Name: laser-assisted cytoplasmic microinjection in livestock zygotes
Uploaded: 2016-10-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
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Work related to this technique is supported by NIH/NICHD RO1 HD070044 and USDA/NIFA Hatch projects W-3171 and W-2112.

1. Mikropipette Produktion <ol><li> Injection Mikro <ol><li> Legen Sie ein Borosilicatglas Kapillare (Außendurchmesser (OD): 1,0 mm, Innendurchmesser (ID): 0,75 mm) in einer Mikropipette Abzieher (in der Mitte der rechten und linken Kapillar-Inhaber) und verriegeln. </li><li> Verwenden Sie ein geeignetes Programm, um die Glaskapillare zu ziehen, so dass es in einer dünnen Spitze mit einem langen tapper führt. (Beispiel: Wärme: 825; Ziehen: 30; Geschwindigkeit: 120; Zeit: 200; Druck: 500). </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die gezogen Pipetten aus dem Gerät und legen Sie es auf einem Mikroschmiede in einer horizontalen Position. </li><li> Bringen Sie die gezogen Pipette und die Mikroschmiede Heizwendel mit seiner Glasperle in den Fokus. Verwenden Sie die Okularstrichplatte die gewünschte Dicke und bewegen Sie die Pipette horizontal, bis die Heizwendel das Ziel erreicht Innendurchmesser (5 &amp; mgr; m) zu messen. </li><li> Stellen Sie die Hitze auf etwa 45% und vorsichtig auf die Pipette bringen, so dass es den Faden berührt. Aktivieren Sie kurz die Heizung. Dies wkrank schmelzen leicht die Pipette, so dass es auf den Faden und beim Abkühlen haftet, wird die Pipette an der Kontaktstelle brechen einen geraden Schnitt zu erzeugen. Hinweis: Die entsprechende Temperatureinstellung in diesem Schritt Schlüssel ist , da die Temperaturen zu hoch wird die Pipette Biegung machen und damit ein gerader Schnitt wird nicht möglich sein und die Temperaturen zu niedrig wird nicht ausreichen , um die Pipette (1A) zu schmelzen. </li><li> Machen Sie einen ungefähren Winkel von 30 ° in der Nähe der Pipettenspitze durch etwa 10 &amp; mgr; m entfernt von der Heizwendel zu positionieren. Stellen Sie die Temperatur auf 60%, und aktivieren Sie die Heizung. Hinweis: Dies wird die Pipette über das Filament biegen. Dieser Winkel ist erwünscht , so dass die Spitze der Nadel an der Oberfläche der Einspritzplatte ist parallel , wenn in den Injektor (1B) montiert ist . </li><li> Griff Mikroinjektionspipette mit Vorsicht , da sie extrem scharf und zerbrechlich sind. </li></ol></li><li> Halten Mikro <ol><li> Legen Sie eine borosilicaß Glaskapillare (OD: 1,0 mm, ID: 0,75 mm) in einer Mikropipette Abzieher (in der Mitte der rechten und linken Kapillar-Inhaber) und sperren. </li><li> Verwenden Sie ein geeignetes Programm, um die Glaskapillare zu ziehen, so dass es mit einem langen, selbst in einer dünnen Spitze führt verjüngen und parallele Wände (Beispiel: Wärme: 815; Ziehen: 20; Geschwindigkeit: 140; Zeit: 175; Druck: 200). </li><li> die gezogener Pipette aus dem Abzieher Gerät und legen Sie es auf der Mikroschmiede Halter in horizontaler Lage vorsichtig entfernen. Stellen Sie den Fokus auf die Heizwendel und Pipette. </li><li> Verwenden Sie die Okularstrichplatte die Pipette Durchmesser und bewegen Sie die Pipette bis zu seinem Durchmesser über dem Glühfaden erreicht 180 &amp; mgr; m zu messen. </li><li> Bei der angegebenen Größe, markieren Sie die Glaskapillare mit einer