Work related to this technique is supported by NIH/NICHD RO1 HD070044 and USDA/NIFA Hatch projects W-3171 and W-2112.

1. Mikropipette Produktion <ol><li> Injection Mikro <ol><li> Legen Sie ein Borosilicatglas Kapillare (Außendurchmesser (OD): 1,0 mm, Innendurchmesser (ID): 0,75 mm) in einer Mikropipette Abzieher (in der Mitte der rechten und linken Kapillar-Inhaber) und verriegeln. </li><li> Verwenden Sie ein geeignetes Programm, um die Glaskapillare zu ziehen, so dass es in einer dünnen Spitze mit einem langen tapper führt. (Beispiel: Wärme: 825; Ziehen: 30; Geschwindigkeit: 120; Zeit: 200; Druck: 500). </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die gezogen Pipetten aus dem Gerät und legen Sie es auf einem Mikroschmiede in einer horizontalen Position. </li><li> Bringen Sie die gezogen Pipette und die Mikroschmiede Heizwendel mit seiner Glasperle in den Fokus. Verwenden Sie die Okularstrichplatte die gewünschte Dicke und bewegen Sie die Pipette horizontal, bis die Heizwendel das Ziel erreicht Innendurchmesser (5 &amp; mgr; m) zu messen. </li><li> Stellen Sie die Hitze auf etwa 45% und vorsichtig auf die Pipette bringen, so dass es den Faden berührt. Aktivieren Sie kurz die Heizung. Dies wkrank schmelzen leicht die Pipette, so dass es auf den Faden und beim Abkühlen haftet, wird die Pipette an der Kontaktstelle brechen einen geraden Schnitt zu erzeugen. Hinweis: Die entsprechende Temperatureinstellung in diesem Schritt Schlüssel ist , da die Temperaturen zu hoch wird die Pipette Biegung machen und damit ein gerader Schnitt wird nicht möglich sein und die Temperaturen zu niedrig wird nicht ausreichen , um die Pipette (1A) zu schmelzen. </li><li> Machen Sie einen ungefähren Winkel von 30 ° in der Nähe der Pipettenspitze durch etwa 10 &amp; mgr; m entfernt von der Heizwendel zu positionieren. Stellen Sie die Temperatur auf 60%, und aktivieren Sie die Heizung. Hinweis: Dies wird die Pipette über das Filament biegen. Dieser Winkel ist erwünscht , so dass die Spitze der Nadel an der Oberfläche der Einspritzplatte ist parallel , wenn in den Injektor (1B) montiert ist . </li><li> Griff Mikroinjektionspipette mit Vorsicht , da sie extrem scharf und zerbrechlich sind. </li></ol></li><li> Halten Mikro <ol><li> Legen Sie eine borosilicaß Glaskapillare (OD: 1,0 mm, ID: 0,75 mm) in einer Mikropipette Abzieher (in der Mitte der rechten und linken Kapillar-Inhaber) und sperren. </li><li> Verwenden Sie ein geeignetes Programm, um die Glaskapillare zu ziehen, so dass es mit einem langen, selbst in einer dünnen Spitze führt verjüngen und parallele Wände (Beispiel: Wärme: 815; Ziehen: 20; Geschwindigkeit: 140; Zeit: 175; Druck: 200). </li><li> die gezogener Pipette aus dem Abzieher Gerät und legen Sie es auf der Mikroschmiede Halter in horizontaler Lage vorsichtig entfernen. Stellen Sie den Fokus auf die Heizwendel und Pipette. </li><li> Verwenden Sie die Okularstrichplatte die Pipette Durchmesser und bewegen Sie die Pipette bis zu seinem Durchmesser über dem Glühfaden erreicht 180 &amp; mgr; m zu messen. </li><li> Bei der angegebenen Größe, markieren Sie die Glaskapillare mit einer Diamantspitze Stift und drücken Sie dann vorsichtig an der Spitze zog das Glas zu brechen. Dies sollte in einem geraden Schnitt (1C) zur Folge haben . </li><li> Bewegen der Pipette in eine vertikale Position mit ihrer Spitze nahe des Filaments. Stellen Sie die Temperatur<html> der Mikroschmiede bis 60%. </li><li> Feuerpolitur der Spitze der Pipette mit Standardtechniken 7 , bis sie eine ID von 40 &amp; mgr; m erreicht. Verwenden Sie das Okularstrichplatte die ID (1D) zu überprüfen. </li><li> Stellen Sie sich einen Winkel auf der Pipette. <ol><li> Bringen der Pipette zurück in eine horizontale Position etwa 10 &amp; mgr; m entfernt von dem Filament und 5 mm von seiner Spitze. Stellen Sie die Temperatur auf etwa 60% und aktivieren Sie die Heizung, um die Pipette über den Faden zu biegen. Weiterhin Erhitzen , bis ein gewünschter Winkel (von etwa 30 o) erreicht wird. Überprüfen Sie den Winkel visuell (Abbildung 1E). Hinweis: Die Pipette ist gewöhnlich angebracht an den Mikroinjektor bei einem ungefähren Winkel von 60 o gegenüber dem Boden des