrating an additive manufacturing technique (like the one described here with tailor-made [bio]inks, which structurally and biochemically mimic the native extracellular matrix [ECM]) is an important step towards advanced tissue engineering. However, precise fabrication of well-defined structures requires tailored fabrication strategies optimized for the material in use. Therefore, it is sensible to begin with a set-up that is customizable, simple-to-use, and compatible with a broad spectrum of materials and applications. This work presents an easy-to-manufacture core/shell nozzle with luer-compatibility to explore core/shell printing of woodpile structures, tested with a well-defined, alginate-based scaffold material formulation.

Presented here is a simple-to-use, core/shell, three-dimensional bioprinting set-up for one-step fabrication of hollow scaffolds, suitable for tissue engineering of vascular and other tubular structures.

Core/Shell DruckGerüste für Tissue Engineering von Röhrenstrukturen

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

Optical Imaging of Isolated Murine Ventricular Myocytes

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances in calcium sensitive dyes have permitted the robust optical recording of single cell calcium dynamics, recording of robust transmembrane optical voltage signals has remained difficult. Arguably, this is because of the low single to noise ratio, phototoxicity, and photobleaching of traditional potentiometric dyes. Therefore, single cell voltage measurements have long been confined to the patch clamp technique which while the gold standard, is technically demanding and low throughput. However, with the development of novel potentiometric dyes, large, fast optical responses to changes in voltage can be obtained with little to no phototoxicity and photobleaching. This protocol describes in detail how to isolate adult murine myocytes which can be used for cellular shortening, calcium, and optical voltage measurements. Specifically, the protocol describes how to use a ratiometric calcium dye, a single-excitation calcium dye, and a single excitation voltage dye. This approach can be used to assess the cardiotoxicity and arrhythmogenicity of various chemical agents. While phototoxicity is still an issue at the single cell level, methodology is discussed on how to reduce it.

We present the methodology for the isolation of murine myocytes and how to obtain voltage or calcium traces simultaneously with sarcomere shortening traces using fluorescence photometry with simultaneous digital cell geometry measurements.

Optische Bildgebung von isolierten ventrikulären Myozyten

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances ...

Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), which are developed towards the goal of clinical use. HiPSC-derived cardiomyocytes, endothelial cells, and vascular mural cells are mixed with gel matrix and then poured into a polydimethylsiloxane (PDMS) tissue mold with rectangular internal staggered posts. By culture day 14 ECTs mature into a 1.5 cm x 1.5 cm mesh structure with 0.5 mm diameter myofiber bundles. Cardiomyocytes align to the long-axis of each bundle and spontaneously beat synchronously. This approach can be scaled up to a larger (3.0 cm x 3.0 cm) mesh ECT while preserving construct maturation and function. Thus, mesh-shaped ECTs generated from hiPSC-derived cardiac cells may be feasible for cardiac regeneration paradigms.

The present protocol generates mesh-shaped engineered cardiac tissues containing cardiovascular cells derived from human induced pluripotent stem cells to allow the investigation of cell implantation therapy for heart diseases.

Vorbereitung von Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues derived from Human iPS Cells for In Vivo Myokard repair

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Einzelzellige optische Aktionspotentialmessung in human induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical stimuli. The current understanding of fibrotic processes, including cardiac fibrosis, remains poor, which hampers the development of new anti-fibrotic therapies. Controllable and reliable human model systems are crucial for a better understanding of fibrosis pathology. This is a highly reproducible and scalable protocol to generate engineered connective tissues (ECT) in a 48-well casting plate to facilitate studies of fibroblasts and the pathophysiology of fibrotic tissue in a 3-dimensional (3D) environment. ECT are generated around the poles with tunable stiffness, allowing for studies under a defined biomechanical load. Under the defined loading conditions, phenotypic adaptations controlled by cell-matrix interactions can be studied. Parallel testing is feasible in the 48-well format with the opportunity for the time-course analysis of multiple parameters, such as tissue compaction and contraction against the load. From these parameters, biomechanical properties such as tissue stiffness and elasticity can be studied.

Presented here is a protocol to generate engineered connective tissues for a parallel culture of 48 tissues in a multi-well plate with double poles, suitable for mechanistic studies, disease modeling, and screening applications. The protocol is compatible with fibroblasts from different organs and species and is exemplified here with human primary cardiac fibroblasts.

Fibroblasten-abgeleitetes Human Engineered Connective Tissue für Screening-Anwendungen

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Developing Drosophila melanogaster Models for Imaging and Optogenetic Control of Cardiac Function

Using Drosophila melanogaster (fruit fly) as a model organism has ensured significant progress in many areas of biological science, from cellular organization and genomic investigations to behavioral studies. Due to the accumulated scientific knowledge, in recent years, Drosophila was brought to the field of modeling human diseases, including heart disorders. The presented work describes the experimental system for monitoring and manipulating the heart function in the context of a whole live organism using red light (617 nm) and without invasive procedures. Control over the heart was achieved using optogenetic tools. Optogenetics combines the expression of light-sensitive transgenic opsins and their optical activation to regulate the biological tissue of interest. In this work, a custom integrated optical coherence tomography (OCT) imaging and optogenetic stimulation system was used to visualize and modulate the functioning D. melanogaster heart at the 3rd instar larval and early pupal developmental stages. The UAS/GAL4 dual genetic system was employed to express halorhodopsin (eNpHR2.0) and red-shifted channelrhodopsin (ReaChR), specifically in the fly heart. Details on preparing D. melanogaster for live OCT imaging and optogenetic pacing are provided. A lab-developed integration software processed the imaging data to create visual presentations and quantitative characteristics of Drosophila heart function. The results demonstrate the feasibility of initiating cardiac arrest and bradycardia caused by eNpHR2.0 activation and performing heart pacing upon ReaChR activation.

Developing Drosophila melanogaster Models for Imaging and Optogenetic Control of Cardiac Function

The present protocol describes the generation of Drosophila melanogaster expressing eNpHR2.0 or ReaChR opsins in the heart for OCT imaging and optogenetic heart pacing. Detailed instructions for Drosophila OCT imaging and heart beating modulation, including the simulation of restorable heart arrest, bradycardia, and tachycardia in live animals at different developmental stages, are reported.