Diamantspitze Stift und drücken Sie dann vorsichtig an der Spitze zog das Glas zu brechen. Dies sollte in einem geraden Schnitt (1C) zur Folge haben . </li><li> Bewegen der Pipette in eine vertikale Position mit ihrer Spitze nahe des Filaments. Stellen Sie die Temperatur<html> der Mikroschmiede bis 60%. </li><li> Feuerpolitur der Spitze der Pipette mit Standardtechniken 7 , bis sie eine ID von 40 &amp; mgr; m erreicht. Verwenden Sie das Okularstrichplatte die ID (1D) zu überprüfen. </li><li> Stellen Sie sich einen Winkel auf der Pipette. <ol><li> Bringen der Pipette zurück in eine horizontale Position etwa 10 &amp; mgr; m entfernt von dem Filament und 5 mm von seiner Spitze. Stellen Sie die Temperatur auf etwa 60% und aktivieren Sie die Heizung, um die Pipette über den Faden zu biegen. Weiterhin Erhitzen , bis ein gewünschter Winkel (von etwa 30 o) erreicht wird. Überprüfen Sie den Winkel visuell (Abbildung 1E). Hinweis: Die Pipette ist gewöhnlich angebracht an den Mikroinjektor bei einem ungefähren Winkel von 60 o gegenüber dem Boden des Einspritzschale. Die Spitze der Pipette gebogen ist, so dass es an den Boden der Schale parallel ist, die für die korrekte Einspritzung des Embryos in seinem mittleren Ebene notwendig ist. </li></ol></li></ol></li></ol>le &quot;&gt; 2. Setup-Mikromanipulator <ol><li> Überprüfen Sie, ob die Mikroinjektoren voll mit Öl beladen sind und dass es keine Luftblasen im System (Blasen im Mikroinjektors verhindern feine Steuerung der Einspritzung). </li><li> Überprüfen Sie, ob die Mikromanipulatoren in der Mittelstellung sind. Dies wird für eine breite Palette von Bewegung der Pipetten ermöglichen. </li><li> Legen Sie die Haltepipette in den linken Mikromanipulator Halter und den Injektionspipette in die richtige Mikromanipulationshalter. </li><li> Lassen Sie das Öl in die Pipetten durch Kapillarität eingeben und prüfen, ob das System richtig, indem Öl nach oben und unten in der Pipette arbeitet die Mikroinjektors Kontrollen verwenden. Hinweis: Wenn es keine Bewegung von Öl in den Nadeln ist, könnte es eine Verstopfung sein. In diesem Fall verwenden Sie eine neue Nadel. </li><li> Verwenden Sie die Mikromanipulator steuert die Pipetten in die Mitte des Mikroskops Blickfeld zu bringen. Mit 4-fache Vergrößerung, überprüfen Sie, dass die Mikropipettenspitzen im richtigen Winkel sind (S.arallel an den Boden der Schale). Hinweis: Eine korrekte Einstellung der Nadeln für eine erfolgreiche Injektion Schlüssel ist, und für die Ergebnisse Konsistenz. </li><li> Kalibrieren Sie das Lasersystem im Anschluss an die Kalibrierung Handbuch des Herstellers. </li></ol> 3. Herstellung von Injektions Dish (Abbildung 2) <ol><li> Ein 50 &amp; mgr; l Tropfen erwärmt (37 ° C) SOF-HEPES (Zusammensetzung detailliert in dem Abschnitt Materialien), ergänzt mit 20% fötalem Rinderserum (FBS) auf der Mitte des Deckels einer 100 mm Petrischale. Legen Sie 1 - 2 ul Tropfen der Lösung auf die Injektion Tropfen injiziert nahe zu sein. Stellen Sie sicher, dass die Embryonen kühlen nicht unter RT unten. Hinweis: In diesem Protokoll werden wir die Dextran-Red-Farbstoff in die Injektionslösung hinzufügen zu können, die Stelle der Injektion zu visualisieren und sie verfolgen später. </li><li> Decken die Tropfen in der Einspritzplatte mit etwa 10 ml Mineralöl. </li><li> Setzen Sie die