Einspritzschale. Die Spitze der Pipette gebogen ist, so dass es an den Boden der Schale parallel ist, die für die korrekte Einspritzung des Embryos in seinem mittleren Ebene notwendig ist. </li></ol></li></ol></li></ol>le &quot;&gt; 2. Setup-Mikromanipulator <ol><li> Überprüfen Sie, ob die Mikroinjektoren voll mit Öl beladen sind und dass es keine Luftblasen im System (Blasen im Mikroinjektors verhindern feine Steuerung der Einspritzung). </li><li> Überprüfen Sie, ob die Mikromanipulatoren in der Mittelstellung sind. Dies wird für eine breite Palette von Bewegung der Pipetten ermöglichen. </li><li> Legen Sie die Haltepipette in den linken Mikromanipulator Halter und den Injektionspipette in die richtige Mikromanipulationshalter. </li><li> Lassen Sie das Öl in die Pipetten durch Kapillarität eingeben und prüfen, ob das System richtig, indem Öl nach oben und unten in der Pipette arbeitet die Mikroinjektors Kontrollen verwenden. Hinweis: Wenn es keine Bewegung von Öl in den Nadeln ist, könnte es eine Verstopfung sein. In diesem Fall verwenden Sie eine neue Nadel. </li><li> Verwenden Sie die Mikromanipulator steuert die Pipetten in die Mitte des Mikroskops Blickfeld zu bringen. Mit 4-fache Vergrößerung, überprüfen Sie, dass die Mikropipettenspitzen im richtigen Winkel sind (S.arallel an den Boden der Schale). Hinweis: Eine korrekte Einstellung der Nadeln für eine erfolgreiche Injektion Schlüssel ist, und für die Ergebnisse Konsistenz. </li><li> Kalibrieren Sie das Lasersystem im Anschluss an die Kalibrierung Handbuch des Herstellers. </li></ol> 3. Herstellung von Injektions Dish (Abbildung 2) <ol><li> Ein 50 &amp; mgr; l Tropfen erwärmt (37 ° C) SOF-HEPES (Zusammensetzung detailliert in dem Abschnitt Materialien), ergänzt mit 20% fötalem Rinderserum (FBS) auf der Mitte des Deckels einer 100 mm Petrischale. Legen Sie 1 - 2 ul Tropfen der Lösung auf die Injektion Tropfen injiziert nahe zu sein. Stellen Sie sicher, dass die Embryonen kühlen nicht unter RT unten. Hinweis: In diesem Protokoll werden wir die Dextran-Red-Farbstoff in die Injektionslösung hinzufügen zu können, die Stelle der Injektion zu visualisieren und sie verfolgen später. </li><li> Decken die Tropfen in der Einspritzplatte mit etwa 10 ml Mineralöl. </li><li> Setzen Sie die Injektion Schale auf der Bühne des inversen Mikroskop und bringen die pipettes in die Injektions Tropfens. Überprüfen Sie, ob die Nadeln innerhalb des Tropfens im Fokus sind. Passen Sie ihre Höhe der Mikromanipulator Kontrollen nach Bedarf verwenden. </li><li> Verwendung eines Mikrodispenser laden etwa 20 - 30 Zygoten (17-20 Stunden nach der Befruchtung (hpf)) in der oberen Seite des Injektions Tropfens. Führen Injektion bei Raumtemperatur, so dass die Anzahl von Embryonen in der Injektionsabfall durch die Geschwindigkeit bestimmt, bei der die Person, die sie zu injizieren. Nicht mehr Embryonen als die Last, die in 30 Minuten injiziert werden kann. <ol><li> Um die Embryonen in die Mikrodispenser laden, drücken Sie den Kolben vollständig und tauchen Sie die Spitze in die Lösung, um die Embryonen enthalten. Berühren Sie die Embryonen werden mit der Spitze der Glaskapillare (einer zu der Zeit) aufgenommen und langsam loslassen der Kolben, so dass jeder Embryo in die Kapillare gelangt. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Embryonen aufgenommen oder der Mikrodispenser Kapazität voll ist. </li><li> Zum Lösen der geladenen Embryonen, drücken Sie den Kolben vorsichtig, bis das gesamte Volumen containing die Embryonen aus der Kapillare freigesetzt. </li></ol></li></ol> 4. Mikroinjektions <ol><li> Mit dem 4X Ziel, laden Sie die Lösung in die Injektionspipette injiziert werden durch Unterdruck Anwendung (Absaugen). Laden ausreichende Lösung einzuspritzen 2 - 3 Zygoten. Gehen Sie dann auf die Injektion Tropfen. </li><li> Innerhalb der Injektion Tropfen, bewegen Sie die Haltepipette so die Spitze zu einer Zygote nahe kommt. Bewerben Unterdruck (absaugen) mit dem Halte Mikroinjektors so die Zygote in die Haltepipette und Wechsel zu einem 20x-Objektiv befestigt wird. </li><li> Sobald der Zygote an die Haltepipette befestigt ist, überprüfen Sie die Qualität der Injektion Pipette vorsichtig auf die Embryo bewegen, ohne sie zu lösen. Eine gute Qualität Zygote sollten die beiden Polkörper (wenn auch manchmal nur einer zu sehen ist) und ein homogenes Zytoplasma. Nicht abnormal Zygoten (3A) zu injizieren. </li><li> Falls notwendig, die Position des Embryos für eine korrekte EinspritzungLage. Eine gute Positionierung wäre, dass in der es etwas Platz zwischen dem ZP und dem PM, so dass die PM nicht durch den Laser beschädigt werden. </li><li> Überprüfen Sie, ob die Injektionspipette auf den Embryo Mittelebene angeordnet ist, indem Sie an der Zygote an der Injektionsstelle zu berühren. Wenn es nicht auf seine Mittelebene ist, wird die Nadel dazu neigen, den Embryo zu machen, anstatt Einstich drehen. Stellen Sie die Höhe der Injektionspipette nach Bedarf. </li><li> Machen Sie ein Loch in der ZP mit einem Laser (3B). <ol><li> Mit Hilfe der Software statt des Lasers die Laser Absehen in der ZP, wo das Loch wird (auf der gegenüberliegenden Seite, wo der Embryo in die Haltepipette angebracht ist) hergestellt werden. Mit dem Laser-Steuerungsfenster klicken Sie auf den Feuerknopf. Stellen Sie sicher, dass die Größe des Lochs groß genug ist, um eine Öffnung in der ZP für die Nadel zu schaffen passieren, ohne die Uhr zu beschädigen (Beispiel: 0,662 ms Pulsbreite / 6,9 um Lochgröße). </li></ol></li><li> Übergeben Sie die Injektionsnadeldurch das Loch in dem ZP und kontaktieren den PM. Weiter die Pipette nach vorne schieben , bis die Nadel ¾ der Weg in den Embryo (3C) ist. </li><li> Beobachten der Position des Meniskus an der lösungs Öl Interphase, wie dies konsequent verwendet wird, um Injektionsvolumens steuern. </li><li> Bewerben Unterdruck (absaugen) an der Injektionspipette, die in PM und dem Zytoplasma in die Injektionsnadel abgesaugt führen wird. Fortfahren, bis die Bewegung des Zytoplasma in die Nadel beschleunigt oder wenn Zytoplasma Inhalt mit Injektionslösung vermischen gesehen werden kann. Dies zeigt an Bruch des PM (Figur 3D). </li><li> Injizieren Sie die Cytoplasma-Gehalt durch die Lösung in das Zytoplasma der Zygote durch Anlegen positiver Druck (Injektion), bis der Meniskus an der Lösung Öl Interphase folgte wieder ein Durchmesser von Zygote Äquivalent hinter dem Ausgangspunkt fortgeschritten ist. Hinweis: Unter unseren Bedingungen, diese Vertresentiert etwa 7 pl der injizierten Lösung (Abbildung 3E). </li><li> Wechseln Sie in ein 4X Ziel und bewegen Sie den injizierten Embryo / s an der unteren Seite des Injektions Tropfens. Lassen Sie den Embryo durch Anlegen positiver Druck auf die Halte Mikroinjektors. Halten Sie die nicht injizierten Embryonen auf der Oberseite und die injizierten, die auf der unteren Seite des Tropfens zu helfen, den Überblick über die injizierten / nicht injizierten Embryonen und effizienter zu arbeiten. </li></ol> 5. Embryo Recovery and Injection Ergebnisse <ol><li> Machen Sie 3 Tropfen von ca. 200 &amp; mgr; l in einer neuen Schale mit vorgewärmten SOF-HEPES. Sammeln Sie die injizierten Embryonen mit dem Mikrodispenser (wie oben beschrieben). Waschen Sie die injizierten Embryonen, indem sie durch die 3 SOF-HEPES bewegenden Tropfen. </li><li> Zählen Sie die Embryonen während der Mikroinjektions lysiert und verwerfen sie. Hinweis: Ein lysiert Zygote von einem intakten ein leicht unterschieden werden kann, da die erste durchscheinend erscheint, die ganze ZP ausfüllen, und es hat in der Regel zytoplasmatischeGehalt an der Außenseite des Embryos undicht. </li><li> Überprüfen Sie optional die Mikroinjektionseffizienz eines Fluoreszenzmikroskop. Beachten Sie, dass UV-Licht Exposition Embryo Schäden hervorrufen kann, die weitere Entwicklung auswirken können. </li><li> Kulturgruppen von 25 injizierten Embryonen in 50 ul Tropfen Kalium simplex Optimierungsmedium (KSOM) , ergänzt mit 4 mg / ml Rinderserumalbumin (BSA) unter Mineralöl bei 38,5 ° C, 5% CO 2 in Luft und Feuchtigkeit bis zur Sättigung. </li><li> Ergänzen Sie die Kulturmedien mit 5% FBS zwei Tage nach der Injektion. </li><li> Prüfen Blastozyste (BL) Raten von 7 Tagen nach der Injektion. Berechnen BL Raten als Gesamtzahl der Blastozyste Embryonen / Gesamtzahl der Embryonen kultiviert in diesem Tropfen. </li></ol>