Injektion Schale auf der Bühne des inversen Mikroskop und bringen die pipettes in die Injektions Tropfens. Überprüfen Sie, ob die Nadeln innerhalb des Tropfens im Fokus sind. Passen Sie ihre Höhe der Mikromanipulator Kontrollen nach Bedarf verwenden. </li><li> Verwendung eines Mikrodispenser laden etwa 20 - 30 Zygoten (17-20 Stunden nach der Befruchtung (hpf)) in der oberen Seite des Injektions Tropfens. Führen Injektion bei Raumtemperatur, so dass die Anzahl von Embryonen in der Injektionsabfall durch die Geschwindigkeit bestimmt, bei der die Person, die sie zu injizieren. Nicht mehr Embryonen als die Last, die in 30 Minuten injiziert werden kann. <ol><li> Um die Embryonen in die Mikrodispenser laden, drücken Sie den Kolben vollständig und tauchen Sie die Spitze in die Lösung, um die Embryonen enthalten. Berühren Sie die Embryonen werden mit der Spitze der Glaskapillare (einer zu der Zeit) aufgenommen und langsam loslassen der Kolben, so dass jeder Embryo in die Kapillare gelangt. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Embryonen aufgenommen oder der Mikrodispenser Kapazität voll ist. </li><li> Zum Lösen der geladenen Embryonen, drücken Sie den Kolben vorsichtig, bis das gesamte Volumen containing die Embryonen aus der Kapillare freigesetzt. </li></ol></li></ol> 4. Mikroinjektions <ol><li> Mit dem 4X Ziel, laden Sie die Lösung in die Injektionspipette injiziert werden durch Unterdruck Anwendung (Absaugen). Laden ausreichende Lösung einzuspritzen 2 - 3 Zygoten. Gehen Sie dann auf die Injektion Tropfen. </li><li> Innerhalb der Injektion Tropfen, bewegen Sie die Haltepipette so die Spitze zu einer Zygote nahe kommt. Bewerben Unterdruck (absaugen) mit dem Halte Mikroinjektors so die Zygote in die Haltepipette und Wechsel zu einem 20x-Objektiv befestigt wird. </li><li> Sobald der Zygote an die Haltepipette befestigt ist, überprüfen Sie die Qualität der Injektion Pipette vorsichtig auf die Embryo bewegen, ohne sie zu lösen. Eine gute Qualität Zygote sollten die beiden Polkörper (wenn auch manchmal nur einer zu sehen ist) und ein homogenes Zytoplasma. Nicht abnormal Zygoten (3A) zu injizieren. </li><li> Falls notwendig, die Position des Embryos für eine korrekte EinspritzungLage. Eine gute Positionierung wäre, dass in der es etwas Platz zwischen dem ZP und dem PM, so dass die PM nicht durch den Laser beschädigt werden. </li><li> Überprüfen Sie, ob die Injektionspipette auf den Embryo Mittelebene angeordnet ist, indem Sie an der Zygote an der Injektionsstelle zu berühren. Wenn es nicht auf seine Mittelebene ist, wird die Nadel dazu neigen, den Embryo zu machen, anstatt Einstich drehen. Stellen Sie die Höhe der Injektionspipette nach Bedarf. </li><li> Machen Sie ein Loch in der ZP mit einem Laser (3B). <ol><li> Mit Hilfe der Software statt des Lasers die Laser Absehen in der ZP, wo das Loch wird (auf der gegenüberliegenden Seite, wo der Embryo in die Haltepipette angebracht ist) hergestellt werden. Mit dem Laser-Steuerungsfenster klicken Sie auf den Feuerknopf. Stellen Sie sicher, dass die Größe des Lochs groß genug ist, um eine Öffnung in der ZP für die Nadel zu schaffen passieren, ohne die Uhr zu beschädigen (Beispiel: 0,662 ms Pulsbreite / 6,9 um Lochgröße). </li></ol></li><li> Übergeben Sie die Injektionsnadeldurch das Loch in dem ZP und kontaktieren den PM. Weiter