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	<li>McEvoy, T., Coull, G., Broadbent, P., Hutchinson, J., Speake, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+composition+of+lipids+in+immature+cattle,+pig+and+sheep+oocytes+with+intact+zona+pellucida.">Fatty acid composition of lipids in immature cattle, pig and sheep oocytes with intact zona pellucida.</a> J Reprod Fertil. 118 (1), 163-170 (2000).</li><li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+efficiency+of+introducing+foreign+DNA+into+mice+by+microinjecting+eggs.">Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (13), 4438-4442 (1985).</li><li>Ross, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parthenogenetic+activation+of+bovine+oocytes+using+bovine+and+murine+phospholipase+C+zeta.">Parthenogenetic activation of bovine oocytes using bovine and murine phospholipase C zeta.</a> BMC Dev Biol. 8 (1), (2008).</li><li>Canovas, J., Cibelli, J. B., Ross, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jumonji+domain-containing+protein+3+regulates+histone+3+lysine+27+methylation+during+bovine+preimplantation+development.">Jumonji domain-containing protein 3 regulates histone 3 lysine 27 methylation during bovine preimplantation development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2400-2405 (2012).</li><li>Bogliotti, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4+Developmental+outcomes+and+effiency+of+two+CRISPR/Cas9+microinjection+methods+in+bovine+zygotes.">4 Developmental outcomes and effiency of two CRISPR/Cas9 microinjection methods in bovine zygotes.</a> Reprod Fertil Dev. 27 (1), 94-94 (2015).</li><li>Bakhtari, A., Ross, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DPPA3+prevents+cytosine+hydroxymethylation+of+the+maternal+pronucleus+and+is+required+for+normal+development+in+bovine+embryos.">DPPA3 prevents cytosine hydroxymethylation of the maternal pronucleus and is required for normal development in bovine embryos.</a> Epigenetics. 9 (9), 1271-1279 (2014).</li><li>Yaul, M., Bhatti, R., Lawrence, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+process+of+polishing+borosilicate+glass+capillaries+used+for+fabrication+of+in-vitro+fertilization+(iVF)+micro-pipettes.">Evaluating the process of polishing borosilicate glass capillaries used for fabrication of in-vitro fertilization (iVF) micro-pipettes.</a> Biomed Microdevices. 10 (1), 123-128 (2008).</li><li>Sutter Instrument. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pipette Cookbook 2015 P-97 &amp; P-1000 Micropipette Pullers. , (2015).</li><li>Sutter Instrument. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> P-97 Flaming/BrownTM Micropipette Puller Operation Manual Rev. 2.30 - DOM (20140825). , (2014).</li><li>Cibelli, J. B., Lanza, R. P., Campbell, K. H. S., West, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of cloning. , (2002).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+reporter+gene+after+microinjection+of+mammalian+artificial+chromosomes+into+pronuclei+of+bovine+zygotes.">Expression of a reporter gene after microinjection of mammalian artificial chromosomes into pronuclei of bovine zygotes.</a> Mol Reprod Dev. 60 (4), 433-438 (2001).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Mikroinjektion von Zygoten ist ein gut eingeführtes Verfahren für Lösungen in Säugetierembryonen einzuführen. Mit einigen Variationen in Abhängigkeit von der Art und dem Ziel des Experiments kann diese Technik allgemein verwendet werden. Wir zeigen, wie intrazytoplasmatischer Mikroinjektions auszuführen unter Verwendung eines Lasers den Eingang eines stumpfen Enden Mikropipette zu unterstützen. Zygotes bestimmter Tierarten (wie Rinder, Schafe und Schwein) haben einen dunklen Zytoplasma, die Visualisierung der In...

Zytoplasmatischen Mikroinjektion von 1-Zelle Embryonen ist eine sehr leistungsfähige Technik. Es kann für die Bereitstellung jede Lösung in den Embryo, beispielsweise verwendet werden, Gen-Knock-outs erzeugen Genfunktion zu untersuchen oder Gen-edited Tiere zu erzeugen. Die meisten landwirtschaftlich relevanten Nutztier Zygoten haben eine sehr hohe Fettsäurezusammensetzung, die ihr Zytoplasma opak und dunkel 1 macht. Sie haben auch eine ziemlich elastische Plasmamembran (PM). Diese Eigenschaften machen die Mikroinjektion unter Verwendung von herkömmlichen pronukleären / Zytoplasma-Injektion wie bei Nagetieren herausfordernd und oft ungenau verwendet. Zytoplasmatischen Mikroinjektions hat Vorteile gegenüber pronukleären Mikroinjektions da es einfacher ist , durchzuführen und verursacht auch weniger Schaden an den injizierten Embryos, in höheren Lebensfähigkeit resultierende 2. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, eine erfolgreiche Methode für die Bereitstellung von Lösungen in das Zytoplasma von landwirtschaftlichen Nutztieren Zygoten zu demonstrieren. Zu können auszuführenzytoplasmatischen Mikroinjektions mit hoher Effizienz auf Nutztieren Embryonen wird ein Laser zur Erzeugung eines Lochs in der Zona pellucida (ZP) und dann eine blunt-end Glasnadel für die Mikroinjektion verwendet. Diese Strategie zielt darauf ab, die mechanische Schäden am Embryo während der Injektion eingeprägt zu reduzieren. Dann Aspiration von zytoplasmatischen Inhalten in der Injektionsnadel erlaubt, effizient und sicher ein Bruch des PM zu gewährleisten, dass die Lösung in das Cytoplasma des Embryos geliefert wird. Diese Technik wurde in Rinderembryonen zu liefern siRNA in die zygotic Zytoplasma 3,4 und erzeugen Mutationen mit Hilfe der Cluster regelmäßig voneinander beabstandete kurze Palindrom Wiederholungen (CRISPR) / CRISPR zugehörige System 9 (Cas9) System 5 bereits erfolgreich eingesetzt. Es ist auch geeignet (mit geringfügigen Modifikationen) bovine Cumulus-umschlossenen Oozyten 6 einzuspritzen. Hier haben wir unsere Injektionsprotokoll liefert einen Farbstoff beschreiben kann, dass anwendbar sein, jede des zu injizierendenired Lösung in die Zygote, und zeigen, dass diese Technik unter Verwendung minimaler Lyse verursacht und beeinflusst nicht die frühe Embryoentwicklung.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="786">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">Micropipette puller</td>
			<td style="width:143px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:119px;">P-97</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:268px;">Glass capillary</td>
			<td style="width:143px;">Sutter instruments</td>
			<td style="width:119px;">B100-75-10</td>
			<td style="width:257px;">These capillaries are used for making the holding and injecting pipettes. Any thick/standard wall borosilicate tubing without filament can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">Microforge</td>
			<td style="width:143px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">MF-9</td>
			<td>Equipped with 10X magnification lense.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:143px;">Nikon/ Narishige</td>
			<td>NT88-V3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:143px;">Nikon</td>
			<td>TE2000-U</td>
			<td style="width:257px;">Equipped with 4x, 20x lenses and with a laser system.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laser</td>
			<td style="width:143px;">Research Instruments</td>
			<td>7-47-500</td>
			<td>Saturn 5 Active laser.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:268px;">Microdispenser</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-105</td>
			<td style="width:257px;">The microdispenser is used to move the embryos. A p10 pipette can also be used but loading as minimal volume as possible.</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:268px;">60mm culture dish</td>
			<td style="width:143px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430166</td>
			<td style="width:257px;">Use the lid of the dish to make the injection plate since they have lower walls and will make positioning and moving of the micropipettes with the micromanipulator easier.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:268px;">35mm culture dish</td>
			<td style="width:143px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430165</td>
			<td style="width:257px;">These dishes are used for culturing the embryos in 50&#956;l drops covered with mineral oil. Alternatively, a 4 well dish can also be used. Regardless of the dish chosen to culture the embryos, they always have to be equilibrated in the incubator for at least 4 hours prior to transfering the embryos to them.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Incubator</td>
			<td style="width:143px;">Sanyo</td>
			<td style="width:119px;">MCO-19AIC</td>
			<td style="width:257px;">Any incubator that can be set to 38.5&#176;C 5% CO2 conditions can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:268px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:143px;">Nikon</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td style="width:257px;">Used for visualizing the embryos in the culture drops and during washes. Any stereomicroscope with a 10x magnification can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Control Unit HT</td>