die Pipette nach vorne schieben , bis die Nadel ¾ der Weg in den Embryo (3C) ist. </li><li> Beobachten der Position des Meniskus an der lösungs Öl Interphase, wie dies konsequent verwendet wird, um Injektionsvolumens steuern. </li><li> Bewerben Unterdruck (absaugen) an der Injektionspipette, die in PM und dem Zytoplasma in die Injektionsnadel abgesaugt führen wird. Fortfahren, bis die Bewegung des Zytoplasma in die Nadel beschleunigt oder wenn Zytoplasma Inhalt mit Injektionslösung vermischen gesehen werden kann. Dies zeigt an Bruch des PM (Figur 3D). </li><li> Injizieren Sie die Cytoplasma-Gehalt durch die Lösung in das Zytoplasma der Zygote durch Anlegen positiver Druck (Injektion), bis der Meniskus an der Lösung Öl Interphase folgte wieder ein Durchmesser von Zygote Äquivalent hinter dem Ausgangspunkt fortgeschritten ist. Hinweis: Unter unseren Bedingungen, diese Vertresentiert etwa 7 pl der injizierten Lösung (Abbildung 3E). </li><li> Wechseln Sie in ein 4X Ziel und bewegen Sie den injizierten Embryo / s an der unteren Seite des Injektions Tropfens. Lassen Sie den Embryo durch Anlegen positiver Druck auf die Halte Mikroinjektors. Halten Sie die nicht injizierten Embryonen auf der Oberseite und die injizierten, die auf der unteren Seite des Tropfens zu helfen, den Überblick über die injizierten / nicht injizierten Embryonen und effizienter zu arbeiten. </li></ol> 5. Embryo Recovery and Injection Ergebnisse <ol><li> Machen Sie 3 Tropfen von ca. 200 &amp; mgr; l in einer neuen Schale mit vorgewärmten SOF-HEPES. Sammeln Sie die injizierten Embryonen mit dem Mikrodispenser (wie oben beschrieben). Waschen Sie die injizierten Embryonen, indem sie durch die 3 SOF-HEPES bewegenden Tropfen. </li><li> Zählen Sie die Embryonen während der Mikroinjektions lysiert und verwerfen sie. Hinweis: Ein lysiert Zygote von einem intakten ein leicht unterschieden werden kann, da die erste durchscheinend erscheint, die ganze ZP ausfüllen, und es hat in der Regel zytoplasmatischeGehalt an der Außenseite des Embryos undicht. </li><li> Überprüfen Sie optional die Mikroinjektionseffizienz eines Fluoreszenzmikroskop. Beachten Sie, dass UV-Licht Exposition Embryo Schäden hervorrufen kann, die weitere Entwicklung auswirken können. </li><li> Kulturgruppen von 25 injizierten Embryonen in 50 ul Tropfen Kalium simplex Optimierungsmedium (KSOM) , ergänzt mit 4 mg / ml Rinderserumalbumin (BSA) unter Mineralöl bei 38,5 ° C, 5% CO 2 in Luft und Feuchtigkeit bis zur Sättigung. </li><li> Ergänzen Sie die Kulturmedien mit 5% FBS zwei Tage nach der Injektion. </li><li> Prüfen Blastozyste (BL) Raten von 7 Tagen nach der Injektion. Berechnen BL Raten als Gesamtzahl der Blastozyste Embryonen / Gesamtzahl der Embryonen kultiviert in diesem Tropfen. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Mikroinjektion von Zygoten ist ein gut eingeführtes Verfahren für Lösungen in Säugetierembryonen einzuführen. Mit einigen Variationen in Abhängigkeit von der Art und dem Ziel des Experiments kann diese Technik allgemein verwendet werden. Wir zeigen, wie intrazytoplasmatischer Mikroinjektions auszuführen unter Verwendung eines Lasers den Eingang eines stumpfen Enden Mikropipette zu unterstützen. Zygotes bestimmter Tierarten (wie Rinder, Schafe und Schwein) haben einen dunklen Zytoplasma, die Visualisierung der In...