			<td style="width:143px;">Minitube</td>
			<td>12055/0400</td>
			<td style="width:257px;">Heating system attached to the stereomicroscope.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heated Microscope Stage</td>
			<td style="width:143px;">Minitube</td>
			<td>12055/0003</td>
			<td style="width:257px;">Heating system attached to the stereomicroscope.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">Dextran-Red</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>D1828</td>
			<td>A sterile 10mg/ml solution is used to inject.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:268px;">Mineral Oil</td>
			<td style="width:143px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">M8410</td>
			<td style="width:257px;">Keep the mineral oil at room temperature and&#160; protected from light using foil paper.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:268px;">KSOMaa Evolve Bovine</td>
			<td style="width:143px;">Zenit</td>
			<td style="width:119px;">ZEBV-100</td>
			<td style="width:257px;">Supplemented with 4mg/ml BSA. KSOM plates for embryo culture should be equilibrated in an incubator for at least 4 hours before use.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">FBS</td>
			<td style="width:143px;">Gemini-Bio</td>
			<td style="width:119px;">100-525</td>
			<td>Use a stem-cell qualified FBS.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Zygotes</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;">Zygotes are injected 17-20 hpf and can be in-vitro- or in-vivo-derived.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">NaCl</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S5886</td>
			<td style="width:257px;">Final concentration: 107.7mM. Component of SOF-HEPES medium.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">KCl</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5405</td>
			<td style="width:257px;">Final concentration: 7.16mM. Component of SOF-HEPES medium.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5655</td>
			<td style="width:257px;">Final concentration: 1.19mM. Component of SOF-HEPES medium.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">MgCL2 6H2O</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M2393</td>
			<td style="width:257px;">Final concentration: 0.49mM. Component of SOF-HEPES medium.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Sodium DL-lactate</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L4263</td>
			<td style="width:257px;">Final concentration: 5.3mM. Component of SOF-HEPES medium.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">CaCl2-2H2O&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C7902</td>
			<td style="width:257px;">Final concentration: 1.71mM. Component of SOF-HEPES medium.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">D-(&#8722;)-Fructose&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F3510</td>
			<td style="width:257px;">Final concentration: 0.5mM. Component of SOF-HEPES medium.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">HEPES&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H4034</td>
			<td style="width:257px;">Final concentration: 21mM. Component of SOF-HEPES medium.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">MEM-NEAA</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M7145</td>
			<td style="width:257px;">Final concentration: 1X. Component of SOF-HEPES medium.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">BME-EAA</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B6766</td>
			<td style="width:257px;">Final concentration: 1X. Component of SOF-HEPES medium.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S5761</td>
			<td style="width:257px;">Final concentration: 4mM. Component of SOF-HEPES medium.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4562</td>
			<td style="width:257px;">Final concentration: 0.33mM. Component of SOF-HEPES medium.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Glutamax</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">35050</td>
			<td style="width:257px;">Final concentration: 1mM. Component of SOF-HEPES medium.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">BSA</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A-3311</td>
			<td style="width:257px;">Final concentration: 1mg/ml. Component of SOF-HEPES medium.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G-1397</td>
			<td style="width:257px;">Final concentration: 5&#956;g/ml. Component of SOF-HEPES medium.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">Water for embryo transfer</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">W1503</td>
			<td style="width:257px;">Component of SOF-HEPES medium.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:268px;">SOF-HEPES medium</td>
			<td style="width:143px;">Made in the lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;">pH 7.3-7.4, 280&#177;10 mOs. Filter sterilized through a 22&#956;m filter can be stored in the fridge at 4&#176; C for 1 month. Warm in 37 &#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-assisted cytoplasmic microinjection in livestock zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