Zytoplasmatischen Mikroinjektion von 1-Zelle Embryonen ist eine sehr leistungsfähige Technik. Es kann für die Bereitstellung jede Lösung in den Embryo, beispielsweise verwendet werden, Gen-Knock-outs erzeugen Genfunktion zu untersuchen oder Gen-edited Tiere zu erzeugen. Die meisten landwirtschaftlich relevanten Nutztier Zygoten haben eine sehr hohe Fettsäurezusammensetzung, die ihr Zytoplasma opak und dunkel 1 macht. Sie haben auch eine ziemlich elastische Plasmamembran (PM). Diese Eigenschaften machen die Mikroinjektion unter Verwendung von herkömmlichen pronukleären / Zytoplasma-Injektion wie bei Nagetieren herausfordernd und oft ungenau verwendet. Zytoplasmatischen Mikroinjektions hat Vorteile gegenüber pronukleären Mikroinjektions da es einfacher ist , durchzuführen und verursacht auch weniger Schaden an den injizierten Embryos, in höheren Lebensfähigkeit resultierende 2. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, eine erfolgreiche Methode für die Bereitstellung von Lösungen in das Zytoplasma von landwirtschaftlichen Nutztieren Zygoten zu demonstrieren. Zu können auszuführenzytoplasmatischen Mikroinjektions mit hoher Effizienz auf Nutztieren Embryonen wird ein Laser zur Erzeugung eines Lochs in der Zona pellucida (ZP) und dann eine blunt-end Glasnadel für die Mikroinjektion verwendet. Diese Strategie zielt darauf ab, die mechanische Schäden am Embryo während der Injektion eingeprägt zu reduzieren. Dann Aspiration von zytoplasmatischen Inhalten in der Injektionsnadel erlaubt, effizient und sicher ein Bruch des PM zu gewährleisten, dass die Lösung in das Cytoplasma des Embryos geliefert wird. Diese Technik wurde in Rinderembryonen zu liefern siRNA in die zygotic Zytoplasma 3,4 und erzeugen Mutationen mit Hilfe der Cluster regelmäßig voneinander beabstandete kurze Palindrom Wiederholungen (CRISPR) / CRISPR zugehörige System 9 (Cas9) System 5 bereits erfolgreich eingesetzt. Es ist auch geeignet (mit geringfügigen Modifikationen) bovine Cumulus-umschlossenen Oozyten 6 einzuspritzen. Hier haben wir unsere Injektionsprotokoll liefert einen Farbstoff beschreiben kann, dass anwendbar sein, jede des zu injizierendenired Lösung in die Zygote, und zeigen, dass diese Technik unter Verwendung minimaler Lyse verursacht und beeinflusst nicht die frühe Embryoentwicklung.

<table><tbody><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillary</td><td>Sutter instruments</td><td>B100-75-10</td><td>These capillaries are used for making the holding and injecting pipettes. Any thick/standard wall borosilicate tubing without filament can be used.</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-9</td><td>Equipped with 10X magnification lense.</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Nikon/ Narishige</td><td>NT88-V3</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Nikon</td><td>TE2000-U</td><td>Equipped with 4X, 20X lenses and with a laser system.</td></tr><tr><td>Laser</td><td>Research Instruments</td><td>7-47-500</td><td>Saturn 5 Active laser.</td></tr><tr><td>Microdispenser</td><td>Drummond</td><td>3-000-105</td><td>The microdispenser is used to move the embryos. A p10 pipette can also be used but loading as minimal volume as possible.</td></tr><tr><td>100 x 15 mm culture dish</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td>Use the lid of the dish to make the injection plate since they have lower walls and will make positioning and moving of the micromanipulator easier. The lid of a 60 mm culture dish can also be used.</td></tr><tr><td>35 mm culture dish</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>These dishes are used for culturing the embryos in 50 &amp;mu;l drops covered with mineral oil. Alternatively, a 4 well dish can also be used. Regardless of the dish chosen to culture the embryos, they always have to be equilibrated in the incubator for at least 4 hr prior to transfering the embryos to them.</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Sanyo</td><td>MCO-19AIC</td><td>Any incubator that can be set to 38.5 &amp;deg;C, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; conditions can be used.</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td>Used for visualizing the embryos in the culture drops and during washes. Any stereomicroscope with a 10X magnification can be used.</td></tr><tr><td>Control Unit HT</td><td>Minitube</td><td>12055/0400</td><td>Heating system attached to the stereomicroscope.</td></tr><tr><td>Heated Microscope Stage</td><td>Minitube</td><td>12055/0003</td><td>Heating system attached to the stereomicroscope.</td></tr><tr><td>Dextran-Red</td><td>Thermo Scientific</td><td>D1828</td><td>A sterile 10 mg/ml solution is used to inject.</td></tr><tr><td>Mineral Oil</td><td>sigma</td><td>M8410</td><td>Keep the mineral oil at room temperature and&amp;nbsp; protected from light using foil paper.</td></tr><tr><td>KSOMaa Evolve Bovine</td><td>Zenit</td><td>ZEBV-100</td><td>Supplemented with 4 mg/ml BSA. KSOM plates for embryo culture should be equilibrated in an incubator for at least 4 hr before use.</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini-Bio</td><td>100-525</td><td>Use a stem-cell qualified FBS.</td></tr><tr><td>Zygotes</td><td></td><td></td><td>Zygotes are injected 17 - 20 hpf and can be &lt;em&gt;in-vitro&lt;/em&gt;- or &lt;em&gt;in-vivo&lt;/em&gt;-derived.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>Final concentration: 107.7 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>Final concentration: 7.16 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>Final concentration: 1.19 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>M2393</td><td>Final concentration: 0.49 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>Sodium DL-lactate</td><td>Sigma</td><td>L4263</td><td>Final concentration: 5.3 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>Final concentration: 1.71 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>D-(&amp;minus;)-Fructose&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F3510</td><td>Final concentration: 0.5 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>Final concentration: 21 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>MEM-NEAA</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>BME-EAA</td><td>Sigma</td><td>B6766</td><td>Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Final concentration: 4 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Sigma</td><td>P4562</td><td>Final concentration: 0.33 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050</td><td>Final concentration: 1 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-3311</td><td>Final concentration: 1 mg/ml. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma</td><td>G-1397</td><td>Final concentration: 5 &amp;mu;g/ml. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>Water for embryo transfer</td><td>Sigma</td><td>W1503</td><td>Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>SOF-HEPES medium</td><td>Made in the lab</td><td></td><td>pH 7.3 - 7.4, 280 &amp;plusmn; 10 mOs. Filter sterilized through a 22 &amp;mu;m filter can be stored in the fridge at 4 &amp;deg;C for 1 month. Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use.</td></tr></tbody></table>