Laser-assisted cytoplasmatische Mikroinjektions ist ein leistungsfähiges und zuverlässiges Protokoll - Lösungen in das Zytoplasma der tierischen Zygoten zu liefern. 3 zeigt eine allgemeine Übersicht der Zygoten vor und nach der Injektion sowie die Gesamt Umriß der Technik. Dextran-Rot wird als Injektion Lösung verwendet, um Tracking-Seite von Spritzgieß- und Effizienz und Genauigkeit ermöglichen. Erfolgreiche Lieferung der Lösung ist in Figur 4 ...

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Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

Lasergestützte Zytoplasmatischen Mikroinjektions in Vieh Zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

8.9K Aufrufe.  University of California, Davis. This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

Serie: Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend diseases related to pregnancy. In this protocol, human primary villous cytotrophoblasts freshly isolated from placentas through a standard DNase/trypsin protocol are microporated with small interfering RNA (siRNA). This approach provided greater efficiency for siRNA transfection when compared to a lipofection-based method. Transfected cells can subsequently be analyzed by standard Western blot within a time frame of 3-4 days post-transfection. In addition, using cultured primary villous cytotrophoblasts, Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) analysis was optimized and performed on extracts from days 1 to 4. The use of these cultured primary cells and the protocol described allow for an evaluation of the implication of specific genes and transcription factors in the process of villous cytotrophoblast differentiation into a syncytiotrophoblast-like cell layer. However, the limited time span allowable in culture precludes the use of methods requiring more time, such as generation of a stable cell population. Therefore testing of this cell population requires highly optimized gene transfer protocols.

This protocol describes a method for efficiently transfecting siRNA in freshly isolated human villous cytotrophoblasts using microporation and identifying DNA-protein complexes in these cells. Transfected cells can be monitored by Western blot and EMSA analyses during the 4-day culture time.

siRNA-Transfektion und EMSA-Analysen auf frisch isolierten menschlichen Villöse Cytotrophoblasten

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Forschung

Genetik

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Lieferung von Nukleinsäuren durch Embryomikroinjektion in der weltweiten Agrar Pest Insekt,<em&gt; Mittelmeerfruchtfliege</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

Optogenetische Zufallsmutagenese Mit Histon-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

Zucht- und RNA-vermittelte Gene Knockdown in der ausblenden Doppelstrang-Käfer,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene function. Gene knockout has been used to study these gene functions in vivo. The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system is a powerful tool used to edit genomic DNA sequences to alter gene function. While the traditional approach has been to introduce CRISPR/Cas9 mRNA into the single cell embryos through microinjection, this can be a slow and inefficient process in catfish. Here, a detailed protocol for microinjection of channel catfish embryos with CRISPR/Cas9 protein is described. Briefly, eggs and sperm were collected and then artificial fertilization performed. Fertilized eggs were transferred to a Petri dish containing Holtfreter's solution. Injection volume was calibrated and then guide RNAs/Cas9 targeting the toll/interleukin 1 receptor domain-containing adapter molecule (TICAM 1) gene and rhamnose binding lectin (RBL) gene were microinjected into the yolk of one-cell embryos. The gene knockout was successful as indels were confirmed by DNA sequencing. The predicted protein sequence alterations due to these mutations included frameshift and truncated protein due to premature stop codons.

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

A simple and efficient microinjection protocol for gene editing in channel catfish embryos using the CRISPR/Cas9 system is presented. In this protocol, guide RNAs and Cas9 protein were microinjected into the yolk of one-cell embryos. This protocol has been validated by knocking out two channel catfish immune-related genes.

Mikroinjektion CRISPR/Cas9 Protein in Channel Catfish, Ictalurus Punctatus, Embryonen für Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

Embryo Mikroinjektion und Transplantation Technik für Nasonia Vitripennis Genom Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene expression, but whether looping is responsible for or a result of alterations in gene expression is still unknown. Until recently, how chromatin looping affects the regulation of gene activity and cellular function has been relatively ambiguous, and limitations in existing methods to manipulate these structures prevented in-depth exploration of these interactions. To resolve this uncertainty, we engineered a method for selective and reversible chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9). The dynamism of the CLOuD9 system has been demonstrated by successful localization of CLOuD9 constructs to target genomic loci to modulate local chromatin conformation. Importantly, the ability to reverse the induced contact and restore the endogenous chromatin conformation has also been confirmed. Modulation of gene expression with this method establishes the capacity to regulate cellular gene expression and underscores the great potential for applications of this technology in creating stable de novo chromatin loops that markedly affect gene expression in the contexts of cancer and development.