laser-assisted cytoplasmic microinjection in livestock zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

Laser-assisted cytoplasmatische Mikroinjektions ist ein leistungsfähiges und zuverlässiges Protokoll - Lösungen in das Zytoplasma der tierischen Zygoten zu liefern. 3 zeigt eine allgemeine Übersicht der Zygoten vor und nach der Injektion sowie die Gesamt Umriß der Technik. Dextran-Rot wird als Injektion Lösung verwendet, um Tracking-Seite von Spritzgieß- und Effizienz und Genauigkeit ermöglichen. Erfolgreiche Lieferung der Lösung ist in Figur 4 ...

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Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

Lasergestützte Zytoplasmatischen Mikroinjektions in Vieh Zygotes

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Research

JoVE Journal

Genetics

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Serie: Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.

Studying the earliest events of preneoplastic cell progression and innate immune cell interaction is pivotal to understand and treat cancer. Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformations and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells in zebrafish larvae.

Live-Imaging von angeborenen Immun und Präkanzeröse Zell-Interaktionen unter Verwendung eines induzierbaren Gal4 / UAS Expression System in Zebrafisch-Larven Haut

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Lieferung von Nukleinsäuren durch Embryomikroinjektion in der weltweiten Agrar Pest Insekt,<em&gt; Mittelmeerfruchtfliege</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Genetik

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Mikroinjektion von mRNA und Morpholino Antisense Oligonukleotide in Zebrafisch-Embryonen.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Biologie

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryos, um Gene Function Analyze

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning fundamental developmental biology through to large-scale genetic and chemical screens. However, many experiments, especially those related to infection and xenograft models, rely on microinjection and imaging of embryos and larvae, which are laborious techniques that require skill and expertise. To improve the precision and throughput of current microinjection techniques, we developed a series of microstructured devices to orient and stabilize zebrafish embryos at 2 days post fertilization (dpf) in ventral, dorsal, or lateral orientation prior to the procedure. To aid in the imaging of embryos, we also designed a simple device with channels that orient 4 zebrafish laterally in parallel against a glass cover slip. Together, the tools that we present here demonstrate the effectiveness of photolithographic approaches to generate useful devices for the optimization of zebrafish techniques.

Microinjection of zebrafish embryos and larvae is a crucial but challenging technique used in many zebrafish models. Here, we present a range of microscale tools to aid in the stabilization and orientation of zebrafish for both microinjection and imaging.

Mikrostrukturierter Apparate für optimierte Mikroinjektion und Imaging von Zebrafischlarven

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

Zygote Microinjection for Creating Gene Cassette Knock-in and Flox Alleles in Mice

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily produced by electroporation of CRISPR factors (and single-stranded oligo DNA donors) into the zygote. In contrast, gene cassette (&#62;1 kb) knock-in and floxed mice are mainly generated by microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors into zygotes. Genome editing technologies have also increased the flexibility of genetically modified mice production. It is now possible to introduce the intended mutations in the target genomic regions in a number of beneficial inbred mouse strains. Our team has produced over 200 gene cassette knock-in mouse lines, and over 110 floxed mouse lines by zygote microinjection of CRISPR-Cas9 following requests from several countries, including Japan. Some of these genome editing used BALB/c, C3H/HeJ, and C57BL/6N inbred strains, however most used C57BL/6J. Unlike the electroporation method, genome editing by zygote microinjection in various inbred strains of mice is not that easy. However, gene cassette knock-in and floxed mice on single inbred genetic backgrounds are as critical as genetic humanized, fluorescent reporter, and conditional knockout mouse models. Therefore, this article presents the protocol for the zygote microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors in C57BL/6J mice for generating gene cassette knock-in and floxed mice. This article exclusively focuses on nuclear injection rather than cytoplasmic injection. In addition to zygote microinjection, we outline the timeline for the production process and peripheral techniques such as induction of superovulation and embryo transfer.

The present protocol describes zygote microinjection of CRISPR-Cas9 and donor DNA to efficiently produce gene cassette knock-in and floxed mice.

Zygoten-Mikroinjektion zur Erzeugung von Genkassetten-, Knock-in- und Flox-Allelen in Mäusen

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

Hochdurchsatz-Mikroinjektionen von Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the host chromosome and is passed on to progeny. Thus, they are ideal vectors for creation of stable cell lines, in vivo delivery of indicators, and transduction of single cell fertilized eggs to create transgenic animals. However, mouse fertilized eggs and early stage embryos are protected by the zona pellucida, a glycoprotein matrix that forms a barrier against lentiviral gene delivery. Lentiviruses are too large to penetrate the zona and are typically delivered by microinjection of viral particles into the perivitelline cavity, the space between the zona and the embryonic cells. The requirement for highly skilled technologists and specialized equipment has minimized the use of lentiviruses for gene delivery to mouse embryos. This article describes a protocol for permeabilizing the mouse fertilized eggs by perforating the zona with a laser. Laser-perforation does not result in any damage to embryos and allows lentiviruses to gain access to embryonic cells for gene delivery. Transduced embryos can develop into blastocyst in vitro, and if implanted in pseudopregnant mice, develop into transgenic pups. The laser used in this protocol is effective and easy to use. Genes delivered by lentiviruses stably incorporate into mouse embryonic cells and are germline transmittable. This is an alternative method for creation of transgenic mice that requires no micromanipulation and microinjection of fertilized eggs.

Mouse fertilized eggs and early stage embryos are protected by the zona pellucida, a glycoprotein matrix that forms a barrier against gene delivery. This article describes a protocol for perforating the zona with a laser to transduce embryonic cells with lentiviral vectors and to create transgenic mice.

Lasergestützte Lentivirale gen Lieferung an Maus befruchtete Eier

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the ...

Zebrafish Microinjection Techniques

One of the major advantages to working with zebrafish (Danio rerio) is that their genetics can be easily manipulated by microinjection of early stage embryos. Using this technique, solutions containing genetic material or knockdown constructs are delivered into the blastomeres: the embryonic cells sitting atop the yolk of the newly fertilized egg. Delivery into the cytoplasm is achieved either through direct injection into the blastomere, or via natural cytoplasmic movements that occur after a solution is injected into the yolk. Successful genetic manipulations are usually followed by quantification of embryonic phenotypes in order to elucidate the genetic mechanisms of development.
This video will provide an introduction to carrying out microinjections in zebrafish embryos. The discussion begins with a review of the essential tools for the technique, including the injection apparatus and the microinjector, which controls fluid movement with pressure pulses of air. Next, important preparatory steps are demonstrated, such as the pouring of agar plates to stabilize embryos during injection and calibration of the microinjection apparatus. The injection procedure is then presented along with tips on when and where injections should be performed. Finally, applications of the microinjection technique are discussed, including gene overexpression via mRNA injection, gene silencing by delivery of antisense morpholino oligonucleotides, and the generation of transgenic zebrafish using specially engineered plasmid DNA.

Introduction to Microinjection of Early Zebrafish Embryos

Mikroinjektionsverfahren für Zebrabärblings-Embryonen

One of the major advantages to working with zebrafish (Danio rerio) is that their genetics can be easily manipulated by microinjection of early stage ...

Lehre

JoVE Science Education

Grundlegende Biologie

Modellorganismen II: Maus, Zebrabärbling und Küken

Laser-Assisted Lentiviral Gene Delivery: A Technique to Permeabilize Mouse Fertilized Eggs to Facilitate Lentiviral Gene Delivery

Source: Martin, N. P., et al. <a href="https://www.jove.com/v/58327">Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs.</a> J. Vis. Exp. (2018).
In this video, we demonstrate the laser-assisted permeation of the protective layer of zona pellucida in mouse fertilized eggs for facilitating lentiviral gene delivery. Lentivirus enables the generation of transgenic animals with a gene of interest stably integrated into their genome.

Lasergestützte lentivirale Genabgabe: Eine Technik zur Permeabilisierung von befruchteten Eiern von Mäusen, um die lentivirale Genübertragung zu erleichtern

Source: Martin, N. P., et al. Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs. J. Vis. Exp. (2018).
In this video, we demonstrate the ...