Chromatin looping plays a significant role in gene regulation; however, there have been no technological advances that allow for selective and reversible modification of chromatin loops. Here we describe a powerful system for chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9), demonstrated to selectively and reversibly modulate gene expression at targeted loci.

CRISPR-vermittelten Reorganisation der Chromatinstruktur mit Schleife

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives each year. Effective treatment options able to halt disease progression are lacking. Despite the extensive sequencing efforts in large patient populations, the majority of ALS and PD cases remain unexplained by genetic mutations alone. Epigenetics mechanisms, such as the post-translational modification of histone proteins, may be involved in neurodegenerative disease etiology and progression and lead to new targets for pharmaceutical intervention. Mammalian in vivo and in vitro models of ALS and PD are costly and often require prolonged and laborious experimental protocols. Here, we outline a practical, fast, and cost-effective approach to determining genome-wide alterations in histone modification levels using Saccharomyces cerevisiae as a model system. This protocol allows for comprehensive investigations into epigenetic changes connected to neurodegenerative proteinopathies that corroborate previous findings in different model systems while significantly expanding our knowledge of the neurodegenerative disease epigenome.

This protocol outlines experimental procedures to characterize genome-wide changes in the levels of histone post-translational modifications (PTM) occurring in connection with the overexpression of proteins associated with ALS and Parkinson&#39;s disease in Saccharomyces cerevisiae models. After SDS-PAGE separation, individual histone PTM levels are detected with modification-specific antibodies via Western blotting.

Charakterisierung von Histon Post-translationale Modifikation Veränderungen in Hefe Neurodegenerative Proteinopathy Modelle

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant viruses they vector. Despite numerous studies of the biology of these species in different environments, a key life history parameter, offspring sex ratios, has received little attention, yet is important for predicting population dynamics. The primary sex ratio (sex ratio at oviposition) of Bemisia tabaci has never been reported but can be found by determining the egg fertilization rate of this haplodiploid insect. The technique involves the dechorionation of eggs with bleach, a series of fixation steps, and the application of the general DNA fluorescent stain, DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole, a DNA-binding fluorescent dye), to bind to female and male pronuclei. Here, we present the technique, and an example of its application, to test whether an endosymbiotic bacterium, Rickettsia sp. nr. bellii, influenced the primary sex ratio of B. tabaci. This method may assist in population studies of whiteflies, or in determining if sex allocation exists with certain environmental stimuli.

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

We present a simple cytogenetic technique using 4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) to determine the fertilization rate and primary sex ratio of the haplodiploid invasive pest Bemisia tabaci.

Festsetzung des Ei Befruchtung Tabak Tabaci mit einer zytogenetischen Technik

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding sites for transcriptional regulators to modulate gene expression. Alterations of CREs have been implicated in various diseases including cancer. While promoters and enhancers have been the primary CREs for studying gene regulation, very little is known about the role of silencer, which is another type of CRE that mediates gene repression. Originally identified as an adaptive immunity system in prokaryotes, CRISPR/Cas9 has been exploited to be a powerful tool for eukaryotic genome editing. Here, we present the use of this technique to delete an intronic silencer in the human RUNX1 gene and investigate the impacts on gene expression in OCI-AML3 leukemic cells. Our approach relies on electroporation-mediated delivery of two preassembled Cas9/guide RNA (gRNA) ribonucleoprotein (RNP) complexes to create two double-strand breaks (DSBs) that flank the silencer. Deletions can be readily screened by fragment analysis. Expression analyses of different mRNAs transcribed from alternative promoters help evaluate promoter-dependent effects. This strategy can be used to study other CREs and is particularly suitable for hematopoietic cells, which are often difficult to transfect with plasmid-based methods. The use of a plasmid- and virus-free strategy allows simple and fast assessments of gene regulatory functions.

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Direct delivery of preassembled Cas9/guide RNA ribonucleoprotein complexes is a fast and efficient means for genome editing in hematopoietic cells. Here, we utilize this approach to delete a RUNX1 intronic silencer and examine the transcriptional responses in OCI-AML3 leukemic cells.

Untersuchung der Transkriptionsrolle eines RUNX1 Intronic Schalldämpfers durch CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in akuten myeloischen Leukämiezellen

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...